KR102062452B1 - 터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 - Google Patents

터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 차세대시퀀싱(NGS) 기반으로 터봇 개체의 SSR 부위를 찾아내고 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하여 해당 마커를 통해 유전형을 분석하고 터봇 친자관계 및 혈연 관계의 식별이 가능한 터봇 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법을 제공함으로써, 차세대 시퀀싱을 기반으로 개발한 마커의 부위는 변별력이 높고 증폭율이 우수한 마커로서, 해당 마커를 이용하여 유전자형을 분석할 시 친자확인을 위한 기초데이터 생산과 더불어, 보다 높은 친자감별이 가능한 효과가 있다.

Description

터봇 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법 {Genetic maker for parentage and thereod in Turbot}
본 발명은 유럽산 가자미의 일종인 터봇을 개발한 유전자 마커를 통해 유전자형을 분석하고, 친자관계를 빠르고 쉽게 알 수 있도록 것으로, 터봇 개체의 SSR 부위를 찾아내고 동시에 증폭할 수 있는 마커를 개발하므로 해당 마커를 통해 유전형을 분석하고 터봇 친자관계를 찾아낼 수 있는 유전자 마커 개발하는 것에 대한 것이다.
터봇 (Scophthalmus maximus) 은 유럽산 가자미의 일종으로 넙칫과에 속하며 북대서양, 발트해, 지중해에 서식하는 어종으로 국내에서는 돌광어, 찰광어라 불린다. 동북 아시아에서는 서식하지 않는 외래 어종으로, 비교적 차가운 바다에 서식한다.
터봇은 비대칭 마름모에서 원형에 가까울 정도의 넓직한 체형을 갖고 있어 넙치와 유사한 외형을 갖고 있다. 체색은 모래에 사는 개체와 수중 암반에 사는 개체가 서로 다르며, 다른 가자미과 어류와 마찬가지로 서식 환경에 따라 체색을 변화시킨다. 눈의 위치는 우리나라의 일반적인 넙치(광어)처럼 정면에서 봤을 때 왼쪽으로 돌아가 있다.
터봇의 육질은 단단하고 고소한 풍미를 자랑하여 유럽에서는 물론 아시아권에서도 고급식자재로 스테이크, 튀김, 구이, 찜 등으로 자주 요리되며 선호도가 높아 터키, 프랑스 등 많은 유럽 여러 나라에서 양식되고 있다. 현재 국내에서는 제주지역 양식어가 20여곳에서 생산되고 있으며 2016년에 2~300톤 생산되었다.
터봇 양식은 프랑스에서 처음 시작되었으며, 현재는 스페인, 포르투갈, 덴마크 및 네델란드 등의 유럽 및 중국을 비롯한 아시아에서 양식되고 있다. 우리나라에서는 2012년에 들어서 제주도의 용암 지하해수를 이용한 양식이 시작되어 조금씩 유통되고 있다.
제주 양식업계에서는 '돌광어' 또는 '찰광어'로 불린다. 식감은 대체적으로 광어보다 높이 평가되고 있어 광어보다 비싸게 유통되고 있다. 터봇은 특히 중국 내에서 다복어(多福魚), 또는 다보어(多魚)로 불리며 '귀한 것, 복을 불러 들인다'는 뜻을 가지고 있어 중국인들이 많이 찾는 어종으로 알려져 있다. 제주산 터봇은 중국산과의 품질경쟁에서 우위를 점하고 있으며, 프랑스산과도 가격경쟁에서 유리해 수출증대가 기대되는 양식어종이다.
국내에서 터봇 양식어가의 증가로 인해 생산량은 점차 늘고 있는 추세이며, 이에 따라 우리나라 양식산 터봇 집단의 유전자형 분석과 이를 바탕으로 한국형 터봇의 품종개량의 필요성이 제기되고 있다. 더욱이, FTA에 따른 양식업의 경쟁력 확보를 위한 우량 종묘 및 수산물의 경제적 부가가치를 높이는 것이 절실한 상황에서 현재 수산생물 육종기술 도입 및 활용은 매우 미비한 상태로 수산양식종의 지속적 개량 및 소득 증대를 위해서는 DNA 마커를 활용한 분자육종 기술방법 개발이 필요하다.
유전자 표지 (DNA marker)를 이용한 육종과 전통적인 선발육종을 접목해 지속적인 후대생산을 통해 경제형질을 개선현대의 육종프로그램은 고전적인 선발육종인 양적 유전학적 육종방법과 최근 발전하고 있는 생물 정보학을 이용한 분자육종을 접목시켜 지금까지 생각하지 못하였던 우량형질의 선택을 가능하게 만들면서 양식업에 획기적인 변화를 일으키고 있다.
DNA 마커는 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 초기의 DNA 마커는 다수의 유전자좌를 용이하게 확인할 수 있는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), ISSR(inter-simple sequence repeat) 등의 우성 마커(dominant marker)가 주로 이용되었다.
그러나 RAPD와 ISSR의 경우 재현성이 떨어질 뿐만 아니라 우성 마커의 특성상 2배체에서 우성 동형 접합체와 이형 접합체 유전자형의 구분이 불가능한 단점이 있다. 반면 SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다.
SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다. SSR 마커는 다형성 정도가 높아서 유전적 다양성과 유연관계를 평가하는데 많이 이용되고 있으며 수산분야 역시 SSR 마커를 이용한 방류효과조사, 혼획률 조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 이용되고 있다.
국내 등록특허번호 제10-1754502호에는 마이크로새틀라이트 마커를 활용한 돼지의 개체식별 및 친자감별방법에 관하여 개시하고 있고, 국내 등록특허번호 제10-1198096호에는 개인식별 또는 친자확인용 키트에 관하여 개시하고 있으나 상기 선행문헌은 개체식별 또는 축산물의 친자 감별에 관한 것이고, 본 발명의 터봇 친자관계 및 혈연관계의 감별이 가능한 마커 및 프라이머 세트에 관한 구성은 개시하지 않아 차이를 보인다.
국내 등록특허번호 제10-1754502호에는 분석하고자 하는 돼지의 핵산 시료를 S0655, 387A12F, KVL9834, KVL9833, DGS1, DGS2, DGS3, DGS6, DGS9, DGS101, DGS102, DGS13, DGS14, DGS16, DGS17, DGS18, DGS22, DGS23의 18개로 이루어진 군으로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 1 내지 서열번호 36로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 제1 단계, 상기 제1 단계에서의 PCR에 대해 유전자형 분석을 수행하는 제2 단계, F-통계량 추정법에 의한 F-통계량을 추정 프로그램을 사용하여 다형성 지수인 이형접합률, 다형정보지수 및 배재력을 18종의 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 계산하는 제3 단계를 포함하고, 이를 통해 분석을 원하는 돼지의 개체 출현확률 및 친가감별확률을 계산하는 마이크로새틀라이트 마커를 활용한 돼지의 개체식별 및 친자감별방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1198096호에는 서열번호 1 내지 24로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 또는 친자확인을 하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 개인식별 또는 친자확인 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 또는 친자확인용 키트에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2009-0028894호에는 한우 개체의 식별을 위해 선발된 마이크로새틀라이트 마커 조합에 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하는 PCR을 이용한 한우 개체의 식별방법에 관하여 개시하고 있다. 국내 공개특허공보 제10-2010-0138223호에는 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 마커를 증폭하는데 사용되는 프라이머쌍, 이를 포함하는 마이크로새틀라이트 DNA 마커 증폭용 키트, 및 이를 이용한 참치 품종의 식별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 증폭하고 이 증폭된 산물의 유전자형을 분석하면 참치를 새치와 기름치로부터 정확하면서도 간편하고 신속하게 식별할 수 있는 참치 품종을 식별하기 위한 마이크로새틀라이트 DNA마커 증폭용 프라이머쌍에 관하여 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 개체 간의 변별력이 높은 SSR 부위를 선별하여 마커로 개발하고 동시에 여러 개 분석이 가능한 프라이머 조합의 개발 및 최적의 반응조건을 확립하는 것이다. 또한 해당 마커를 통해 터봇의 개체 식별 및 친자확인, 혈연관계 등 확인이 가능하도록 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 마커번호 1로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 12 내지 13으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 2로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 14 내지 15로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 3으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 16내지 17로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 4로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 내지 19으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 5로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 20 내지 21로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 6으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 22 내지 23으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 7로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 24 내지 25으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 8로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 26 내지 27로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 9로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 28 내지 29로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 10으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 30내지 31으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 마커번호 11로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 32 내지 33으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 터봇 친자 및 혈연관계 식별용 마이크로새틀라이트(SSR; simple sequence repeat) 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일실시예에 따른 터봇 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커 를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법은 분석하고자 하는 터봇에서 게놈 DNA를 분리하는 단계(가); 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 통해 표적 서열을 증폭하는 단계(나); 및 상기 PCR증폭 산물을 분석하는 단계(다)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (나)단계의 멀티플렉스 PCR을 진행하기 위하여 각 마커 프라이머 정방향 올리고(forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지 형광물지로 표지(Label)하고 역방향 올리고(reverse primer)의 5’말단에 6개의 oligomer(GTTTCT)를 tailing하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (다)단계는 PCR 증폭산물에 대해 자동염기서열 분석장치를 이용하여 유전자형을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 유전자형분석 결과는 우수친어 교배지침, 집단 유전학적 분석, 가계선발, 방류효과조사, 근치방지, 열성화 방지, 친자 및 혈연관계 확인 등에 이용할 수 있다.
바람직하게는 상기 (다)단계는 마커를 기반으로 혈연관계를 파악하고자 하는 개체들의 유전자형을 분석결과 데이터를 입력하고, 상기 유전자형 분석결과의 데이터로부터 대립유전자빈도를 입력하며, 부모집단과 자식집단 사이의 대립유전자형의 일치여부를 비교하고 상기 대립유전자형의 일치되는 경우의 수에 따른 IBD공식을 설정하며, 상기 설정된 IBD공식에 혈연관계에 대한 경우의 수에 따른 IBD상수를 적용하여 혈연관계지수(likelihood ratio)를 추출하는 단계와, 상기 혈연관계지수값을 혈연관계확률 식에 적용하여 가장 높은 수치의 확률결과를 확인하여 혈연관계를 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
차세대 시퀀싱을 기반으로 개발한 본 발명의 마커 부위는 변별력이 높고 증폭률이 우수한 마커를 최종적으로 선별한 것이고, 해당 마커를 이용하여 유전자형을 분석할 시 친자확인을 위한 기초데이터를 생산이 가능하였다. 동시에 11개의 마커 증폭할 수 있는 multiplex PCR set를 개발함으로써 빠르고 신속하게 분석이 가능하며, 정확하고 과학적인 친자확인 프로그램을 통한 분석 시 친자확인이 가능한 효과가 있다. 또한, 유전적 다양성 분석 결과 각 마커의 대립유전자수는 평균 13개로 높게 나타났으며 다형성지수 또한 0.762로 높게 나타났다. 이는 여러 터봇 집단의 3510개체를 이용한 분석으로서 유전적 다양성 결과에 대한 정확성이 높다고 판단된다.
도 1은 마커별 대립유전자 크기 범위 및 형광염료 표지를 나타낸다.
도 2는 터봇의 유전자형 분석결과로 각 피크들은 마커의 대립유전자를 나타낸다.
도 3은 터봇의 유전자형 분석결과로 각 피크들은 마커의 대립유전자를 나타낸다.
도 4는 부모집단의 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 5는 자식집단의 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 6은 자식과 부모사이의 관계확인을 위해 누적유전형빈도(allele frequency)를 이용한 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 분석한 결과이다.
본 발명의 용어, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 마이크로새틀라이트(SSR; simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분을 지칭한다.
본 발명에서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는 데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
멀티플레스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제 (inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머 들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용 시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
본 발명에서 "프라이머(Primer)"는 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 여기에 정의된 프라이머라는 용어는 DNA의 합성을 준비할 수 있는 DNA 가닥들을 말한다. DNA 중합효소(polymerase)는 프라이머 없이 처음부터 DNA를 합성할 수 없다. DNA 중합효소는 오직 상보적인 가닥이 조립되는 뉴클레오티드들의 순서를 지시하기 위한 주형으로서 사용되는 반응에서 존재하는 DNA 가닥을 연장할 수 있다. 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형된 뉴클레오타이드 또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱"은 많은 양의 리드들(reads), 전형적으로 동시에 몇 백보다 많은 수천 또는 수많은 서열 리드들의 순서를 발생시킬 수 있는 시퀀싱 기술이다. 차세대 시퀀싱은 고식적 생거 또는 모세관 시퀀싱(capillary sequencing)으로부터 구별되고 그리고 분명하다. 전형적으로, 서열화된 산물들은 전형적으로 대략 600~30 염기쌍 사이에서, 상대적으로 짧은 리드들을 가진다. 상기 기술들은 전형적으로 추가적으로 광범위하고 그리고 정교한 데이터 저장 및 리드 조립(read assembly) 등을 위한 데이터처리 작업 흐름을 구성한다.
분석 대상종의 염기서열 정보가 충분히 밝혀진 경우에는 SSR 정보를 직접 탐색하여 마커 개발을 할 수 있으나, 염기서열 정보가 불충분한 경우 새로운 영역을 개발해야만 한다. 이를 개발하기 위해 최근에는 NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)를 이용하여 마커 개발 대상종으로부터 대량의 염기서열 정보를 분석하고, SSR 영역을 직접 탐색함으로써 SSR 마커를 개발하는 방법이 이용되고 있다. 초기의 대규모 시퀀싱의 경우, 고비용으로 시간도 오래 걸렸으나 기술의 발전으로 더욱 빠르고 저렴하게 분석되어 많은 종의 유전자를 밝히는데 이용되고 있으며 SSR 마커가 개발되지 않은 수산종에 대하여 NGS를 이용한 염기서열 확보와 microsatellite 마커 개발의 당위성이 높아지고 있다.
본 발명은 NGS를 이용하여 터봇의 염기서열을 밝혀내고 터봇의 SSR 부위를 이용한 친자확인용 마커를 제공한다. NGS 기술은 2000년대 초반에 완성된 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)의 영향으로 저비용, 고속, 대용량 염기서열 확정 기술이 요구됨에 따라 2006년과 2007년에 각각 일루미나(Ilumina)와 로슈(Roche) 사에서 NGS 기술을 이용한 제품들이 시장에 출시되면서 각광을 받기 시작하였다. 마이크로 또는 나노기술을 이용하여 시료의 길이를 줄이고, 수백만 개의 시료 단편들을 병렬로 분석할 수 있는 장점을 가지고 있다.
NGS 기술의 기본원리는 DNA 서열에 대한 증폭을 하고 서열 확정 과정에서 형광을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기서열의 순서를 밝혀내는 것이다. PCR 증폭 방식에 따라서 일루미나 사의 기종들은 고체-상 증폭(solidphase amplification)을 사용하는데 반해 로슈(Roche, 454) 사와 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사의 기종들은 에멀전 PCR(emulsion PCR, emPCR) 방식으로 제작되었다.
또한, NGS 기술에는 다양한 회사의 플랫폼들이 존재한다. 본 발명에서 사용한 NGS 장비는 일루미나 사에서 개발된 MiSeq이다. MiSeq은 소형 NGS 장비로 특징은 기존 대용량 시퀀서인 HiSeq의 기법인 DNA 서열을 다른 회사들 (로슈, AB)에서 나온 플랫폼처럼 용액 안에서 증폭시키는 것이 아니라 판 위에 고정시킨 후에 판 위에서 구부러지면서 서열이 증폭되어 서열 집단을 형성하는 것이 특징이다. 그렇게 형성된 클러스터라는 집단은 집단 별로 시퀀싱이 이루어져 각 판독물(reads)의 염기서열 정보로 전환되고 분석과정에 넘어간다. MiSeq 장비는 HiSeq의 방법을 유지하면서 소형화에 성공하여, 장비 크기와 가격을 줄이고 작업을 더 빠르고 간편하게 만들었다는 점이다. MiSeq은 2 x 150 bp에서 최대 24시간 이내 3.7-4.6 Gb의 생체 정보 데이터를 생산할 수 있다.
통상적인 수산분야에서의 유전자형 분석 결과를 이용한 정확한 친자관계 및 전형매관계(Full-sib) 확인방법은 해외에서 개발된 집단간 유전적 거리 비교분석법을 이용하고 있거나 친자확인의 경우는 유전형비교를 육안으로만 확인하는 경우가 있다. 이는 개체에 대한 동일 여부를 확인 (Identification)하기 위해서는 이용이 가능할 것이지만 통계적인 분석법을 요하는 혈연관계나 친자관계 확인에서는 오류의 가능성이 매우 높으며, 거짓음성(False negative), 거짓양성(False positive)의 확률이 높다고 말할 수 있다.
이에 상기 혈연관계를 결정하는 단계는 여러 개체들 사이에 나타나는 누적되는 대립유전형 빈도(allele frequency)를 이용하여 1:1 비교(matching) 및 우도비(Likelihood ratio) 산정 결과를 이용하여 개체간의 각각의 유전자좌(locus)에 대한 대립유전형(allele)을 비교하여 일치하거나 불일치하는 경우 그에 대한 특정 값과 누적대립유전형 빈도 값을 부여하고 혈연관계지수를 산출함으로써 기존의 방법보다 보다 정확하게 혈연관계를 판단할 수 있다.
이하, 본 발명을 첨부한 도면과 함께 상세히 설명하면 다음과 같다.
<실험예 1> 터봇 게놈 DNA 추출
터봇 꼬리 지느러미 조직 일부를 절취하여 게놈 DNA를 추출하고 차세대 시퀀싱 분석(NGS; next generation sequencing)을 실시하기 위해서 High quality DNA를 추출하였다. 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법 또는 Wizard®Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 이용하여 수행하였다.
<실시예 2> DNA Library 제작
DNA library 제작은 Quality 높은 Raw data를 생산하기 위하여 Library QC(Quality control) test를 실시하였으며 Agilent 사의 2100 BioAnalyzer를 사용하여 확인하였다. Library QC를 통과하는 농도 기준인 Total volume이 10ug일 때 최소 5nM 이상 되도록 하였으며 Library QC가 통과 후 de novo assembly를 진행하였다.
Illumina sequencer 인 Hiseq4000을 이용하여 터봇의 NGS raw data를 생산하였으며 총 데이터 생산량은 genome size의 15배 이상인 15Gb이상 생산하였다. 생산 된 Total base reads를 확인 한 후 Q20에 해당하는 data를 filter 하여 정렬하였다.
<실시예 3> 프라이머 제작
3-1 SSR 영역 marker design
Q-score는 염기를 호출할 때 발생할 수 있는 오류 가능성에 대한 대수적인 수치라 볼 수 있으며 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘 못 불러올 확률로 99%의 정확성을 나타낼 확률이다.
생산된 data는 Q20이 90%이상인 reads만 남기고 필터링을 실시하고 De novo assembly 후 SSR region만 선별하며 Primer3(version 0.4.0) program을 이용하며 해당 지역의 marker를 design하였다. 동시 증폭을 위해서 Annealing temperature은 58~60℃로 맞추며 GC contents은 40~60%, product size는 100~300bp 마커를 디자인하였다. 하기의 표 1은 마커의 특성을 나타낸다.
마커의 특성
좌위 마커번호 Repeat motif Repeat size(bp)
TB_MS01 1 (GT)6 12
TB_MS02 2 (TG)8 16
TB_MS03 3 (CA)26 52
TB_MS04 4 (GT)20 40
TB_MS05 5 (CA)11 22
TB_MS06 6 (AC)14 28
TB_MS07 7 (CA)34 68
TB_MS08 8 (GT)4 8
TB_MS09 9 (GA)20 40
TB_MS10 10 (CA)20 40
TB_MS11 11 (TG)11 22
3-2 프라이머 제작
하기의 표 2는 상기 실시예 3-1의 방법으로 선정된 마커번호 1 내지 11로 표시되는 마커 DNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 서열번호 12 내지 33으로 나타내었다. 도 1은 마커별 대립유전자 크기 범위 및 형광염료 표지를 나타낸다.
유전자 마커의 동시 증폭을 위해 정방향 올리고(forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지 형광물질을 부착하여 증폭물의 크기가 서로 중복될 경우 형광물질 색으로 구분할 수 있도록 다른 색의 형광물질로 표지 시켰으며, 또한 역방향 올리고(reverse primer)의 5’말단에 6개의 oligomer(GTTTCT)를 tailing하여 background noise를 최소화 시켜 분석을 용이하도록 하였다.
프라이머 쌍의 특성
Marker Name 서열번호 Sequence (5' to 3') 5' Dye Repeat No. Fragment size(bp)
TB_MS01_F 12 TTTCTCCCCTCTTGCTGTATG FAM 6 104-114
TB_MS01_R 13 GTTTCTTTACAAGTGTGGACTGGAGCTG
TB_MS02_F 14 AAGGAAGCCATTGTGTGTGT FAM 8 158-172
TB_MS02_R 15 GTTTCTCCCTGTGAATTTGTCCATCC
TB_MS03_F 16 GCCCCTGATTTTAGATAGTAA FAM 26 326-376
TB_MS03_R 17 GTTTCTTGCTGAACAAGATGATGGAT
TB_MS04_F 18 CACCAACAACGAAGTCCTCA VIC 20 138-176
TB_MS04_R 19 GTTTCTAGTCCTCCAAATCACATCCA
TB_MS05_F 20 ATCCAGGAGAGCAGAGAC VIC 11 177-197
TB_MS05_R 21 GTTTCTGCCACACCTCACTGTAAA
TB_MS06_F 22 CCTTGACAGGCTATTGGAAGTA VIC 14 294-320
TB_MS06_R 23 GTTTCTGCACAGGGTCAGAAATGGAG
TB_MS07_F 24 AACTGACACAGAGTGGGAGGT NED 34 122-188
TB_MS07_R 25 GTTTCTCTGGTGATTCAACAATCTGCT
TB_MS08_F 26 CAGGGTCGAGGGAAGAG NED 4 219-225
TB_MS08_R 27 GTTTCTGCCAACTGCCTGCTAGTA
TB_MS09_F 28 CCGCTGAACAAACACGATAA NED 20 218-256
TB_MS09_R 29 GTTTCTGGCCCATTCACAGATAACC
TB_MS10_F 30 TGTGAATGTCTTCCTGTGGTG PET 20 143-181
TB_MS10_R 31 GTTTCTGCCGATAGTTGTTTGTGTCG
TB_MS11_F 32 TGATTCCCGCTGATGTATGA PET 11 231-251
TB_MS11_R 33 GTTTCTTTGACATTGTTCGCTCCAGAA
하기의 표 3은 개발 마커를 이용한 터봇 집단의 유전학적 분석결과를 나타낸다. 제작된 마커의 경우2bp씩 6번~20번 반복하는 부위를 중심으로 제작하였으며 마커번호 8로 표시되는 마커에 대한 식별력은 4.620x10-14로 높은 값을 나타내었다.
또한 마커를 이용한 유전적 다양성 분석 결과 각 마커의 대립유전자수는 평균 13개로 높게 나타났으며 다형성지수 또한 0.762로 높게 나타났다. 이는 여러 터봇 집단의 3510개체를 이용한 분석으로서 유전적 다양성 결과에 대한 정확성이 높다고 판단된다.
개발 마커를 이용한 터봇 집단의 유전학적 분석
유전자좌
(Locus) 		대립유전자수(k) 분석미수(N) 이형접합률 관찰치(Hobs) 이형접합률 기대치(Hexp) 다형성지수
(PIC)
TB_MS01 5 3334 0.81 0.74 0.692
TB_MS02 7 3505 0.801 0.773 0.737
TB_MS03 23 3497 0.935 0.892 0.883
TB_MS04 13 3501 0.787 0.835 0.815
TB_MS05 10 3506 0.746 0.806 0.782
TB_MS06 12 2730 0.878 0.854 0.836
TB_MS07 27 2669 0.708 0.842 0.824
TB_MS08 4 3505 0.59 0.531 0.477
TB_MS09 20 2734 0.852 0.85 0.835
TB_MS10 11 3504 0.802 0.822 0.801
TB_MS11 11 3499 0.682 0.724 0.698
Mean 13.0 3271.3 0.781 0.788 0.762
<실시예 4> 유전자형 분석
4-1 다중증폭 중합효소연쇄반응 (Multiplex PCR)
서열번호 12내지 33의 프라이머 쌍이 포함된 11개의 marker를 포함한 Multiplex PCR set을 이용하여 PCR을 실시하였다. 동시 증폭(multiplexPCR)의 경우 annealing temperature에 따른 영향 및 시약 농도의 영향을 많이 받게 된다. PCR 시약의 조성으로는 하나의 샘플 당 DNA template의 경우 1ul(100ng/ul), 10X buffer 1.5ul, dNTP(2mM) 1.5ul, Hot-taq polymerase(5U/ul) 0.3ul를 혼합하였으며, dye가 포함된 Forward primer의 경우 TB_MS01_F는 0.1ul, TB_MS02_F는 0.2ul, TB_MS03_F은 0.3ul, TB_MS04_F는 0.2ul, TB_MS05_F는 0.25ul, TB_MS06_F는 0.3ul, TB_MS07_F는 0.15ul, TB_MS08_F는 0.2ul, TB_MS09_F는 0.3ul , TB_MS10_F는 0.1ul TB_MS11_F는 0.2ul을 넣고, 동일량의 Reverse primer를 함께 섞은 후 primer mixture를 만들어서 혼합하였다.
총량이 20ul가 되도록 증류수(distilled water)를 넣어주었다. PCR 조건은 touch-down PCR 방식으로 온도를 낮춰주며 annealing temperature에 따른 영향을 최소화하였다. 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 첫번째 단계로 94℃에서 1분; 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 5 싸이클로 반복 수행하고, 두번째 단계로 94℃에서 1분; 57℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 5 싸이클, 세번째로 94℃에서 1분; 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 25 싸이클로 반복 수행하였다. 마지막으로 65℃에서 30분 간 final extension을 시켜 준 후 8℃로 마무리하였다.
4-2 유전자형 분석(Genotyping analysis)
증폭이 완료된 PCR 산물은 30X dilution 시킨 후, 증폭산물 1㎕와 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 및 Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료는 자동염기서열 분석장치 인 3730xl DNA Analyzer(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동하였다. 각 마커에 대한 표준 allele ladder를 제작하여 GeneMapper version 4.0(ThermoFisher Scientific, USA)등 분석프로그램을 이용하여 모든 개체를 scoring하고 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 자료를 취합하고 분석하였다.
도 2내지 3은 터봇의 유전자형 분석결과로 각 피크들은 마커의 대립유전자를 나타낸다. 해당 마커를 이용할 시 동시에 터봇의 11개의 SSR 부위 유전자형을 얻을 수 있다. 각 마커 별로 중첩되는 부위의 마커는 표지된 형광염료로 구분될 수 있다. 푸른색으로 나타나는 피크는 FAM으로 형광표지된 TB_MS01, TB_MS02, TB_MS03이며, 초록색으로 나타나는 피크는 VIC으로 형광표지된 TB_MS04, TB_MS05, TB_MS06이다.
노란색으로 나타나는 피크는 NED로 형광표지된 TB_MS07, TB_MS08, TB_MS09이며, 붉은색으로 나타나는 피크는 PET으로 형광표지된 TB_MS10, TB_MS11에 대한 것이며 size standard를 이용하여 각 대립유전자들의 크기(bp)를 알 수 있었다.
<실험예 5> 개체별 유전자형 분석
5-1 부모집단 유전자형 분석
분석에 사용된 부모집단은 총 2741미로 암컷 1591미, 수컷 1150미이며 해당 개체들은 교배 전 꼬리지느러미를 채취 후 상기 실험예 1 내지 4에 따른 방법으로 유전자형 분석을 실시하였다. 분석 방법은 상기 내용의 동시증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 PCR 후 유전자형 분석을 실시하였다. 도 4는 부모집단의 유전자형 분석결과를 나타낸다.
5-2 자식집단 유전자형 분석
부모집단에서 생산된 종자 157미의 꼬리지느러미 시료 채취 후 상기 실험예 1 내지 4에 따른 방법으로 유전자형 분석을 실시하였다. 분석 방법은 기재한 개발된 동시증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 PCR 후 유전자형 분석을 실시하였다. 도 5는 자식집단의 유전자형 분석결과를 나타낸다.
<실험예 6> 친자 관계 식별
가축이나 어류에서 친자 확인법은 주로 최대가능도(maximum likelihood)방법을 사용하게 되며, 이는 여러 유전형을 통해 통계적으로 분석하는 방법이다. 친자확인의 경우 통상적으로 사용되고 있는 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 분석하였다.
도 6은 자식과 부모사이의 관계확인을 위해 누적유전형빈도(allele frequency)를 이용한 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 분석한 결과이다. Pair loci mismatching 및 Trio loci mismatching이 ’인 값을 선별하거나 LOD Score 가 3이상인 것으로 친자관계를 확인하였다.
친자확인 결과
구분 분석 비고
시료 채취수 154 분석한 자식개체
유전자형 분석수 154 (100%) 마커 9개 이상 분석
친자확인 수 151 (98.1%) 부모-자식 관계 확인
상기 표 4는 친자확인 결과를 나타낸다. 개발된 유전자 마커에 대한 SSR 부위의 반복수는 멘델 법칙에 의해 자손에게 유전되며, 부모 집단의 유전자형과 비교하여 친자 확인이 가능하다. 자식 개체 154미에 대한 유전형 분석 결과를 진행한 결과 그 중 154미 모두 분석 가능하였고 최종적으로 친자확인 및 검증된 개체는 151미였다.
상기 결과, 본 발명의 유전자좌에서 산출된 혈연관계지수 값을 계산하여 친자관계 및 혈연관계를 판정하는 방법은 친자 및 혈연관계 확인은 통계적 정확성 및 신뢰성이 매우 높은 효과가 있다. 본 발명 마커를 이용하여 집단교배에 의해 생산되는 양식 환경에서 부모개체를 정확히 알 수 있었으며, 추가적으로 혼획률 조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 활용 가능할 것이다.
터봇의 양식 산업이 활발해짐과 동시에, FTA협정으로 터봇 양식업의 경쟁력 확보를 위해서는 우량 종묘 및 수산물의 경제적 부가가치를 높이는 것이 중요하다. 이에 본 발명은 터봇 친자 및 혈연관계의 식별이 가능한 것으로 높은 계통(line)이나 품종(breed)을 새롭게 개발할 수 있도록 기본 데이터베이스를 제공이 가능함으로 육종기술 도입 및 활용에 직접 또는 간접적으로 기여하여 산업상 이용가능성이 있다.
<110> BluGen Korea <120> Genetic maker for parentage and thereod in Turbot <130> p18-0529018 <160> 33 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS01 <400> 1 gtgtgtgtgt gt 12 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS02 <400> 2 tgtgtgtgtg tgtgtg 16 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS03 <400> 3 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca ca 52 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS04 <400> 4 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 40 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS05 <400> 5 cacacacaca cacacacaca ca 22 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS06 <400> 6 acacacacac acacacacac acacacac 28 <210> 7 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS07 <400> 7 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 60 cacacaca 68 <210> 8 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS08 <400> 8 gtgtgtgt 8 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS09 <400> 9 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS10 <400> 10 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS11 <400> 11 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tg 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS01 forward primer <400> 12 tttctcccct cttgctgtat g 21 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS01 reverse primer <400> 13 gtttctttac aagtgtggac tggagctg 28 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS02 foward primer <400> 14 aaggaagcca ttgtgtgtgt 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS02 reverse primer <400> 15 gtttctccct gtgaatttgt ccatcc 26 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS03 forward primer <400> 16 gcccctgatt ttagatagta a 21 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS03 reverse primer <400> 17 gtttcttgct gaacaagatg atggat 26 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS04 forward primer <400> 18 caccaacaac gaagtcctca 20 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS04 reverse primer <400> 19 gtttctagtc ctccaaatca catcca 26 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS05 forward primer <400> 20 atccaggaga gcagagac 18 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS05 reverse primer <400> 21 gtttctgcca cacctcactg taaa 24 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS05 forward primer <400> 22 ccttgacagg ctattggaag ta 22 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS06 reverse primer <400> 23 gtttctgcac agggtcagaa atggag 26 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS07 forward primer <400> 24 aactgacaca gagtgggagg t 21 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS07 reverse primer <400> 25 gtttctctgg tgattcaaca atctgct 27 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS08 forward primer <400> 26 cagggtcgag ggaagag 17 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS08 reverse primer <400> 27 gtttctgcca actgcctgct agta 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS09 forward primer <400> 28 ccgctgaaca aacacgataa 20 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS09 reverse primer <400> 29 gtttctggcc cattcacaga taacc 25 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS10 forward primer <400> 30 tgtgaatgtc ttcctgtggt g 21 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS10 reverse primer <400> 31 gtttctgccg atagttgttt gtgtcg 26 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS11 forward primer <400> 32 tgattcccgc tgatgtatga 20 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TB_MS11 reverse primer <400> 33 gtttctttga cattgttcgc tccagaa 27

Claims (4)

  1. 마커번호 1로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 12 내지 13으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 2로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 14 내지 15로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 3으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 16내지 17로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 4로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 내지 19으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 5로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 20 내지 21로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 6으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 22 내지 23으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 7로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 24 내지 25으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 8로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 26 내지 27로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 9로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 28 내지 29로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 10으로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 30내지 31으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
    마커번호 11로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 32 내지 33으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 모두 포함하는 터봇 친자 및 혈연관계 식별용 마이크로새틀라이트(SSR; simple sequence repeat) 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 조성물
  2. 분석하고자 하는 터봇에서 게놈 DNA를 분리하는 단계(가); 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 제1항의 조성물을 이용하여 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 통해 표적 서열을 증폭하는 단계(나); 및 상기 PCR증폭 산물을 분석하는 단계(다)를 포함하는 터봇 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커를 이용한 친자 및 혈연관계 확인방법
  3. 삭제
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 터봇 친자 및 혈연 관계 식별용 유전자 마커를 이용한 친자 및 혈연관계 식별용 키트
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