CN109706231B - 一种用于凡纳滨对虾分子育种的高通量snp分型方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于凡纳滨对虾分子育种的高通量SNP分型方法，具体地，利用所构建的2个凡纳滨对虾多重PCR扩增体系，可以同时扩增508个在基因组上均匀分布的DNA片段，之后对上述DNA片段进行高通量测序和生物信息学分析，能够同时实现大约1000个SNP位点的高效分型；本发明还提供了上述高通量SNP分型体系在凡纳滨对虾遗传分析中的应用。本发明提供的凡纳滨对虾高通量分型体系具有准确率高、分型效率高、成本低的特点，且获得的SNP具有基因组覆盖均匀、与经济性状关联性高等特点，可以广泛应用于凡纳滨对虾鉴定、性状关联分析和分子育种等。

Description

一种用于凡纳滨对虾分子育种的高通量SNP分型方法

技术领域

本发明属于水产动物分子育种领域，具体涉及一种用于凡纳滨对虾遗传分析的高通量SNP分型方法及应用。

背景技术

分子育种技术包括标记辅助选育(MAS)、基因辅助选育(GAS)、全基因组选择(GS)和基因编辑育种。相较于传统数量遗传育种方法，分子育种技术具有精准、高效的特点，能够针对性地快速改良目标经济性状，可以显著加快遗传育种进度。分子标记辅助选育是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记来辅助目标性状的选育，基因辅助选育和全基因组选择是分子标记辅助选育的扩展，指通过利用性状相关的基因和覆盖全基因组的分子标记来进行遗传育种。因此分子标记的开发是标记辅助育种、基因辅助选育和全基因组选育的基础。

分子标记技术经历了第一代RFLP、AFLP、RAPD等，第二代SSR到第三代SNP、Indel的发展过程，目前在动植物遗传育种中广泛使用的分子标记是SNP标记。SNP标记具有分布广泛、易于高通量分型的优势。针对模式生物和高等动植物，研究人员研发了一系列用于高通量SNP分型的方法，包括SNP芯片、高通测序分型等。然而对于水产动物，尤其是对虾，目前尚缺乏用于分子育种的高通量SNP分型方法。虽然，在前期，通过简化基因组测序，实现了对虾高通量SNP分型，但是该方法无法实现对某些感兴趣的关键基因和特异性位点的分型，分析的针对性不强，且价格偏高，不适合在育种中大规模应用。因此开发适合对虾的低成本高通量SNP分型方法，对于对虾分子育种工作的开展，加快良种的培育具有重要的意义。

本发明旨在提供一种适合凡纳滨对虾分子育种的高通量SNP分型方法，该方法可以实现在基因组中均匀分布的SNP标记的高通量分型，同时能够实现与生长、性别、抗病性相关的SNP标记以及大量免疫相关基因的分型。本方法成本低、准确率高、适应性好，能够加快对虾分子育种工作的开展。

发明内容

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于凡纳滨对虾分子育种的高通量SNP分型方法，所述的SNP分型方法包括通过两个多重PCR扩增体系同时扩增凡纳滨对虾508个DNA片段，之后通过高通量测序和生物信息学分析实现目标片段中的SNP分型，可以同时实现凡纳滨对虾900-1300个SNP位点分型。

本发明同时提供了高通量分型方法的建立方法：用于进行高通量分型的DNA片段分为两类，第一类扩增片段是由基因组均匀分布的片段组成，利用构建的高密度遗传连锁图谱，平均10cM选择1个DNA片段，确保整个染色体的全部覆盖；第二类扩增片段是由已知与生长、性别、抗WSSV性状紧密连锁的分子标记和基因组成，实现已有性状相关标记的覆盖。进一步地，两类片段通过多重PCR扩增在线软件设计多重PCR扩增引物，初步共设计581个扩增片段。上述片段的扩增体系为：DNA模板1μl(50ng/μl),体系1或体系2引物混池2μl，5×VAHTS Multi-PCR Mix 4μl，超纯水13μl。PCR扩增条件为：99℃2分钟，之后进入下列循环：99℃15s，60℃4min进行20个循环，最后72℃10分钟。进一步将扩增产物混合后建立高通量测序文库，通过Illumina Hiseq4000进行高通量测序，测序数据经过过滤后使用BWA比对对虾基因组参考序列后通过GATK软件进行SNP分型。根据上述581个片段在每个个体中的扩增深度和SNP数目，对扩增体系进行优化，去掉扩增不均匀的片段，最终筛选获得优化后的体系，该体系包含508个DNA片段，由两个扩增体系组成，扩增体系1由引物SEQ ID001-ID520组成，引物体系2由引物SEQID521-1016组成，扩增引物池内的引物等量混合组成各个引物池。

通过使用上述优化后的体系对凡纳滨对虾个体DNA进行多重PCR扩增，进一步建立高通量测序文库并进行高通量测序，利用生物信息软件BWA和GATK能够实现个体目标片段的DNA分型。

本发明还提供了上述高通量SNP分型体系在凡纳滨对虾遗传分析中的应用。本发明提供的凡纳滨对虾高通量分型体系具有准确率高、分型效率高、成本低的特点，且获得的SNP具有基因组覆盖均匀、与经济性状关联性高等特点，可以广泛应用于凡纳滨对虾鉴定、性状关联分析和分子育种等。

本发明所具有的优点：

(1)本发明所提供的SNP分型方法，实现了基因组上均匀分布标记和性状相关标记的高通量分型，为分子育种提供了有效的技术手段。

(2)本发明所建立的凡纳滨对虾高通量分型方法成本低、准确率高、适应性好，适合大量育种群体的高通量分型。

附图说明

图1高通量SNP分型方法用于个体亲缘关系分析。a：10个个体的PCA分析结果；b：10个个体的Neighbor-joining聚类分析结果。

具体实施方式

实施例1：凡纳滨对虾高通量SNP分型方法的建立

(1)分型DNA片段筛选

所选择的扩增DNA片段分成两类，第一类扩增片段是由基因组均匀分布的片段组成，利用构建的高密度遗传连锁图谱(Yu等，Genome survey and high-density geneticmap construction provide genomic and genetic resources for the Pacific WhiteShrimp Litopenaeus vannamei.Scientific Reports.2015,5:15612)，平均10cM选择1个DNA片段，确保标记在整个染色体上的全部覆盖；第二类扩增片段是由已知与生长、性别、抗WSSV性状紧密连锁的分子标记和基因组成，实现已有性状相关标记的覆盖。

(2)多重PCR扩增引物设计

将筛选出的DNA片段通过Ampliseq在线引物设计系统设计多重PCR扩增引物，共设计了581个扩增子(如表2和表3所示)，包含两个扩增体系，第一个扩增体系包含306个扩增子，对应表2中的SEQ ID001-ID520和表3中的SEQ ID1017-ID1108，第二个扩增体系包含275个扩增子，对应表2中的SEQ ID521-ID1106和表3中的SEQ ID 1109-ID1164，合成581个扩增子的引物序列，每个扩增体系内的引物等量混合分别组成两个引物池。

(3)目标区域多重PCR扩增

选择9个不同来源的凡纳滨对虾样品，提取肌肉组织的DNA(1-9)，每个DNA浓度为50ng/μl，另外，将1-9号样品的DNA等体积量混合后构建10号样品，利用构建的两个引物混池分别进行多重PCR扩增，扩增体系如下：：DNA模板1μl(50ng/μl),体系1或体系2引物混池2μl，5×VAHTS Multi-PCR Mix 4μl，超纯水13μl。PCR扩增条件为：99℃2分钟，之后进入下列循环：99℃15s，60℃4min进行20个循环，最后72℃10分钟。

(4)高通量测序文库构建和高通量测序

文库构建的方法参考诺唯赞试剂盒NA201-VAHTS AmpliSeq Library Prep KitV2。构建的高通量测序文库经过质检后通过Illumina X ten进行高通量测序，每个个体测序数据量125M，对应的测序深度1000X。

(5)高通量SNP分型

获得的高通量测序原始数据进行数据过滤并分拆获得每个个体的测序数据，测序数据通过BWA软件比对对虾基因组，通过GATK软件获得每个个体的SNP分型数据。每个获得的SNP数目如表1所示。1-9号样品获得的SNP数目在900-1300个左右，10号样品由于是混合样品，所以获得的SNP数目较多。

表1.通过分型体系获得的每个个体SNP数目

(6)对虾高通量SNP分型体系优化

进一步，去掉每个扩增片段的平均测序深度低于4和高于300的位点，去掉个体分型率低于80％的位点，去掉SNP位点数目低于2的位点，通过上述优化，去掉的序列如表格3中的SEQID1017-ID1164所示，最终筛选保留表格2中508个扩增均匀且SNP数目较多的片段。优化后的高通量分型体系如下：分型体系1包含260个扩增子，其引物序列为SEQ ID 0001～ID 0520，其中SEQ ID 0001和SEQ ID 0002是一对引物组合，其他引物组合以此类推；体系2包含248个扩增子，其引物序列为SEQ ID 521～ID1016。

实施例2：凡纳滨对虾高通量SNP分型方法在分子育种中的应用

本实施例以凡纳滨对虾高通量SNP分型方法用于10个个体亲缘关系分析的示例，来说明该方法在分子育种中的应用，本分型方法并不局限于个体亲缘关系分析，可以用于分子育种的各个方面。

(1)凡纳滨对虾个体DNA提取和多重PCR扩增

使用天根植物基因组DNA提取试剂盒分别提取凡纳滨对虾10个肌肉组织的DNA，DNA使用Nanodrop测定核酸浓度后稀释至50ng/μl。之后使用扩增体系1(SEQ ID 0001～ID0520)和扩增体系2(SEQ ID 521～ID1016))对待分析的个体DNA进行多重PCR扩增，扩增体系为：DNA模板1μl(50ng/μl),体系1或体系2引物混池2μl，5×VAHTS Multi-PCR Mix 4μl，超纯水13μl。PCR扩增条件为：99℃2分钟，之后进入下列循环：99℃15s，60℃4min进行20个循环，最后72℃10分钟。

(2)高通量测序文库构建和测序

文库构建的方法参考诺唯赞试剂盒NA201-VAHTS AmpliSeq Library Prep KitV2。构建的高通量测序文库经过质检后通过Illumina X ten进行高通量测序，每个个体测序数据量125M，对应的测序深度1000X。

(3)高通量SNP分型

获得的高通量测序原始数据进行数据过滤并分拆获得每个个体的测序数据，测序数据通过BWA软件比对对虾基因组，通过GATK软件获得每个个体的SNP分型数据。

(4)个体亲缘关系分析

SNP分型数据通过plink软件进行格式转换，之后使用gcta软件进行PCA分析，并通过R软件绘制个体之间PCA关系图，进一步的SNP数据使用treebest软件构建个体之间的亲缘关系树(图1)。从而获得个体之间的亲缘关系。

图1高通量SNP分型方法用于个体亲缘关系分析。a：10个个体的PCA分析结果；b：10个个体的Neighbor-joining聚类分析结果。结果均显示个体1和2的关系较近，3和4的关系较近，5和6的关系较近，8和9的关系较近。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

表2：优化后的扩增体系的引物序列

表3：从最初扩增体系中删除掉的引物序列

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种用于凡纳滨对虾分子育种的高通量SNP分型方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaataacggt ctcttattgt ggcagt 26

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcaagacag gttagcactt tgat 24

Claims (4)

1.一种用于凡纳滨对虾分子育种的高通量SNP分型方法，其特征在于：所述的SNP分型方法包括通过两个多重PCR扩增体系同时扩增凡纳滨对虾508个DNA片段，之后通过高通量测序和生物信息学分析实现目标片段中的SNP分型，可以同时实现凡纳滨对虾900-1300个SNP位点分型；

所述的两个多重PCR扩增体系，其体系1包含260个扩增子，其引物序列为序列表中SEQID 0001~ID 0520；

体系2包含248个扩增子，其引物序列为序列表中SEQ ID 0521~ID1016；

体系1和体系2中引物组合为n与n+1为一对引物对，n为0001~1016之间的奇数，即序列表中奇数引物序列与其后偶数引物序列为一对引物对。

2.按照权利要求1所述的分型方法，其特征在于：

两个多重PCR扩增体系分别为：浓度为50 ng/μl的凡纳滨对虾DNA模板1 μl，体系1或体系2引物混池 2μl，5 × VAHTS Multi-PCR Mix 4μl，超纯水13μl；

PCR扩增条件为：99℃ 2分钟，之后进入下列循环：99℃15 s，60℃4 min进行20个循环，最后72℃ 10 分钟。

3.按照权利要求1所述的分型方法，其特征在于：高通量测序和生物信息学分析进行SNP分型的方法，包括上述扩增产物混合后建立高通量测序文库，通过Illumina Hiseq4000进行高通量测序，测序数据经过过滤后使用BWA和GATK进行SNP分型。

4.按照权利要求1-3任一所述的分型方法，其特征在于：所述获得的凡纳滨对虾遗传分析的高通量SNP分型数据可应用在凡纳滨对虾品种鉴定、性状关联分析和分子育种的任一或二种以上过程中。

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