CN101921848B

CN101921848B - 一种检测黄牛mgat2基因单核苷酸多态性的方法

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Publication number: CN101921848B
Application number: CN2010102369027A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 屈炼; 杨明娟; 刘俊霞; 蓝贤勇; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2010-07-26
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2030-07-26
Also published as: CN101921848A

Abstract

本发明公开了一种检测的黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法，以包含MGAT2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛MGAT2基因；用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛MGAT2基因第495位的单核苷酸多态性。由于MGAT2基因功能涉及体重、日增重生长等性状，本发明提供的检测方法为MGAT2基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法。

背景技术

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。

根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性(Coding-region SNPs，cSNPs)、基因周边单核苷酸多态性(Perigenic SNPs，pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(Intergenic SNPs，iSNPs)。

研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP(Synonymous cSNP)，即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP(Non-Synonymous cSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection，MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在肉牛育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。

MGAT2基因是脂肪沉积过程中合成二酰甘油(DAG)的重要基因。食物中的脂肪要进入体内，必须在胰脂肪酶的作用下发生水解，水解的代谢产物脂肪酸、2-单酰甘油在单酰甘油转移酶(MGAT)的催化作用下再合成DAG，进而被二酰甘油转移酶(DGAT)催化合成三酰甘油(TAG)而储存在体内。MGAT催化合成DAG，是合成TAG的第一步，因而在一定程度上MGAT决定了食物中的脂肪能否被机体所吸收，此外，MGAT催化合成的DAG是合成磷脂的前体，同时，DAG还是细胞内重要的信号分子。总之，MGAT2基因与脂肪代谢、脂类在组织中的沉积以及细胞内的信号转导密切相关，因此，研究中国地方黄牛MGAT2基因的遗传变异和分子遗传特征具有重要的理论和实践意义。

目前，对于MGAT2基因的研究多在小鼠和人类上，并主要对其功能进行了大量研究。中国地方黄牛MGAT2基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：体重、日增重等性状)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种检测的黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法，以包含MGAT2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛MGAT2基因；用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛MGAT2基因第495位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：cttgaaacgg caacccaccc act 23bp；

下游引物：agcccagcct gccttacgta aggc 24bp。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性4min；94℃变性30s，69℃退火30s，72℃延伸15s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为3％琼脂糖凝胶电泳。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛MGAT2基因第495位的单核苷酸多态性为：：TT基因型表现为237bp条带；TG基因型表现为237bp和213bp条带；GG基因型表现为213bp条带。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据MGAT2基因的序列设计引物，分别以3种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，将测序后得到的黄牛MGAT2基因的部分序列与NCBI公布的序列进行比较，发现在MGAT2基因的第495位存在SNP多态性。当MGAT2基因第495位的T突变为G时，导致编码第28位的密码子由ATT突变为ATG，从而形成错义密码子突变，即由28Ile突变为28Met，这样使得翻译过程中所编码的氨基酸发生了改变。

针对上述第495位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物P进行PCR扩增后，用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性：

当495bp由T突变为G时，PCR扩增MGAT2基因产物的第494bp～498bp序列为GGCC，形成了限制性内切酶HaeIII的酶切位点，当在495位点不突变时，PCR扩增MGAT2基因产物的第494bp～498bp序列为TGCC，限制性内切酶HaeIII不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。由于MGAT2基因功能涉及初生重、体重、日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状，本发明提供的检测方法为MGAT2基因的SNP与黄牛部分生长性状(初生重、体重和日增重)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛早期体重的分子标记。以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛MGAT2基因PCR产物电泳结果；

图2为黄牛MGAT2基因包含第495位的多态位点的237bp PCR产物的HaeIII酶切电泳结果；

图3a、图3b和图3c为黄牛MGAT2基因SNP的不同基因型测序图。

具体实施方式

本发明通过对黄牛MGAT2基因第495位点错义突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。下面结合具体样本的检测和性状关联对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛MGAT2基因含第一外显子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(NC_007313.4，Region：54835024-54847263)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含黄牛MGAT2基因第一外显子区域的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物：cttgaaacgg caacccaccc act；

下游引物：agcccagcct gccttacgta aggc；

以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛MGAT2基因(NC_007313.4序列)5′UTR及第一外显子区域第283bp～519bp的237bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示，其中，泳道1～6为检测片段，泳道M为Marker；对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第471bp～519bp的序列为如下所示：

CCTGTACTGG ATCTTCTGCT TC

GCCTT ACGTAAGGCAGGCTGGGCT；

经过分析，发现MGAT2基因第一外显子区域第495位(即MGAT2基因CDS区第84位)存在SNP多态性：当MGAT2基因第495位的T突变为G时，导致编码第28位的密码子由ATT(如框线所示序列)突变为ATG，从而形成错义密码子突变，即由28Ile突变为28Met。

当495bp由T突变为G时，PCR扩增MGAT2基因产物的第494bp～498bp序列为GGCC，形成了限制性内切酶HaeIII的酶切位点，当在495位点不突变时，PCR扩增MGAT2基因产物的第494bp～498bp序列为TGCC，限制性内切酶HaeIII不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的MGAT2基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：陕西秦川牛(265)，河南平顶山市郏县红牛(428)，河南南阳牛(250)。

表1黄牛样本的采集及其来源

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

15μL PCR反应体系为包括0.375U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 7.50μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含MGAT2基因的黄牛基因组DNA 0.50μL，10pmol/μL上、下游引物各0.30μL；

具体为：灭菌超纯水(H₂O)，6.25μL；2×Buffer(内含Mg²⁺、dNTPs等)，7.50μL；引物P上游引物(10pmol/L)μL，0.30；引物P下游引物(10pmol/L)，0.30μL；Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)，0.15μL；DNA模板(50ng/μL)，0.50μL；总体积15.00μL。

PCR反应程序：

对3个黄牛品种的943个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得943个个体的黄牛MGAT2基因中包含该SNP位点的237bp的DNA片段。

c、HaeIII酶切消化PCR扩增的MGAT2基因片段

1、HaeIII酶切反应消化体系(25～30μL)∶10～15μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，HaeIII(10U/μL)1.0～1.5μL，灭菌纯水(H₂O)11.5～16.5μL。

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

d、HaeIII消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳60min，电泳结束后EB染色；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性：

MGAT2基因的第495bp由T突变为G时，PCR扩增的MGAT2基因产物的第494bp～498bp序列为GGCC，限制性内切酶HaeIII识别后在GG/CC对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而MGAT2基因的第495bp没有发生突变，限制性内切酶HaeIII不能识别，扩增片段不能被切割；

由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的MGAT2基因的第495位的SNP的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

TT基因型表现为237bp条带；TG基因型表现为237bp和213bp条带；GG基因型表现为213bp条带；由于25bp较小，在琼脂糖电泳分析中不太清楚，但通过237bp和213bp这两条条带还是能够准确的鉴别TT基因型、TG基因型和GG基因型：不包含213bp条带的为TT基因型个体；不包含237bp条带为GG基因型个体；同时包含237bp和213bp条带为TG基因型个体。

如图2所示的酶切后的凝胶电泳检测结果，其中，泳道4包含237bp和213bp条带，其为TG基因型个体，泳道1、泳道3、泳道5、泳道6和泳道7不包含213bp条带，为TT基因型个体，泳道2不包含237bp条带，为GG基因型个体，泳道M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。

4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含237bp和213bp条带的杂合子TG基因型个体其495位的测序图的确表示为T或G，如图3a所示，自左向右第8个峰为两个峰，而GG基因型、TT基因型分别为G、T，如图3b、3c所示。

e、黄牛MGAT2基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位点的TT基因型频率；N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_T＝(2N_TT+N_Ta1+N_Ta2+N_Ta3+N_Ta4+......+N_Tan)/2N

式中，P_T表示等位基因T频率，N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数量，N_Tai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1-an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。

本研究所涉及的等位基因为T和G，所以具体的基因频率计算公式为：

P_G＝(2N_GG+N_TG)/2N

P_T＝(2N_TT+N_TG)/2N

式中，P_T，P_G分别表示等位基因T和G等位基因的频率，N_TT、N_TG和N_GG分别表示TT、TG和GG基因型的个体数量，N表示总群体数目。

如表2所示的基因频率分布表，在不同黄牛品种MGAT2基因SNP中的T等位基因频率变化幅度在69.0％～87.4％，G等位基因频率变化幅度在12.6％～31.0％之间。

表2黄牛MGAT2基因第495位SNP基因频率分布表

f、黄牛MGAT2基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：HaeIII识别的基因型(TT、TG和GG)

生产数据：南阳牛初生重，以及6月龄、12月龄、18月龄和24月龄的体重和日增重数据。

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SAS(9.1)软件的GLM过程分析基因型和瓶中对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明(见表3)：在6月龄TT基因型的个体体重和日增重均高于GG和TG基因型个体且TT基因型与GG基因型间差异到达了显著(P＜0.05)；而在出生重和12、18、24月龄三种基因型的个体在体重和日增重性状上差异不显著(P＞0.05)。说明TT基因型可以作做为一个提高黄牛早期体重和日增重的候选分子遗传标记。

表3MGAT2基因第495位多态位点与南阳牛各月龄体重和日增重之间的方差分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

Claims

1.一种检测黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含MGAT2基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛MGAT2基因；用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛MGAT2基因第495位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：cttgaaacgg caacccaccc act 23nt；

下游引物：agcccagcct gccttacgta aggc 24nt。

2.如权利要求1所述的检测黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

3.如权利要求1所述的检测黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为3％琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的检测黄牛MGAT2基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛MGAT2基因第495位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为237bp条带；TG基因型表现为237bp和213bp条带；GG基因型表现为213bp条带。