CN105063031A - 一种圆口铜鱼微卫星标记及其应用 - Google Patents

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熊美华
闫书祥
邵科
朱滨
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China Three Gorges Corp
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Abstract

本发明涉及8个圆口铜鱼微卫星标记、其扩增引物对及其应用。本发明从圆口铜鱼基因组DNA中筛选了8个微卫星标记，并在微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物进行扩增，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可用于圆口铜鱼的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。

Description

一种圆口铜鱼微卫星标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及8个圆口铜鱼微卫星标记，其扩增引物对及其应用。
背景技术
微卫星DNA，又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以1-6个碱基的短核苷酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA数量极少，对DNA质量要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。
圆口铜鱼(Coreiusguichenoti)，隶属鲤形目Cypriniformes，鮈亚科Gobioninae，铜鱼属Coreius，是一种主要分布于长江上游、金沙江中下游及其部分支流如雅砻江下游的特有鱼类。圆口铜鱼属于典型的河道洄游性鱼类，成熟亲鱼向上溯游到金沙江中下游产卵，受精卵和初孵仔鱼在天然河道漂流才能完成孵化过程并具有主动游泳能力，整个生活史均需在河道中完成。圆口铜鱼成鱼只生活在干流的急流河滩和较流动的洄水沱中，不进入水流缓慢的小支流，而性成熟个体只在金沙江中下游以及雅砻江干流等部分江段发现，该江段也是圆口铜鱼产卵场的分布区域。随着长江上游干支流梯级电站建设的逐步实施，圆口铜鱼栖息地面积日益缩小，生境相互隔离。已建成的葛洲坝工程阻隔了长江中游圆口铜鱼对金沙江繁殖群体的补充通道，同时蓄水运行的三峡工程也对顺流而下的圆口铜鱼幼鱼产生一定的阻隔作用，再加上过度捕捞、环境污染等原因，圆口铜鱼资源严重下降，在1997-2000年的调查中，圆口铜鱼和铜鱼在巴南与万州江段的渔获物总重中分别47％和17％，在2005-2006年的调查中，已下降到36％和8％，因此，对圆口铜鱼的研究和保护工作迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供圆口铜鱼微卫星标记及其扩增引物，即提供8个圆口铜鱼的微卫星标记，以及相应的扩增引物对，为圆口铜鱼的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种技术提供有效的工具。
本发明一个方面提供8个微卫星标记，其核苷酸序列分别如SEQIDNO：1-8之一所示，或为上述核苷酸序列的互补序列。
本发明还提供分别用于扩增上述8个微卫星标记的引物对。优选地，所述引物对设计参数为：引物长度17-25bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65℃，GC含量在40％-60％之间。优选地，上下游序列分别为SEQIDNO：9(CGU006-F)、SEQIDNO：10(CGU006-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的微卫星标记(CGU006)；上下游序列分别为SEQIDNO：11(CGU060-F)、SEQIDNO：12(CGU060-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO：2(CGU060)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDNO：13(CGU068-F)、SEQIDNO：14(CGU068-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO：3(CGU068)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDNO：15(CGU070-F)、SEQIDNO：16(CGU070-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO：4(CGU070)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDNO：17(CGU075-F)、SEQIDNO：18(CGU075-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO：5(CGU075)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDNO：19(CGU076-F)、SEQIDNO：20(CGU076-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO：6(CGU076)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDNO：21(CGU079-F)、SEQIDNO：22(CGU079-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO：7(CGU079)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDNO：23(CGU104-F)、SEQIDNO：24(CGU104-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO：8(CGU104)的微卫星标记。
另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在检测圆口铜鱼种群遗传多样性中的应用。
另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在分析圆口铜鱼亲缘关系中的应用。
另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在圆口铜鱼辅助育种中的应用。
本发明还提供了检测圆口铜鱼种群遗传多样性的方法，包括如下步骤：
(1)提取圆口铜鱼基因组DNA；
(2)微卫星PCR扩增：利用经荧光标记的用于扩增本发明的微卫星标记的引物对，以圆口铜鱼基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；
(3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析；
(4)遗传多样性分析：根据每个圆口铜鱼个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP4.0.10计算遗传多样性参数。
优选地，步骤(1)采用酚-氯仿法提取圆口铜鱼鳍条组织的基因组DNA；
优选地，步骤(2)中所述荧光标记为FAM标记。
本发明从圆口铜鱼基因组DNA中筛选8个微卫星标记，根据微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物并进行扩增，获得的扩增产物具有高度的多态性和稳定性，可用于圆口铜鱼的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
对于实施例中未注明具体条件的实施方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实施指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
1、含有微卫星重复单元的序列的查找
从构建的圆口铜鱼基因文库的序列中用软件SSRHunter1.3进行微卫星重复单元序列的查找；参数设置为查找含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上的序列。共筛选出50个含有微卫星重复单元的序列，并从中设计引物进行多态性的检测。
2、微卫星引物的设计：
从含有微卫星重复单元的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用PrimerPremier5.0进行引物设计。主要参数设置为：引物长度17-25bp，20bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65℃。GC含量一般在40％-60％之间，尽量避免二级结构出现。
3、对设计的引物的扩增产物进行多态性检测：
(1)基因组DNA的提取：
采用酚-氯仿法提取32尾圆口铜鱼鳍条组织的基因组DNA；
(2)微卫星PCR扩增：
用FAM荧光标记上述设计的微卫星引物，扩增圆口铜鱼基因组DNA；反应体系40μL：模板DNA4μL(10ng/μL)，正反向引物各2.0μL(10pmol/μL)，0.4μLEx-Taq酶(5U/μL)，4μL10×PCRbuffer(Mg2+)，3.0μLdNTPs(2.5μmol/μL)，用灭菌双蒸水补足至40μL。
PCR反应在ABI9700PCR仪中进行，扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，各标记退火温度下(各标记退火温度分别如表2所示)复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最终72℃延伸5min。
(3)测序仪检测扩增产物：
将扩增产物避光保存，在ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析以确定圆口铜鱼微卫星标记在不同个体上的等位基因大小。
(4)遗传多样性分析：
根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用GENEPOP4.0.10计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的微卫星标记。
经过多样性检测，本发明共筛选出8个具有遗传多态性的微卫星标记，其核苷酸序列分别如SEQIDNO：1-8所示，其所对应的扩增引物的信息如表1所示。
表1圆口铜鱼微卫星标记及其对应的引物
如表2所示，在32个圆口铜鱼样本中对上述8个微卫星标记进行遗传多样性分析的结果表明：每个微卫星标记的等位基因数目从6到20不等，平均等位基因数目为11.5个，观测杂合度的范围从0.250到0.906，期望杂合度的范围从0.711到0.940。从而证明本发明筛选的微卫星标记和设计的引物具有遗传多态性。
表28个微卫星标记的退火温度、片段长度、多态性等相关信息
本发明的微卫星标记及其扩增引物还可用于圆口铜鱼的遗传多样性、放流效果评估、亲缘关系分析及分子标记辅助育种等领域研究。

Claims (7)

1.圆口铜鱼微卫星标记，其特征在于：
其核苷酸序列分别如SEQIDNO：1-8所示，或
其核苷酸序列与1）中的核苷酸序列互补。
2.用于扩增权利要求1所述的圆口铜鱼微卫星标记的引物对，所述的引物对设计参数为：引物长度17-25bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65℃，GC含量在40%-60%之间。
3.用于扩增权利要求1所述的圆口铜鱼微卫星标记的引物对，其特征在于：其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO：9、SEQIDNO：10所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQIDNO：11、SEQIDNO：12所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQIDNO：13、SEQIDNO：14所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：3所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQIDNO：15、SEQIDNO：16所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：4所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQIDNO：17、SEQIDNO：18所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：5所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQIDNO：19、SEQIDNO：20所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQIDNO：21、SEQIDNO：22所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：7所示的微卫星标记；和/或，其上下游序列分别如SEQIDNO：23、SEQIDNO：24所示，其扩增核苷酸序列如SEQIDNO：8所示的微卫星标记。
4.使用权利要求2或3所述的引物对检测圆口铜鱼种群遗传多样性的方法，包括如下步骤：
（1）提取圆口铜鱼基因组DNA；
（2）微卫星PCR扩增：采用经荧光标记的权利要求2或3所述的引物对，以圆口铜鱼基因组DNA为模板进行PCR，获得圆口铜鱼个体微卫星扩增产物；
（3）测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析；
（4）遗传多样性分析：根据每个圆口铜鱼个体的微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP4.0.10计算遗传多样性参数；
优选地，步骤（1）采用酚-氯仿法提取圆口铜鱼鳍条组织的基因组DNA。
5.权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2或3所述的引物对在检测圆口铜鱼种群遗传多样性中的应用。
6.权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2或3所述的引物对在分析圆口铜鱼亲缘关系中的应用。
7.权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2或3所述的引物对在圆口铜鱼辅助育种中的应用。
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