CN101921857A - 一种中国地方黄牛Pax7基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测中国地方黄牛Pax7基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法。首先，以包含Pax7基因的黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P(包括P1(F1，R1)和P2(F2，R2))为引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，PCR扩增黄牛Pax7基因；用限制性内切酶消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Pax7基因编码区第3531位G或A的单核苷酸多态性与第56626位G或A的单核苷酸多态性。Pax7基因与家畜的早期骨骼肌发育有关，该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记，为黄牛的标记辅助选育(MAS)提供基础资料，进而可推广至黄牛分子育种领域。

Description

一种中国地方黄牛Pax7基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及中国地方黄牛单核苷酸多态性(SNP)分子标记的筛查和检测，特别涉及一种检测黄牛Pax7基因第3531位与第56626位单核苷酸多态性的方法。

背景技术

分子标记是遗传标记的重要组成部分。遗传标记大致可分为两类：I类是间接反映DNA水平遗传变异的遗传标记，如形态标记、细胞标记和生化标记；II类是直接反映DNA水平遗传变异的分子标记。分子标记之所以能反映DNA水平的遗传变异情况主要是基于被研究的DNA分子由于点突变、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复机制而产生多态性。经过大量研究发现，DNA分子标记有许多特点，如直接以DNA的形式表现、某些标记表现共显性、标记数量多、多态性高等。如今分子标记在生命科学研究领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而提高黄牛的生长速度和改善肉品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

Pax基因家族在人类和小鼠中都存在，它包括Pax1到Pax9的九个家族成员。这些基因在编码蛋白质过程中有转录子调节器的作用。在人和小鼠的先天性疾病发现了Pax基因家族中若干基因的突变，这表明该基因家族在所在组织中的突变可以阻碍生物的生长进程。

Pax7基因定位于人染色体1p36.2～36.12和鼠染色体4。基因全长104064bp，编码486个氨基酸。包含9个外显子8个内含子。Pax7属于Pax基因家族的III组，与中枢神经系统和骨骼肌的发育有关，是强有力的生肌性诱导物，能使多能干细胞转变为生肌性细胞，在骨骼的发育和再生过程中起着至关重要的作用。有研究表明，Pax7基因敲除小鼠的体型比杂合型及野生型小鼠明显偏小。除此之外，Pax7基因突变也与某些疾病有关，Maika G等人发现人Pax7基因内含子发生的401处SNPs与人类横纹肌肉瘤显著相关(Maika G.Mitchell，Diane Tabarini，Melanie Zimanl，Single Nucleotide Polymorphisms associated with the Intronic Cis Regulatory Regions of PAX7：APotential Linkage to Increased Tumorigenesis of Rhabdomyosarcoma elucidated via In Silico Biology and Pyrosequencing，Nature and Science.2006；4(4)：6-20)。

目前，国内外对黄牛的Pax7基因研究甚少，主要集中在人和小鼠等方面，而且大都集中于基因功能方面，关于家畜Pax7基因遗传变异或者SNP研究的研究国内外尚未见报道。因此，对中国地方黄牛Pax7基因遗传变异领域的研究至关重要，并且将该基因位点的遗传变异与黄牛生长性状(如：体重、体高、体长、日增重等性状)关联分析，可以为我国黄牛分子育种提供理论依据。

发明内容

本发明解决的问题在于利用DNA池测序的方法筛查中国地方黄牛Pax7基因的目的DNA序列的多态性，寻找与黄牛生长性状相关的SNP作为分子标记，提供一种黄牛Pax7基因的单核苷酸多态性及其检测方法，以此作为黄牛分子育种和标记辅助选择的分子遗传标记，加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛Pax7基因单核苷酸多态性的方法，以包含Pax7基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，PCR扩增黄牛Pax7基因；然后分别用限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Pax7基因编码区多态性。所述的黄牛Pax7基因多态性包括：

黄牛的Pax7基因第3531位为G＞A的碱基多态性；

黄牛的Pax7基因第56626位为G＞A的碱基多态性。

所述的引物对P1和P2(5’-3’)为：

P1——F1：5’TCTCCCACCTCCACCTCT 3’，18nt(核苷酸)；

R1：5’CTCCCTTCTTCCCTGCTC 3’，18nt(核苷酸)；

P2——F2：5’GGTTGCCATTGCCTCCT 3’，17nt(核苷酸)；

R2：5’TGTGCTATGGTGCGTGCT 3’，18nt(核苷酸)。

用限制性内切酶HinfI消化P1扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Pax7基因第3531位的碱基多态性；

用限制性内切酶BspT104I消化P2扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Pax7基因第56626位的碱基多态性。

所述的PCR扩增的反应程序为：

P1——95℃预变性5min；94℃变性30s，63.2℃退火30s，72℃延伸35s，30～35个循环；72℃延伸10min；

P2——95℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸50s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述的检测P1的琼脂糖凝胶浓度为3.5％，通过电泳判定黄牛Pax7基因第3531位的碱基多态性为：AA基因型表现为385bp条带；AG基因型表现为385，354和31bp条带；GG基因型表现为354和31bp条带。

所述的检测P2的琼脂糖凝胶浓度为2％，通过电泳判定黄牛Pax7基因第56626位的碱基多态性为：GG基因型表现为632bp条带；AG基因型表现为632，343和289bp条带；AA基因型表现为343和289bp条带。

与现有技术相比，本发明把DNA池测序筛查SNP与PCR-RFLP结合起来解决了SSCP的繁琐和不稳定性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，可用于黄牛的分子育种。

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛Pax7基因第3531位和第56626位上的两处同义密码子突变可能产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当第3531位由G突变为A时，原有的编码Ala的密码子GCG发生突变为GCA；相同地，当第56626位由G突变为A时，原有的编码Glu的密码子TCG发生突变为TCA，导致在转录的mRNA在翻译过程由于携带该氨基酸的tRNA丰度不同而影响翻译的效率，从而影响该蛋白的表达量；

本发明对上述两个SNP进行了与黄牛生长性状的关联分析，对5个中国地方黄牛品种中的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，结果表明两个位点均能影响黄牛的体重和日增重，除此之外，黄牛生长环境(如华北和东北)可以影响上述两个位点在群体内的分布情况。

基于Pax7对家畜早期发育的重要作用，对HinfI和BspT104I多态位点与黄牛不同月龄的体重体尺性状之间进行方差分析表明，这两个位点均能影响6月龄的体重性状，因此，上述两个SNP位点可以作为早期标记辅助选育(MAS)的分子标记。

附图说明

图1为黄牛Pax7基因包含第3531位突变位点的HinfI酶切电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3.5％，图中出现的三种条带为：AA基因型表现为385bp条带；AG基因型表现为385，354和31bp条带；GG基因型表现为354和31bp条带。其中，31bp片段太小在图中无法显示；

图2为黄牛Pax7基因第3531位突变位点包含AA、AG和GG三种基因型的测序图；

图3为黄牛Pax7基因包含第56626位突变位点的BspT104I酶切电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为2％，图中出现的三种条带为：GG基因型表现为632bp条带；AG基因型表现为632，343和289bp条带；AA基因型表现为343和289bp条带；

图4为黄牛Pax7基因第56626位突变位点包含GG、AG和AA三种基因型的测序图。

具体实施方式

本发明根据Pax7基因组序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序后得到黄牛Pax7基因的部分序列。根据BLAST序列比对发现两处SNPs，利用PCR-RFLP方法对该SNPs进行检测。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛Pax7基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、样本采集及基因组DNA提取

(1)血液样本的采集

本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群的1226头黄牛作为检测对象，具体采集样本见表1：南阳牛(222)，郏县红牛(398)，秦川牛(210)，鲁西牛(163)和草原红牛(233)。

表1样品来源

(2)血样基因组DNA的提取

1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0。4℃保存备用。

3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

2、DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从南阳牛品种30个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

按照同样的方法也构建郏县红牛、秦川牛、鲁西牛和草原红牛品种DNA池。

3、设计包含Pax7基因外显子3和外显子5的多态性引物

从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得海福特牛的GenBank登录号为：NC_007300的基因Pax7DNA序列，利用Primer 5.0设计扩增黄牛Pax7基因外显子3和外显子5的两对引物，其引物对序列如下：

P1——F1：5’TCTCCCACCTCCACCTCT 3’，18nt(核苷酸)；

R1：5’CTCCCTTCTTCCCTGCTC 3’，18nt(核苷酸)；

P2——F2：5’GGTTGCCATTGCCTCCT 3’，17nt(核苷酸)；

R2：5’TGTGCTATGGTGCGTGCT 3’，18nt(核苷酸)。

4、PCR克隆黄牛Pax7基因

分别以5个黄牛品种的DNA池为模版，用上述设计的引物对其进行PCR扩增，PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

PCR反应程序：

P1：95℃预变性5min；94℃变性30s，63.2℃退火30s，72℃延伸35s，33个循环；72℃延伸10min；

P2：95℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸10min。

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以五个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送南京金斯瑞测序有限公司进行双向测序。对黄牛Pax7基因外显子3目的片段385bp和外显子5目的片段632bp的测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变，序列中有两处发生了单核苷酸的突变，均出现了G、A两种检测结果，即本发明筛查到了黄牛Pax7基因的2个SNP多态性，分别为：黄牛的Pax7基因第3531位为G或A的碱基多态性，黄牛的Pax7基因第56626位为G或A的碱基多态性，如图2(AG型)、图4(AG型)。

黄牛Pax7基因第3531位点及第56626位点都发生了由G到A的突变，可以表示为G＞A。

b、黄牛Pax7基因多态位点的PCR-RFLP检测

1、多态位点分析

当Pax7基因第3531位点发生G＞A突变时，原来的HinfI限制性内切酶识别序列GANTC也相应地变成

ANTC，从而破坏了HinfI限制性内切酶识别序列；同样地，当第56626位点无论发生G＞A突变时，原来的BspT104I限制性内切酶识别序列TTCGAA也相应地变成TTC

AA，从而破坏了BspT104I限制性内切酶识别序列，因此，所述的两处SNPs可以用HinfI-PCR-RFLP和BspT104I-PCR-RFLP方法直接检测。

2、PCR产物酶切及RFLP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别进行HinfI和BspT104I酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

1)酶切体系为20μL，包括：1μL(10U/μL)限制性内切酶，10μL PCR产物，2μL酶切Buffer，7μL灭菌蒸馏水。

2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

3)酶切消化后将样品置于65℃水浴5min终止酶切反应，120V电压进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测酶切结果，用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。由于P1扩增外显子3的385bp片段中不包含其它的HinfI酶切识别位点，因此含“G”的PCR扩增片段会被切为两个片段；P2扩增外显子5的632bp片段中不包含其它的BspT104I酶切识别位点，因此含“G”的PCR扩增片段也会被切为两个片段。

4)由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的Pax7基因第3531位和第56626位发生突变时经PCR-RFLP检测其各种基因型，结果为：

如图1所示，经3.5％琼脂糖凝胶电泳检测分析，泳道1和泳道3不包含385bp条带，表现为AA基因型个体，泳道2同时包含385bp、354bp和31bp条带，为杂合子AG基因型个体，泳道4包含354bp和31bp条带，为GG基因型个体，泳道M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。注：由于胶浓度较大，31bp无法显示。

如图3所示，经2％琼脂糖凝胶电泳检测分析，泳道1和泳道2包含632bp条带，表现为GG基因型个体，泳道3同时包含632bp、343bp和289bp条带，为杂合子AG基因型个体，泳道4包含343bp和289bp条带，为AA基因型个体，泳道M为D2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。

5)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对所述的两处多态位点的不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明：对于HinfI位点，杂合子AG基因型个体第3531位的测序图的确表示为A或G，如图2a所示，自左向右第7个峰为两个峰，而GG基因型、AA基因型分别为G、A，如图2b、c所示；对于BspT104I位点，杂合子AG基因型个体第56626位的测序图的确表示为A或G，如图4a所示，自左向右第6个峰为两个峰，而GG基因型、AA基因型分别为G、A，如图4b、c所示。

c、黄牛Pax7基因SNP位点的频率统计及其与生长性状关联分析

1、基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。统计结果见表3。

表3基因及基因型频率统计

从表4中可以看出，在HinfI位点，等位基因型A的频率变化范围为0.336～0.584，等位基因型G的频率变化范围为0.416～0.664；在BspT104I位点，等位基因型A的频率变化范围为0.349～0.659，等位基因型G的频率变化范围为0.341～0.651。对于所述的两个位点，在NY、JX、QC和LX牛中G为优势等位基因型，而草原红牛群体内A为优势等位基因型，这说明基因型分布受黄牛生长环境的影响。

2、基因效应的关联分析

基因型数据：HinfI识别的基因型(AA、AG和GG)

            BspT104I识别的基因型(GG、AG和AA)

生产数据：南阳牛6月龄、12月龄、18月龄和24月龄的各种生长性状(包括体重、日增重、体高、体长和胸围)。

关联分析模型：

利用SPSS(16.0)软件分析基因位点的各种基因型和年龄与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+Age_j+Xn+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；Genotype_i为各个位点的基因型效应；Age_m为年龄效应；Xn为两个因素的互作效应：Age×Genotype，e_ij为随机误差；运用SPSS(16.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间生长性状进行差异显著性检验，结果见表4。

表4两个位点不同基因型与性状关联分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

结果表明，在BspT104I检测的SNP位点，三种基因型对不同月龄的黄牛生长性状影响均不显著(P＞0.05)；在HinfI检测的SNP位点，AG型6月龄个体的体重和日增重都明显高于AA型和GG型个体，且表现显著水平，而其各种基因型与12，18和24月龄的各种生长性状都不显著相关。

因此，本发明首次成功利用HinfI和BspT104I PCR-RFLP方法检测了中国地方黄牛Pax7基因的SNP位点。并通过关联分析验证，HinfI位点的AG基因型可以作为黄牛早期分子育种的分子标记。

Claims (6)

1.一种中国地方黄牛Pax7基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，以中国地方黄牛基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg⁺⁺、dNTPs存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用HinfI和BspT104I限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定黄牛单核苷酸多态性。

所述的聚合酶链式反应引物见下表：

2.权利要求1所述的黄牛Pax7基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：

P1——95℃预变性5min；94℃变性30s，63.2℃退火30s，72℃延伸35s，30～35个循环；72℃延伸10min；

P2——95℃预变性5min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸50s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，用于检测第3531位点的限制性内切酶为HinfI；用于检测第56626位点的限制性内切酶为BspT104I；

酶切体系为20，包括：1μL(10U/μL)限制性内切酶，10μL PCR产物，2μL酶切Buffer，7μL灭菌蒸馏水。

4.根据权利要求1所述的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，中国地方黄牛Pax7基因编码区的多态性包括：基因组第3531位Exon3的G＞A突变与基因组第56626位Exon5的G＞A突变。

5.权利要求1所述的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶浓度为3.5％，通过电泳判定黄牛Pax7基因第3531位的碱基多态性为：AA基因型表现为385bp条带；AG基因型表现为385、354和31bp条带；GG基因型表现为354和31bp条带。

6.权利要求1所述的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶浓度为2％，通过电泳判定黄牛Pax7基因第56626位的碱基多态性为：GG基因型表现为632bp条带；AG基因型表现为632、343和289bp条带；AA基因型表现为343和289bp条带。

Images