CN110541041B - 与中国家马矮小性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与中国家马矮小性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第501位，多态性为G/A，对应于马第8号染色体第18205998碱基对。本发明的与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其应用具有如下优点：(1)该分子标记不受中国家马的年龄、性别等限制，可用于中国家马的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国家马优势矮马品种的育种进程；(2)检出中国家马TBX3基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便；(3)中国家马TBX3基因的SNP位点的检出，为中国家马的身高大小的标记辅助选择及马的育种工作提供了科学依据。

Description

与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于遗传生物学领域，具体涉及与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其应用。

背景技术

SNP单核苷酸多态性位点主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、插入和缺失等。

SNP的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA芯片、飞行时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。

转录因子TBX3(T-Box transcription factor 3)是调控生长发育关键基因之一，它广泛的存在于胚胎组织中，在胚胎干细胞、心脏传导系统的发育中起重要作用。它的缺失或突变会引起尺骨-乳腺综合症。在中国德保矮马、伊犁马和蒙古马群体中进行全基因组关联分析和全基因组选择信号筛选，发现TBX3基因座位的多态性变异对中国家马的体尺性状的影响达到显著水平。

矮马个体矮小而灵活，脾气温顺，特别适合作为青少年马术教学用马。随着青少年马术俱乐部在全国各地的快速发展，矮马在文化教育产业的经济前景不可估量，然而，目前国内马术俱乐部全部依赖进口矮马，每匹引入成本约5万元人民币。然而国产矮马由于选育程度低，育种标记缺乏，开发利用程度低，都导致了我国矮马资源优势无法转化为经济优势。目前国外已经通过全基因组扫描定位到HMGA2等影响矮马体尺性状的基因位点，然而前期研究也表明国内外矮马具有各自独立的形成机制，因此，有必要开发国内矮马特异的分子标记，应用于国内矮马的选育。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种辅助鉴定中国家马矮小性状的SNP标记及其应用。

本发明的另一个目的是提供用于检测与中国家马矮小性状相关的SNP标记的引物及含有该引物的试剂盒。

为了实现本发明的第一个目的，本发明提供了一种与中国家马矮小性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于马第8号染色体第18205998碱基对(gi 194246389:18205498-18206498Equus caballus isolate Twilight breed thoroughbred chromosome 8,EquCab2.0,whole genome shotgun sequence)。

发明人对来自不同地区和品种的中国家马马匹进行了大量的基因型与身高表型相关性研究，发现本发明所提供的SNP位点与家马身高显著关联(卡方检验P值<2.2e-16)。等位基因A在矮马中的频率高达64.07％，而在普通马中等位基因G的频率为82.14％。基因型AA在矮马中频率为65.95％，在普通马中为17.85％，基因型为AA的马匹的平均身高显著矮于基因型为GG的马匹(卡方检验P值<2.2e-16)，对于通过基因型区分和筛选出矮小性状的中国家马具有较大的指导意义，当中国家马的基因型为AA时可以判定马匹具有矮小性状，当中国家马的基因型为GG为时可以判定马匹具有高大性状，可以提高家马身高筛选的准确率和效率。

本发明中，对矮马身高的界定与国际上通行的对矮马的身高界定相同，即马背的高度低于106厘米的属于矮马，高于或等于106厘米的属于高马。

进而本发明提供了与中国家马矮小性状相关的SNP分子标记，所述SNP标记位于SEQ ID NO.1所示序列的第501位，多态性为G/A，对应于马第8号染色体第18205998碱基对。

本发明的SNP分子标记可通过以下引物扩增得到：

引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG,(SEQ ID NO.2)

引物2:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA，(SEQ ID NO.3)

引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA(SEQ ID NO.4)；在使用时，引物1和引物2分别标记不同颜色的荧光标记基团。

本发明还提供了用于检测本发明所述SNP标记的特异性引物组合，包括：

引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG,

引物2:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA，

引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA。

含有上述特异性引物组合的试剂盒或试剂属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述SNP分子标记或上述特异性引物组合或含有该引物组合的试剂盒或试剂在鉴定矮小中国家马品种中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记或上述特异性引物组合或含有该引物组合的试剂盒或试剂在中国家马分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记或上述特异性引物组合或含有该引物组合的试剂盒或试剂在中国家马种质资源改良中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记或上述特异性引物组合或含有该引物组合的试剂盒或试剂在中国家马分类和育种研究中的应用。

与中国家马矮小性状相关的SNP标记在中国家马分子标记辅助育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种鉴定具有矮小性状中国家马的方法，包括以下步骤：

1)提取待测马匹的基因组DNA；

2)以待测马匹的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；

3)检测PCR扩增产物片段的第501bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则判定待测马匹具有矮小性状，若碱基种类为G，则判定待测马匹具有高大性状；即在检测中有引物1标记基团荧光的个体基因型为AA，有引物2标记基团荧光的个体基因型为GG；引物1和引物2的标记基团荧光均存在的为AG。

其中，所述特异性引物包括：

引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG,

引物2:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA，

引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA。

本发明的方法中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以5μl计为：50-100ng/μl模板DNA 2.43μl，KASP Master Mix 2.5μl，KASP Assay Mix 0.07μl。

本发明的上述方法中，步骤2)中PCR反应的条件为：第一步:94℃,15min；第二步:94℃,20s,61～55℃,1min,每个循环降低0.6℃,共进行10个循环；第三步:94℃,20s,55℃,1min,共进行26个循环。

本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行，优选的，可以利用飞行时间质谱方法来检测待测中国家马的基因型。

本发明的与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其应用具有如下优点：

(1)本发明提供的分子标记不受中国家马的年龄、性别等限制，可用于中国家马的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国家马优势矮马品种的育种进程。

(2)检出中国家马TBX3基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便。

(3)中国家马TBX3基因的SNP位点的检出，为中国家马的身高大小的标记辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1为三种基因型的飞行时间质谱SNP分型聚类分析图；其中，Allele Y轴表示GG基因型个体；Allele X轴表示AA基因型个体；Both表示AG基因型个体；“X”表示个体未检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1中国家马TBX3基因多态性位点的鉴定

1、提取待测中国家马血液中的基因组DNA

采集来自中国西南地区210匹矮马(包括19匹来自德保、34匹来自百色、35匹来自文山、20匹来自云南、15匹来自利川、32匹来自晋江、30匹来自建昌、25匹来自贵州)和308匹正常体高的马(包括145匹来自西北，128匹来自内蒙古，24匹来自东北，11匹纯血马)的血样，以及11匹普氏野马的血样。一共是21个群体529个个体。采用常规的方法提取血液中的基因组DNA。

表1样品采集表

2、扩增含SNP位点的核苷酸片段

根据NCBI数据库收录的TBX3基因座位(gi 194246389:18100500-18101500Equuscaballus isolate Twilight breed thoroughbred chromosome 8,EquCab2.0,wholegenome shotgun sequence)的序列设计引物，包括引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG(SEQ IDNO.2),引物2:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA(SEQ ID NO.3)和引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA(SEQ ID NO.4)。

以步骤1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ IDNO.1所示。该SNP位点位于PCR扩增片段的501bp处，此处碱基为A或G。

其中PCR反应使用的扩增体系以5μl计为：50-100ng/μl模板DNA 2.43μl，2×KASPMaster Mix 2.5.0μl，KASP Assay Mix(引物混合工作液)0.07μl。

其中，步骤2)中PCR反应的条件为：第一步:94℃,15min；第二步:94℃,20s,61～55℃,1min,每个循环降低0.6℃,共进行10个循环；第三步:94℃,20s,55℃,1min,共进行26个循环。

3、检测PCR扩增片段，获得SNP标记

对步骤2中的PCR扩增产物进行测序检测，如果扩增产物序列中第501bp处的碱基为A，则待测中国家马属于优势矮马品种。三种基因型的飞行时间质谱SNP分型聚类分析图如图1所示。

4、基因型判定

通过飞行时间质谱的分析方法对待测中国家马的基因型进行检测；根据飞行时间质谱的结果判定SNP位点在待测群体中的基因型。根据样品的信号分布位置，基因型可分为AA型，GG型和AG型。三种基因型的分型结果如图1所示。

实施例2中国家马不同基因型与身高大小的关联分析与检测应用

本发明对来自不同地区和品种的中国家马马匹进行了大量的基因型与身高表型相关性研究，发现本发明所提供的SNP位点(位于SEQ ID NO.1所示序列的第501位，多态性为G/A，对应于马第8号染色体第18205998碱基对)与家马身高显著关联(卡方检验P值<2.2e-16)。等位基因A在矮马中的频率高达64.07％，而在普通马中等位基因G的频率为82.14％。基因型AA在矮马中频率为65.95％，在普通马中为17.85％，基因型为AA的马匹的平均身高显著矮于基因型为GG的马匹(卡方检验P值<2.2e-16)，对于通过基因型区分和筛选出矮小性状的中国家马具有较大的指导意义，当中国家马的基因型为AA时可以判定马匹具有矮小性状，当中国家马的基因型为GG为时可以判定马匹具有高大性状，可以提高家马身高筛选的准确率和效率。

实施例3

对529匹中国家马的TBX3基因座位的多态性位点进行扩大群体分析。运用R软件的卡方检验进行分析，上述SNP位点(位于SEQ ID NO.1所示序列的第501位，多态性为G/A，对应于马第8号染色体第18205998碱基对)在矮马中的等位基因A的频率显著高于在其他普通身高马匹(非矮马)中的等位基因A的频率(P<2.2e-16)。进一步验证了该处SNP位点的等位基因A与中国家马的矮小性状的相关性(如表2所示)。

表2 SNP位点在中国矮马与普通马品种中的基因型数目

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其应用

<130> KHP191114253.7

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctctcgaat cccaaatgtg gatccttctc ccgcgcgtaa agcagcgtct gtcggactct 60

gcccaggggc aggctcatcc gctgtttcct gcctgtcttt tgtacagcga gaagcgggga 120

gagagaagat agaggggatc tgcgaagagg aaaaaaaaaa aaaaaagacc gtgtagagcc 180

cgcggctgga gactaaagcc ctggcctgga gcgcgcaagc cttgtgggtt cccgcggcgg 240

ccaggcctgg cacaagtctt cagaacacgc tagccaatgt ttaactcgca tgcagtggcc 300

accaggccgc ttttgtttgt tcgcaaatta atcacccagc gcacggccgg cgccagagtg 360

ggtttatcac ccaccgggag gggggcgcgg cggcctagca gagacaaaga ggagttcgca 420

cctttccgct tttgatccca agttaccgcg gcctccctgc ataatacgag tctcctgggg 480

ccgagtctgg gaggtcagtc gtaattggcg gaagtttgca gaccattagc aagatgtcga 540

cattttcgat tcagaacccc gcaaactttc ctctcccccg cctccttgcg cgctggagta 600

ggagtgaggg tcaagagtgg caactggggt gaccccaggg ttaagtcaga actacgggca 660

aaaataggcg catagggacg agggggcagt gtgaggggca gaaatcacgc tcagtccacg 720

gtggggccaa aggcgagtgg acgtatttac aagtacagta aaatcagcga gcctcccttc 780

cgtgtcctaa acaaaaggga gggcacaatg cagaggcgcg agtaaaacgt ctctctccag 840

cgcgtctgga tgcttggggc accgagtggg tgaggagggg gtcagtcaca ctgtggttac 900

agaattactt cgcttccact cggagcggcg tggcagagac tggcggcgac tgcaggcaaa 960

accaggtcgc cgggtttggg gccgctcctg aaagcgcagc g 1001

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgagtctgg gaggtcagtc g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgagtctgg gaggtcagtc a 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtctgcaaac ttccgccaat ta 22

Claims (6)

1.一种特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒或试剂在鉴定矮小中国家马品种中的应用；所述特异性引物组合包括：

引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG；

引物2CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA；

引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA。

2.一种特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒或试剂在中国家马分子标记辅助育种中的应用；所述特异性引物组合包括：

引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG；

引物2CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA；

引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA。

3.一种特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒或试剂在中国家马种质资源改良中的应用；所述特异性引物组合包括：

引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG；

引物2CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA；

引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA。

4.一种鉴定具有矮小性状中国家马的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测马匹的基因组DNA；

2)以待测马匹的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；

3)检测PCR扩增产物片段的第501bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则判定待测马匹具有矮小性状，若碱基种类为G，则判定待测马匹具有高大性状；即在检测中有引物1标记基团荧光的个体基因型为AA，有引物2标记基团荧光的个体基因型为GG；

其中，所述特异性引物包括：

引物1:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCG,

引物2:CCGAGTCTGGGAGGTCAGTCA，

引物3:GTCTGCAAACTTCCGCCAATTA；引物1和引物2标记不同颜色的荧光基团。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以5μl计为：50-100ng/μl模板DNA 2.43μl，KASP Master Mix 2.5μl，KASP Assay Mix 0.07μl。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应的条件为：第一步:94℃,15min；第二步:94℃,20s,61～55℃,1min,每个循环降低0.6℃,共进行10个循环；第三步:94℃,20s,55℃,1min,共进行26个循环。

Images