CN103484454B - 许氏平鮋微卫星dna分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种许氏平鮋微卫星DNA分子标记，包括许氏平鮋微卫星(CA)16、(GA)16富集文库的构建和含有微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，确定了10个多态性丰富的微卫星标记SS101、SS102、SS103、SS104、SS105、SS106、SS107、SS108、SS109、SS110。本发明提供了10个许氏平鮋的新的微卫星位点及扩增这10个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于许氏平鮋的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域，是一种可靠有效的分子标记。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种许氏平鮋微卫星位点及引物。
背景技术
微卫星DNA，又称作短串连重复（STRs）、简单重复序列（SSRs）、简单序列长度多态性（SSLP），是指基因组中以1~6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型（pure）、复合型（compound）和间断型（interrupted）。例如：
单一型：AGAGAGAGAGAGAGAG；
复合型：AGAGAGAGAGACACAC；
间断型：AGAGAGTTAGAGAGTT。
微卫星标记具有分布广泛、多态性信息容量高、呈共显性、符合孟德尔分离规律、易于PCR扩增、再现性好等优点，已经被广泛应用于海洋生物的群体遗传结构分析、亲权鉴定、遗传连锁图谱构建、功能基因定位和遗传育种等领域。
许氏平鮋(Sebastes schlegeli)，又名黑鮶，俗称黑寨、黑鱼、黑头鱼、黑石斑、黑老婆、黑石鲈，隶属于鮋形目、鮋科、平鮋属，是一种温水性岩礁鱼类。主要分布于西太平洋中部和北部，在黄海和东海、朝鲜半岛、日本、鄂霍次克海南部均有分布。许氏平鮋肉质细嫩，味道鲜美，一直是我国北方海域重要的海捕经济鱼类。由于具有抗病力强、生长速度快、耐低温、在北方海域可以自然越冬等特点，许氏平鮋已成为我国北方海水网箱养殖和池塘养殖的主要经济鱼类之一。而且黑鮶是近海礁栖性鱼类，营半定居式生活，人工增殖放流回捕率高，近年来逐渐成为我国增殖放流的重要海水鱼类。但目前养殖的苗种仍以海捕野生苗为主，存在养殖成活率低，破坏野生资源等问题。为了保护许氏平鮋的野生种质资源，增加人工养殖效率，对其进行种质资源现状分析、亲权鉴定、遗传连锁图谱构建及遗传育种等相关工作已经非常迫切。但是目前针对许氏平鮋开发并正式发表的微卫星标记还很少，仅有4篇相关文献： Yoshida 等人(Yoshida et al, Moleculer
ecology notes, 2005, 5, 416)利用同位素标记的(GT)10探针对部分基因组文库进行杂交筛选的方法，开发了6对微卫星引物；An 等人(An et al. , Conservation
genetics, 2009, 10, 1969)利用生物素标记的(CA)12探针杂交和磁珠富集相结合的方法，开发了14对微卫星引物；Bai 等人(Bai et al., Genetics and
molecular research, 2011, 10, 2065)利用生物素标记的(GT)13探针杂交和磁珠富集相结合的方法，开发了18对微卫星引物；Yasuike 等人(Yasuike et al.,
Conservation genetics resources , 2012, 5, 577)利用454测序技术得到了部分三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复的微卫星序列，开发了17对多态性微卫星引物。因此，需要开发更多微卫星标记来满足良种选育相关的遗传分析的需要。
发明内容
本发明的目的是提供许氏平鮋微卫星位点及多态性引物，即提供10个许氏平鮋的微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为许氏平鮋群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种提供有效的工具。
本发明解决技术问题的技术方案：许氏平鮋微卫星位点DNA分子标记，包括构建许氏平鮋微卫星（CA）16、（GA）16富集文库，筛选许氏平鮋多态性微卫星引物及利用一个野生群体对其这些微卫星位点进行遗传多态性检测，确定了许氏平鮋10个多态性丰富的微卫星标记：SS101、SS102、SS103、SS104、SS105、SS106、SS107、SS108、SS109、SS110，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1—NO.10所示。
所述10个多态性丰富的微卫星标记的引物序列是从序列SEQ ID NO.1—NO.10的微卫星重复序列两端的侧翼保守序列上分别设计的正向、反向引物，分别为SEQ ID NO.11—NO.30所示。
微卫星位点、位点序列和对应的引物信息如表1。
表1:10个微卫星位点及对应引物信息。
| 位点 | 微卫星序列 | 正向引物名称/序列 | 反向引物名称/序列 |
| SS101 | SEQ ID NO.1 | SS101p1/ SEQ ID NO.11 | SS101 p2/ SEQ ID NO.12 |
| SS102 | SEQ ID NO.2 | SS102 p1/ SEQ ID NO.13 | SS102 p2/ SEQ ID NO.14 |
| SS103 | SEQ ID NO.3 | SS103 p1/ SEQ ID NO.15 | SS103 p2/ SEQ ID NO.16 |
| SS104 | SEQ ID NO.4 | SS104 p1/ SEQ ID NO.17 | SS104 p2/ SEQ ID NO.18 |
| SS105 | SEQ ID NO.5 | SS105 p1/ SEQ ID NO.19 | SS105 p2/ SEQ ID NO.20 |
| SS106 | SEQ ID NO.6 | SS106 p1/ SEQ ID NO.21 | SS106 p2/ SEQ ID NO.22 |
| SS107 | SEQ ID NO.7 | SS107 p1/ SEQ ID NO.23 | SS107 p2/ SEQ ID NO.24 |
| SS108 | SEQ ID NO.8 | SS108 p1/ SEQ ID NO.25 | SS108 p2/ SEQ ID NO.26 |
| SS109 | SEQ ID NO.9 | SS109 p1/ SEQ ID NO.27 | SS109 p2/ SEQ ID NO.28 |
| SS110 | SEQ ID NO.10 | SS110 p1/ SEQ ID NO.29 | SS110 p2/ SEQ ID NO.30 |
附图说明
图1：SS101位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图2：SS102位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图3：SS103位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图4：SS104位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图5：SS105位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图6：SS106位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图7：SS107位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图8：SS108位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图9：SS109位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
图10：SS110位点的特异性引物扩增32个许氏平鮋个体的银染PAGE图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明：
1、许氏平鮋微卫星DNA富集文库的构建
1.1基因组DNA的提取与酶切
取酒精固定的许氏平鮋肌肉组织30mg，用蒸馏水浸泡4次，每次20min后换水，以彻底除去肌肉中残存的酒精。将肌肉充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K（10mg/ml），在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5 h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚（200μL）、氯仿/异戊醇（24:1）（200μL）混合液抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70%酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。用限制性核酸内切酶Sau3AI酶切基因组。1%的琼脂糖凝胶电泳后，胶回收试剂盒回收400-1000bp的DNA片段；
1.2 连接接头和第一次PCR扩增
寡核苷酸链A(Sau 3AI-L: 5’-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3’)和B(Sau 3AI-R: 5’-GATCCCAAGCTTCCCGGGTACCGC
-3’)溶液各10μl于PCR小管中混合，在95℃变性10min，然后自然冷却。酶切产物与双链接头的连接采用T4 DNA接酶，16℃过夜连接。以连接产物为模板，Sau 3AI-L为引物进行第一次PCR扩增，25uL反应体系如下：12.5uLGoTaq®Green Master
Mix(Promega公司)，2.5uL引物，2uL连接产物，加灭菌水补至25uL。PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复25次，72℃延伸10min。对PCR产物进行胶回收，回收400bp以上的片段并去除多余的引物、dNTP等；
1.3 磁珠富集及第二次PCR扩增
将胶回收产物与生物素标记的寡核苷酸探针(CA)16、(GA)16在58℃杂交2小时。用链霉亲和素包裹的磁珠(Streptavidin
MagneSphere®Paramagnetic Particles(PMPs)(Promega公司)捕获含有微卫星核心的DNA单链，再通过多次洗脱去除非目的片段，最后通过95℃变性5分钟收集含有微卫星核心的片段。以磁珠富集产物为模板，Sau 3AI-L为引物进行第二次PCR扩增，反应体系和程序第一次PCR。用PCR产物纯化试剂盒（天根生物公司）对第二次PCR产物进行纯化；
1.4 连接转化
将第二次PCR纯化产物与pGEM-T Easy载体（Promega公司）进行连接，4℃连接过夜。转化入JM109感受态细胞；
1.5 三引物法检测阳性克隆、测序及引物设计
挑取单菌落到96孔培养板中，进行扩大培养。用SP6、T7和核心为引物，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。取PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，出现两条或两条以上的为含有微卫星核心的阳性克隆，利用ABI3730进行单向或双向测序。用Primer5.0对获得的微卫星序列共设计了35对微卫星引物，对这些引物进行PCR扩增检测，最终有20对引物能稳定扩增出目的条带；
2、许氏平鮋多态性微卫星引物的筛选及结果分析
2.1 筛选有多态性的引物
按1.1方法提取32尾许氏平鮋个体的基因组DNA，然后1.5得到的微卫星引物进行RCR扩增。扩增反应体系为25uL，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染法染色，UMAX扫描仪进行扫描。共得到10个具有多态性的微卫星标记（见表2）：SS101、SS102、SS103、SS104、SS105、SS106、SS107、SS108、SS109和SS110。SS101为592个核苷酸，SS102为304个核苷酸，SS103为291个核苷酸，SS104为586个核苷酸，SS105为521个核苷酸，SS106为706个核苷酸，SS107为864个核苷酸，SS108为411个核苷酸，SS109为503个核苷酸，SS110为542个核苷酸；
2.2 结果分析
使用POPGENE软件计算等位基因数、观察杂合度和期望杂合度。使用Genepop 4.0软件计算哈代-温伯格平衡及连锁不平衡的值，以此来描述10个许氏平鮋微卫星DNA多态位点的特征。
由附图1-10可知，本发明的10个微卫星序列的长度在供试的32个许氏平鮋中都出现了多态性，由此可见，这10个微卫星标记今后能用于许氏平鮋的种质资源评价和遗传连锁图谱构建等工作。
本发明提供了10个许氏平鮋的新的微卫星位点及扩增这10个微卫星位点的引物序列，可应用于许氏平鮋的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
表2引物特性表
| 位点 | 微卫星核心 | 引物序列(5′-3′) | 退火温度 |
| SS101(1-4) | (GT)21 | CTGTAATGCCTATTTCTCGTTGAAACCTGGATGAGAC | 60 |
| SS102(1-15) | (CA)3 | CACCGCCGTGTCTGAACAGATTGAAGGAGGGGAAGC | 60 |
| SS103(4-100) | (GT)5N(GT)3N(GT)3 | TTTCCCGTAAGCAGAAGGACCCCATACCAACCCACT | 62 |
| SS104(3-15) | (AC)5 | AGAGGAGGGAAACATAAACCTGCTGCCAAACAACTGA | 60 |
| SS105(3-24) | (TG)12 | AGACTGGAGGGGAGATTATCGAGCAACAGCTTATGT | 60 |
| SS106(3-55) | (CA)21 | GATCAAGGTGAGACTGCTACCGGTCATCATCAGGGTTGC | 60 |
| SS107(4-59) | (CA)21 | CTTCAGGAGCGGTGTTATGTCCGATGTTGTTTCTCG | 62 |
| SS108(4-121) | (CA)12 | AGAACAACGAGGAGGAGAAAACAAAGCGGTGTCTGA | 60 |
| SS109(4-127) | (CA)5N(GT)3N(GT)21 | CGGACTCTTAACATTCAACTCCTTAGGCTGGACAACTCT | 60 |
| SS110(4-123) | (AC)53N(AC)3 | GGCGACCCTTCTATTCTAACTGTGCAGCCTGTGATG | 62 |
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省海洋水产研究所
<120> 许氏平鮋微卫星DNA分子标记
<160> 30
<170> PatentIn version
3.3
<210> 1
<211> 592
<212> DNA
<213> 许氏平鮋(Sebastes schlegeli)
<400> 1
gatcaaatat gaatcaatat tctgttactg taatgcctat ttctcgcgta aaatgttctc 60
agaaacatct tgtagtgtac tgtttagctg taaaatgaga aagtttgctc tggactgtgg 120
gggggtgctt ggtatttcct cctggaggtg caccaggaag ctgagcagtg tgagctggga 180
ctggctccct gcagtccgtc actgtcagtc agctaacagc tcgtctccag ggggcgccac 240
attaatgtgc attcagtgga aatgtcagcc agatgagtca gagtgagata agagctgcag 300
ctaagtgtca cagggctatt taacctttat cgctgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 360
gtgtgtgtgt gtgtgtatct atggtacagt ctcatccagg tttcaactgc agtttttttc 420
tgttaatcct gcaaacgtct tctgtttctc agcagtctgt tcagactctc ttccctaaag 480
acaaacagat ggttaaagca agagttaatt ttttgaaatc tgaaagttta attgttttca 540
gtaattgctc ctgctattca gaatcacctt gaagagaaac gatattacag ta 592
<210> 2
<211> 304
<212> DNA
<213> 许氏平鮋(Sebastes schlegeli)
<400> 2
gatctatccc gaccctgccg acctgccgca ggacccaagg cgcctcggac tgaacacgca 60
caccgccgtg tctgaacacg taacgcacac acgcacgtac gcacacacac aggaacacag 120
gtgttccatg tctcgctgct cctgaccaat cagcatcctc ctctgtgtcg tccaatcaca 180
ggtccacctg gggtcaggtg accccttcac ccccggcttc ccctccttca atcacactca 240
gttcccgccc atccagtcct ccggtctgcc gctcatccca gccctgccga tcagtgccac 300
tgtc
304
<210> 3
<211> 291
<212> DNA
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tttcccgtaa gcagaaggca aggccaagtg tgtgtatgtg tgtgtgtgcg tgtgtgtgtg 120
tgtgtgtgcg tgtgcgtgtg tgtgtgtgcg tgtgtgtgtg tgtgtgactg cgtgggaggg 180
cgagtgggtt ggtatggggt tgggggagca tggagaggag ggggaacaag agctggagag 240
aggaggcgtg gaagcgtggg aggaggagac atcaaagacg aggggaaatc g 291
<210> 4
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ccgcttgtaa agcaatcatt tccccctctc tctctcgctc tctactcccc ctctactccc 120
cccctccaca tccctccggc tgctgggact gctgagtcag ctcaccttca tatggagagt 180
ggctccctca accgagacgt tattgatttg cccctgtttg taagggggaa atgttcccaa 240
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agaggaggga aacataaaca ttgctaccat cacacacatg tactgtatgt acacacacac 360
actatagcac acagatacat tattaatcgc tagattggag caaaaaaagg caggaaaagt 420
atgaacagca acataattac acacatggat acagaggcac atccccgaca caaatacaga 480
aatacgtaca cgtattagtg gtgcatcagt tgtttggcag cagctttgtg aacgctgact 540
tcatactgta tgtgtggtga acagacaagc gtgctgaagt gttaaa 586
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<211> 521
<212> DNA
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cattgagggg gccaaggttg tccagaagga gctgaagaag gagctgaggg cggcaaagga 120
cagctacaaa gacagactgg aggggagatt acaggccgac agctccaggg aggtatgtgt 180
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgg tggtgggggg gataactggc tcaggaagat aactggctac 240
aaacagacaa gccctggtgt tgagcggacc caggaacatg caaatgagct aaaactgttt 300
ttcaacaggt ttgaccaacc aacccccatg agctcagcag gacagcctgg gtcccccact 360
caccaacacc agtgccccct ttccacacct taataaaggt tcatcttatc ttatcttatc 420
acaccagtat attgtgggga ttggtctgca cataagctgt tgctcgaagt ttcattttct 480
gcacacgcat atgaacgtgc acatgaaggc atgacacacg t 521
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<212> DNA
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<400> 6
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cacaggatgt agtgtttcca cttagggatg gttcatggtt tcagatatgc ctctcaagca 120
tttcaagcat gaataacatc tggccggagc cataaatgaa atgtcatgtg aaatattctt 180
cccctccagg tggagcccac atcagacatt gagtcagaag aagaggtgga ggtgactgac 240
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ccaacagctc accatcagct cagtaaccat caccgagcta acggaaacgg gagcagcctc 360
tccgcccccc cacacagcaa ccctgatgat gaccccgatg acgacgagga ggtcttcaag 420
actcccgcca ctccttccgt cggcagcggc agcctggcct tccctctcat caccctgaag 480
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cttctgcaaa tcatataaac atactgtcgt gtgtaggtgt gtttgcgtgt gcacggacgc 300
attgttgcgt gccaaatctc agctcagtgg gctcgttaac ttttatagac tgcagccgga 360
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gacacgcaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaccat tttctctctt 480
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<211> 503
<212> DNA
<213> 许氏平鮋(Sebastes schlegeli)
<400> 9
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ga 542
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> SS101p1
<400> 11
ctgtaatgcc tatttctcg
19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> SS101p2
<400> 12
ttgaaacctg gatgagac 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> SS102p1
<400> 13
caccgccgtg tctgaaca
18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> SS102p2
<400> 14
gattgaagga ggggaagc
18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> SS103p1
<400> 15
tttcccgtaa gcagaagg
18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> SS103p2
<400> 16
accccatacc aacccact
18
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> SS104p1
<400> 17
agaggaggga aacataaac
19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> SS104p2
<400> 18
ctgctgccaa acaactga
18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> SS105p1
<400> 19
agactggagg ggagatta
18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> SS105p2
<400> 20
tcgagcaaca gcttatgt
18
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> SS106p1
<400> 21
gatcaaggtg agactgctac c
21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> SS106p2
<400> 22
ggtcatcatc agggttgc
18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> SS107p1
<400> 23
gttcaggagc ggtgttat
18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> SS107p2
<400> 24
gtccgatgtt gtttctcg
18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> SS108p1
<400> 25
agaacaacga ggagcaga 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> SS108p2
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aaacaaagcg gtgtctga
18
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> SS109p1
<400> 27
cggactctta acattcaact
20
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
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<400> 28
ccttaggctg gacaactct
19
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<211> 18
<212> DNA
<213> SS1010p1
<400> 29
ggcgagcctt ctattcta
18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> SS1010p2
<400> 30
actgtgcagc ctgtgatg
18
Claims (2)
1. 许氏平鮋微卫星DNA分子标记，其特征在于，所述的微卫星标记编号为SS103,其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种许氏平鮋微卫星DNA分子标记，其特征在于上述位点的引物序列为SEQ ID NO.15-16所示。
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| 用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记;于冬梅等;《大连水产学院院报》;20071231;第22卷(第6期);全文 * |
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