CN101880719A - 大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，包括大菱鲆个体DNA提取、大菱鲆多态性微卫星标记筛选和引物合成、大菱鲆多重PCR体系的构建及家系和亲子鉴定。本发明建立了进行大菱鲆家系和亲子鉴定的2个多重PCR反应体系，将待测个体进行多重PCR扩增、电泳、银染后分析获得微卫星标记基因型数据，再采用NTsys软件进行家系鉴定的聚类分析，采用Cervus2.0软件进行亲子鉴定分析。本发明实现了在一个PCR反应中同时检测4个微卫星位点，因此与原有的PCR方法相比效率提高了4倍左右，并可以在养殖基地现场检测。本发明具有高效、经济、简便易行等特点，可以在大菱鲆种质鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用。

Description

大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定技术，具体涉及一种养殖鱼类大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，适合在大菱鲆养殖和育种中进行种质鉴定和家系管理。

背景技术

在中国称“多宝鱼”的大菱鲆是原产于欧洲沿海的一种名贵比目鱼，它具有生长速度快，肉质好，养殖和市场潜力大等优点，相继成为各国开发的优良海水养殖鱼类之一。自1992年引进我国后，大菱鲆养殖产业在我国得到迅速发展，现已经成为我国北方沿海重要的鱼类养殖品种。但是，由于我国不是大菱鲆的原产地，养殖生产中长期依赖于欧洲大菱鲆原产国提供、补充种源。同时，由于累代养殖和近亲交配比较严重，国内大菱鲆产业普遍出现了种质退化现象。主要表现为生长速度降低、白化率增高、出苗率降低等现象。因此种质资源优化、良种选育已经成为我国大菱鲆养殖产业健康、可持续发展急待解决的重要课题之一。

家系选育是获得优良品种的重要手段。家系选育过程中，保持完整、准确的系谱信息可以有效指导亲本选留，从而避免近交衰退现象。大菱鲆良种培育中，为了实现家系遗传参数的准确评估，需要早期对不同家系进行混养。而采用物理标记对幼体进行标识存在较大的局限性，如标记存续时间短，成本高、工作量大，幼体达到标记大小才能标记，无法完全消除环境误差等问题。因此，选用有效的分子标记，进行高通量的亲子鉴定和家系管理已成为大菱鲆养殖业亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是构建大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，用于大菱鲆亲子鉴定和家系管理，以克服现有技术的亲子鉴定方法不能高通量检测、误差大的不足。

本发明采用微卫星标记技术与多重PCR技术，根据已有序列设计无荧光标记的PCR引物，筛选多态性微卫星标记，将多对微卫星标记引物放在同一个PCR反应体系内进行PCR扩增，从而建立了在同一个PCR反应体系内扩增多个微卫星引物的多重PCR方法，再应用微卫星多重PCR方法获得基因型数据进行亲子鉴定。

本发明包括以下四个步骤：

一)、大菱鲆个体DNA提取；

二)、大菱鲆多态性微卫星标记筛选和引物合成；

三)、大菱鲆多重PCR体系的构建；

四)、家系和亲子鉴定；

其具体操作如下：

一)、大菱鲆个体DNA提取：

将大菱鲆鳍条采用常规的酚/氯仿方法提取亲本和子代DNA，把获得的DNA测定浓度后，稀释至100ng/μl。

二)、大菱鲆多态性微卫星标记筛选和引物合成：

根据现有的微卫星标记序列，设计引物，合成非荧光标记微卫星引物，并运用大菱鲆家系亲本和家系个体进行PCR扩增；筛选出获得清晰条带的引物，选择在已知亲本中扩增出2个及以上DNA条带的微卫星标记作为多态性标记，根据筛选获得的多态性微卫星标记设计多重PCR。

本发明从18对大菱鲆微卫星标记Sma2380、Sma2994、Sma1880、Sma2010、Sma2132、Sma2432、Sma-USC25、Sma-USC19、Sma-USC52、Sma-USC20、Sma-USC34、Sma-USC29、Sma-USC27、Sma-USC100、Sma-USC184、Sma-USC103、Sma-USC174、Sma-USC226中筛选出13对多态微卫星标记引物进行组合设计多重PCR反应，最终获得Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29、Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226共8对引物组合的2个多重PCR体系。

三)、大菱鲆多重PCR体系的构建：

将上述获得的8对引物利用软件Primer Premier 5.0进行多重PCR组合设计。由于使用非荧光标记引物，为了适应多重PCR中在同一体系中各引物退火温度基本一致，不同引物扩增等位基因的识别，对Sma-USC29引物进行重新设计命名为Sma-USC29-1，经反应条件及反应体系优化后获得2个多重PCR体系，多重PCR体系1引物组合为：Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1；多重PCR体系2引物组合为Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226。

本发明的多重PCR体系1为每个PCR反应总体积15μL，包括100ng基因组DNA，10×PCR缓冲液1.5μL，1.5mM Mg²⁺，1UTaq酶，dNTP0.2mM，引物Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1引物分别为0.25μM。PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃变性45s，58℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环；95℃变性30s，55.5℃退火50s，72℃延伸50s，25个循环；95℃变性30s，50℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环，72℃延伸5min，最后10℃保存。

本发明的多重PCR反应体系2为每个PCR反应总体积15μl，包括100ng基因组DNA，10×PCR缓冲液1.5μL，1.5mM Mg²⁺，1U Taq酶，dNTP0.2mM，Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226引物分别为0.25μM、0.3μM、0.25μM、0.25μM。PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃变性45s，57℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环；95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸50s，25个循环；95℃，30s，50℃50s，72℃50s，10个循环，72℃延伸5min，10℃保存。

四)、家系和亲子鉴定

将多重PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后获得的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，利用pBR322分子量标准判定等位基因条带大小，以已知亲本基因型为参照，统计分析获得待测个体微卫星标记基因型数据，将上述基因型数据转换成(0.1)矩阵，再采用NTsys软件进行聚类分析，将那些聚在一支的个体认为来源于同一家系，聚在不同支的个体来源于不同家系，从而实现对待测个体的系谱认证；将上述基因型数据转换成数字基因型格式，采用Cervus2.0软件进行分析，根据待测个体基因型和亲本基因型之间相关性的大小确定待测个体是哪个亲本的后裔，从而实现对待测个体的亲子鉴定。

首先解释PCR扩增条带的命名规则，用Sma-USC25-a为例：Sma-USC25为微卫星引物的名称，a表示扩出的片段最小的条带，按升序依次命名本引物扩增得到的其他条带，如Sma-USC25-b，Sma-USC25-c…。然后按照下面的步骤进行家系和亲子鉴定：

1.确定亲本和子代个体在各微卫星位点的基因型

通过2个多重PCR反应对亲本样品进行扩增，将PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后获得的条带进行基因分型，根据各引物等位基因片段大小确定亲本在各微卫星位点的基因型，以pBR322DNA分子量标准作为等位基因片段大小的依据，确定个体基因型。由小到大分别命名为Sma-USC25-a，Sma-USC25-b，Sma-USC25-c，Sma-USC25-d，Sma-USC25-e等。

2.子代个体的家系鉴定

将上述基因型数据转换成(0.1)矩阵，再采用NTsys软件进行聚类分析，将那些聚在一支的个体认为来源于同一家系，聚在不同支的个体来源于不同家系，从而实现对待测个体的家系鉴定。

3.个体亲子鉴定：

将上述基因型数据转换成数字基因型格式，采用Cervus2.0软件进行分析，根据待测个体基因型和亲本基因型之间相关性的大小确定待测个体是哪个亲本的后裔，从而实现对待测个体的亲子鉴定。

本发明将微卫星标记技术和多重PCR技术相结合，利用8对微卫星多态性引物建立了2个微卫星多重PCR体系，进行大菱鲆家系高通量个体系谱识别和亲子鉴定。现有的简单PCR方法只能在一个PCR反应中检测一个微卫星位点，而本发明的方法可以在一个PCR反应中同时检测4个微卫星位点，因此与原有的简单PCR方法相比提高效率4倍左右，大大提高了亲子鉴定的效率和速度；并且检测费用也仅为原来的三分之一左右。分析表明有97.14％的个体准确聚类到各自家系中；亲子鉴定分析结果表明96.42％的个体可以准确确定其父母。与常见荧光标记多重PCR相比，该方法设备要求低、适应性更广，可以实现养殖基地现场检测。本发明方法的建立为大菱鲆种质鉴定和良种选育提供了新的技术手段。

附图说明

图1是本发明140个体NTsys聚类分析图(显示40个代表性个体)

图2是本发明70个双盲个体聚类分析结果(Mega4.0)

具体实施方式

实施例1(通过已知家系的亲本和子代样品来验证本发明的准确性)

一)、大菱鲆个体DNA提取

采集大菱鲆7个家系亲本11尾(亲本缺失3尾)及相应的子代个体尾鳍材料140尾，采用酚氯仿方法提取高纯度鳍条DNA：取少量鳍条放入离心管中并加入DNA提取液TENS(10mMTris-CI，pH8.0；100mM EDTA，pH8.0；100mM NaCl；0.5％SDS)加入蛋白酶K和RNA酶消化2-3小时，其间震荡几次使鳍条充分消化，然后再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀直至形成乳状液，室温下离心，取上清，重复抽提两次。向上清液中加入2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-30分钟。70％乙醇漂洗沉淀，TE(10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA，pH8.0)溶解DNA。测定DNA浓度后，将上述个体的DNA稀释至50ng/μl。-20℃保存备用

二)、大菱鲆多态性微卫星标记筛选和引物合成：

根据现有的微卫星标记序列，设计引物，采用非荧光标记方法合成微卫星标记引物，并运用大菱鲆家系亲本和家系个体进行PCR扩增；筛选出获得清晰条带的引物，选择在已知亲本中扩增出2个及以上DNA条带的微卫星标记作为多态性标记，根据该多态性微卫星标记的序列设计多重PCR的引物，采用非荧光标记方法合成多重PCR引物；

1、大菱鲆多重PCR候选微卫星引物来源：

采用已有微卫星引物Sma2380、Sma2994、Sma1880、Sma2010、Sma2132、Sma2432、Sma-USC 19、Sma-USC20、Sma-USC25、Sma-USC27、Sma-USC29、Sma-USC34、Sma-USC52、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC174、Sma-USC184、Sma-USC226用表1中的18对微卫星引物在已知亲本中进行PCR扩增，6％聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，选择在已知亲本中能够扩增出2个以上等位基因的微卫星标记作为多态性标记用于进行多重PCR设计。本发明中从上述18对微卫星标记引物中筛选获得引物13对(见表1中星号标注引物)，为满足多重PCP设计中引物组合扩增片段大小的要求，对Sma-USC20和Sma-USC29依据其序列对引物重新设计分别命名为Sma-USC20-1和Sma-USC29-1(见表1)。不同引物组合经筛选，最后获得8个位点组合的2个多重PCR体系(见表2)。

表1：用于多态性筛选的18对大菱鲆微卫星引物序列和重新设计的2对引物及其反应条件

其中：F向引物 R反向引物

2.微卫星引物的PCR扩增条件的确定：

以11尾家系亲本大菱鲆基因组DNA为模板，优化18对微卫星引物的PCR反应条件。

PCR反应体系如下：

上游引物(10μM)             0.4μL

下游引物(10μM)             0.4μL

10×PCR buffer(含Mg²⁺)      1.5μL

Taq DNA polymerase(5u/μL)  0.1μL

dNTPs(2.5mM)                0.6μL

基因组DNA                   1.0μL

ddH₂O                       11.0μL

                                                

总体积                      15.0μL

PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃变性30s，引物对应的退火温度(表1)下退火50s，72℃延伸50s，进行35个循环，循环结束后再72℃延伸5min，最后10℃保存。

3.微卫星位点PCR扩增产物的电泳：

采用北京六一仪器厂DYY-10C电泳仪和DYY-20C序列分析电泳槽，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。PCR产物通过6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，固定。

聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：50mL的6％的丙烯酰胺溶液(6％丙烯酰胺胶的配制方法：28.5g丙烯酰胺粉末+1.5g甲叉双丙烯酰胺+210g尿素+25mL 20×的TBE溶液，加水定容至500mL，过滤，4℃保存。)中加入40μL的TEMED溶液和120μL 10％的过硫酸铵溶液(APS，10g过硫酸铵融于100mL的ddH20中)。混合均匀后，立刻向已准备好的两块固定好玻璃板中灌胶。为避免出现气泡，灌胶过程中可用吸耳球轻轻敲打玻璃表面，使液体最前端尽可能呈一条直线。待玻璃板中胶灌满之后，将梳子背部插入胶中，一般经1.5-2h，丙烯酰胺胶凝固后即获得聚丙烯酰胺凝胶。电泳液使用1×TBE溶液。电泳参数为：电压1500V，功率50W，电流50mA。预电泳15min后，变性后的PCR扩增产物上样3.6μL，正式电泳约2.5h。电泳完成后进行聚丙烯酰胺胶的银染染色和显色，具体步骤如下：

(1)将PAGE胶放在1L的70％乙醇中固定约10min。

(2)回收乙醇后，加1L纯水进行水洗约5min。

(3)倒掉纯水后，加1L的染色液(将1.5g硝酸银粉末溶于1L纯水中)进行银染色约10-15min。

(4)回收染色液后，加1L的纯水进行水洗约5s。

(5)倒掉纯水后，加1L的显色液(将15g NaOH粉末、4mL甲醛溶液溶于1L纯水中)进行显色直至条带清晰。

(6)倒掉显色液后，加1L纯水进行水洗。

(7)待胶面晾干后，用数码相机进行拍照保存。

根据上述结果获得能够扩增出2个以上等位基因的13个微卫星位点用作多重PCR设计。将获得退火温度作为设计多重PCR反应条件的依据。

4.微卫星引物的合成：在商业生物技术公司采用非荧光标记方法合成多态性微卫星标记引物。

三)、大菱鲆多重PCR体系的构建

1.多重PCR体系构建和条件优化

将上述获得的候选13对引物利用Primer Premier5.0进行多重PCR组合设计，为了适应多重PCR需要对个别引物GENBANK上获得序列进行引物重新设计命名为Sma-USC20-1和Sma-USC29-1，引物组合要求具备各引物有较好的相容性，引物间相互不形成二聚体和发卡结构，且各引物扩增条带分散、无交叉重叠现象便于对扩增产生的条带进行基因型判定，经PCR反应体系和反应条件优化后获得包含8个位点的2个多重PCR体系，分别命名为多重PCR反应体系1和多重PCR反应体系2。多重PCR反应体系1为每个PCR反应总体积15μL，包括100ng基因组DNA，10×PCR缓冲液1.5μL，Mg²⁺(1.5mM)，1UTaq酶，dNTP0.2mM。Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1引物分别为0.25μM。反应条件为：95℃变性5min；95℃变性45s，58℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环；95℃变性30s，55.5℃退火50s，72℃延伸50s，25个循环；95℃变性30s，50℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环，72℃延伸5min，10℃保存。

多重PCR反应体系2的引物组合为Sma2380、Sma2994、Sma-USC19和Sma226。每个PCR反应总体积15μL：100ng基因组DNA，10×PCR缓冲液1.5μL，Mg²⁺(1.5mM)，1UTaq酶，dNTP0.2mM。Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226引物各0.25μM、0.3μM、0.25μM、0.25μM。PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃变性45s，57℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环；95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸50s，25个循环；95℃变性30s，50℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环，72℃延伸5min，10℃保存。

表2：大菱鲆2个多重PCR体系的引物序列

其中：F正向引物 R反向引物

四)、家系和亲子鉴定

1.确定亲本和家系个体各微卫星位点对应的基因型

通过2个多重PCR反应对11个亲本样品进行PCR扩增，将PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后获得的电泳图。依据电泳图对各微卫星位点等位基因进行分型，根据各引物目的产物大小，以pBR322分子量标准为参照，确定样品在各微卫星位点的基因型，依据等位基因片段由小到大分别命名Sma-USC25-a(315bp)，Sma-USC25-b(343bp)，Sma-USC25-c(420bp)，Sma-USC25-d(432bp)，Sma-USC25-e(452bp)…等，表3为多重PCR体系中各微卫星位点扩增获得的等位基因大小信息。

表3：多重PCR微卫星引物等位基因信息

将亲本样品在每个微卫星引物的扩增条带记录下，建立每个亲本的基因型数据表。表4列出了部分亲本，部分引物的基因型数据表。

表4部分个体基因型数据

	1-1	1-2	1-3	1-4	1-5	1-6	1-7	1-8	1-9	1-10	1-11	1-12	1-13	1-14	1-15
																sma25	be	be	bc	ce	bc	ce	be	ce	ce	ee	ee	be	ee	ee	be
sma100	cc	bc	bc	cc	bb	bc	bc	cc	bc	bb	bb	cc	bc	cc	bc
																sma103	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce	ce
sma29.1	be	be	be	ab	be	be	ab	be	ab	be	be	ab	be	be	be

注：sma25所在的列表示引物名称，1-1所在的行是个体的样品编号，1-1表示家系1的第一个个体，2-1表示家系2的第一个个体；引物和样品的交叉格为样品在此微卫星引物扩增得等位基因信息。

2.确定子代个体微卫星标记基因型

通过2个多重PCR反应对子代样品140进行PCR扩增，将PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后获得的条带进行等位基因分型，根据pBR322Marker作为DNA片段大小的标准，并参照亲本的等位基因的条带来确定子代样品的微卫星标记基因型，

3.聚类分析和家系鉴定

将140个个体基因型数据(基因型数据表参照表5)转换为NTsys软件所需的(0，1)矩阵，矩阵如表5所示：

表5部分个体(0，1)矩阵表

再用NTsys软件计算遗传距离，得到遗传距离矩阵(表6)

表6部分个体遗传距离矩阵

个体	1-1	1-2	1-3	1-4	1-5	1-6
							1-1	0.000000
1-2	0.241162	0.000000
							1-3	0.188647	0.275658	0.000000
1-4	0.567490	0.567490	0.601986	0.000000
							1-5	0.441833	0.154151	0.188647	0.749812	0.000000
1-6	0.275658	0.275658	0.143101	0.447836	0.275658	0.000000

再用NTsys软件根据遗传距离矩阵进行聚类分析，将那些聚在一支的个体认为来源于同一家系，聚在不同支的个体来源于不同家系，从而实现对不同个体的系谱认证。NTsys聚类结果表明，同一家系聚为一支，97.14％个体聚类结果与实际情况一致(图1)。

4.亲子鉴定：

将上述不同家系个体的基因型数据(表5所示的)转换为Cervus2.0软件所需数字基因型格式(表7)进行个体排除率分析和亲子鉴定。

表7将表5的部分基因型数据表转换为数字基因型格式

注：数字代表微卫星位点等位基因片段大小

按照Cervus2.0要求对基因型进行数据转换后，再进行等位基因频率分析(Allelefrequency)(表10)、模拟分析(Simulation analysis)和亲子分析(Parentage analysis)，根据待测个体基因型和亲本基因型之间相关性的大小确定某一个体是哪个亲本的后裔，从而实现对待测个体的亲子鉴定，在双亲未知条件下的累积排除率为96.58％；已知一个亲本的累积排除率为99.71％，亲子分析结果表明96.42％个体找到了他们的父母亲本。

表8微卫星各位点家系遗传信息及排除率

注：样本量为140；NS表示差异不显著；*表示差异显著，P＜0.05；Excl(1)：表示亲本未知排除率；Excl(2)：已知1个亲本的排除率

以上结果表明本发明的微卫星多重PCR方法可以高效的实现对7个大菱鲆家系个体的系谱认证和亲子鉴定，其鉴定准确率达95％以上，能够满足遗传育种中系谱分析和家系管理的要求。

实施例2 多重PCR体系在家系亲子鉴定中的实际应用(对未知来源个体进行系谱分析和亲子鉴定)

利用上面建立的两个多重PCR体系对70尾来自7个不同家系的待测个体进行双盲检测，鉴定70个个体的家系来源，进一步证实两个多重PCR体系在系谱认证和亲子鉴定中应用的可行性，具体步骤如下：

一)、大菱鲆个体DNA提取；

提取方法如实施例1，将70尾样品的DNA稀释至100ng/μl，-20℃保存。

二)、家系和亲子鉴定；

1、获得样品基因型

通过2个多重PCR反应对样品进行PCR扩增，将多重PCR扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染、获得聚丙烯酰胺凝胶电泳图，统计获得样品的基因型数据(见表9)

表9部分双盲个体聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的数字基因型数据(7个个体)

2.聚类分析和家系鉴定

将基因型数据数据转换为NTsys软件所需的(0，1)矩阵，运用NTsys软件和Cervus2.0软件分别计算个体间遗传距离和进行亲子分析。NTsys2.1软件计算获得遗传距离矩阵转化为Mega4.0格式进行70个个体的聚类分析，经过与实际信息比对，聚类结果为95.71％能够找到他们的家系归属(图2)。

3.亲子鉴定

将基因型数据转换为Cervus2.0软件所需数字基因型格式，用于进行亲子鉴定分析，Cervus2.0分析结果显示在双亲未知条件下的累积排除率为94.82％，已知一个父母的累积排除率为99.50％，亲子分析表明70个体中的66个体找到了他们的父母双亲，鉴定准确率为94.29％(表10)。

表10部分双盲个体亲子鉴定结果

注：※表示亲子鉴定结果预期家系不符个体；m表示母本；f表示父本

综上所述，本发明建立的两个微卫星多重PCR体系，能够有效的实现大菱鲆系谱分析和大菱鲆家系个体的亲子鉴定，该方法在信息未知的条件下进行双盲分析其亲子鉴定准确率达94.29％，MEGA聚类分析95.71％个体能够与预期结果一致，因此两个多重PCR体系的建立可以实现在家系选育早期对混合家系群体的管理。

Claims (5)

1.大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于包括：一)、大菱鲆个体DNA提取；二)、大菱鲆多态性微卫星标记筛选和引物合成；三)、大菱鲆多重PCR体系的构建；四)家系和亲子鉴定四个步骤，其中多重PCR反应体系1的微卫星引物为Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1的组合；多重PCR反应体系2的微卫星引物为Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226的组合，各引物信息如下：

2.如权利要求1所述的大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于上述的多重PCR反应体系1和多重PCR反应体系2的微卫星引物为非荧光标记引物。

3.如权利要求1所述的大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于上述多重PCR反应体系1包括100ng基因组DNA，10×PCR缓冲液1.5μL，1.5mMMg²⁺，1U Taq酶，dNTP 0.2mM，引物Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1分别为0.25μM，每个PCR反应总体积15μL；PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃变性45s，58℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环；95℃变性30s，55.5℃退火50s，72℃延伸50s，25个循环；95℃变性30s，50℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环，72℃延伸5min，最后10℃保存。

4.如权利要求1所述的大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于上述的多重PCR反应体系2包括100ng基因组DNA，10×PCR缓冲液1.5μL，1.5mM Mg²⁺，1U Taq酶，dNTP0.2mM，引物Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226分别为0.25μM、0.3μM、0.25μM、0.25μM，每个PCR反应总体积15μl；PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃变性45s，57℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环；95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸50s，25个循环；95℃变性30s，50℃退火50s，72℃延伸50s，10个循环，72℃延伸5min，10℃保存。

5.如权利要求1所述的大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于上述的家系和亲子鉴定步骤是将多重PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后获得的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，利用pBR322分子量标准判定等位基因条带大小，统计分析获得待测个体微卫星标记基因型数据，将上述基因型数据转换成(0.1)矩阵，再采用NTsys软件进行聚类分析，将那些聚在一支的个体认为来源于同一家系，聚在不同支的个体来源于不同家系，从而实现对待测不同个体的家系鉴定；将上述基因型数据转换成数字基因型格式，采用Cervus2.0软件进行分析，根据待测个体基因型和亲本基因型之间相关性的大小确定待测个体是哪个亲本的后裔，从而实现对待测个体的亲子鉴定。

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