CN101921856B

CN101921856B - 一种检测黄牛angptl4基因单核苷酸多态性的方法

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Publication number: CN101921856B
Application number: CN2010102556589A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 侯飞; 马云; 李荣荣; 朱金龙; 蓝贤勇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2010-08-18
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-08-18
Also published as: CN101921856A

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法，以包含ANGPTL4基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛ANGPTL4基因；用限制性内切酶MspI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛ANGPTL4基因第1422位的单核苷酸多态性。由于ANGPTL4基因功能涉及体重、日增重、体斜长和胸围4个重要的生长性状，本发明提供的检测方法为ANGPTL4基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛ANGPTL4(类血管生长因子4)基因单核苷酸多态性的方法。

背景技术

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。

根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性(Coding-region SNPs，cSNPs)、基因周边单核苷酸多态性(Perigenic SNPs，pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(Intergenic SNPs，iSNPs)。

研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP(Synonymous cSNP)，即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP(Non-Synonymous cSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection，MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。在肉牛育种中，人们期望，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。

ANGPTL4(类血管生长因子4)属于类血管生成素基因家族成员之一，也称禁食诱导的脂肪因子，它是过氧化物增殖体激活受体PPARγ的靶基因。而PPARγ主要参与脂肪形成，促进脂肪的分化和调控特殊脂肪细胞基因的表达。ANGPTL4基因可以抑制脂蛋白脂肪酶的活性，正调控血浆甘油三酯水平，促进脂肪动员，抑制脂肪贮存。ANGPTL4能促进血管生成，并对脂质代谢的调节具有重要作用。同时，ANGPTL4在动脉粥样硬化、2型糖尿病、肝癌、代谢综合征等的发生和发展中有重要作用。因此，研究哺乳动物ANGPTL4基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。

目前，对于ANGPTL4基因的研究多在小鼠和人类上，主要在肝癌，脂蛋白脂酶抑制方面做了大量研究。国内外未见关于黄牛ANGPTL4基因遗传变异的研究。中国黄牛ANGPTL4基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：初生重、日增重、体重等性状)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种检测的黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法，寻找与经济性状关联的SNP作为分子标记，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法，以包含ANGPTL4基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛ANGPTL4基因；用限制性内切酶MspI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛ANGPTL4基因第1422位的单核苷酸多态性；

上游引物：tgcgaatcca gaatctac 18nt；

下游引物：agcaaaaggt tggacact 18nt。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；30～35个循环94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛ANGPTL4基因第1422位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为292bp条带；TC基因型表现为292bp、179bp和113bp条带；CC基因型表现为1179bp和113bp条带。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明对黄牛ANGPTL4基因第1422位点上的错义突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当第1422位点由T突变为C时，三联密码CTG改变为CCG，在转录过程相应位置的蛋白质编码氨基酸发生改变(由Leu突变为Pro)，使具有重要生理功能的ANGPTL4基因所编码蛋白的空间二、三级构型发生变化，以至影响蛋白的生物学功能。

本发明提供的黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性检测方法，针对第1422位点由T突变为C突变的检测，通过内切酶MspI的识别来判断是否发生了突变，再通过电泳检测分型可以准确、快速、方便的检测ANGPTL4基因单核苷酸多态性：TT基因型表现为292bp条带；TC基因型表现为292bp、179bp和113bp条带；CC基因型表现为179bp和113bp条带；进而对3个黄牛群体的SREBP1c基因SNP的等位基因和基因型频率的变化监控。

由于ANGPTL4基因功能涉及初生重、体重、日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状，本发明提供的检测方法为ANGPTL4基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为黄牛ANGPTL4基因PCR产物电泳

图2为黄牛ANGPTL4基因包含第1422位的多态位点的279bp PCR产物的MspI酶切电泳结果；

图3为黄牛ANGPTL4基因SNP的不同基因型测序图。

具体实施方式

本发明利用对黄牛ANGPTL4基因第1422位点错义突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。下面结合具体样本的检测和性状关联对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛ANGPTL4基因含第三外显子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(NC_007305)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含黄牛ANGPTL4基因第九外显子区域的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物P1：tgcgaatcca gaatctac 18nt；

下游引物R1：agcaaaaggt tggacact 18nt；

以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛ANGPTL4基因(NC_007305序列)第三外显子区域第1243bp～1535bp的292bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示，泳道M为Marker；对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第1243bp～1303bp的序列(5’＞3’)如下所示：

atggatcacc tggcccccag gcac

ggc cacgagatgg ccaagcccgc caggaggaa；

当第1422bp(即ANGPTL4基因CDS区第476位)的T突变为C时，密码子由CTG(如框线所示序列)突变为CCG，从而形成错义密码子突变，即由Leu突变为Pro。

当第1422bp由T突变为C时，PCR扩增ANGPTL4基因产物的第1419bp～1423bp序列为ccgg，形成了限制性内切酶MspI的酶切位点，当在1422位点没有突变时，PCR扩增ANGPTL4基因产物的第1419bp～1423bp序列为ctgg，限制性内切酶MspI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的ANGPTL4基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南平顶山市郏县红牛(414)，河南南阳牛(215)，陕西秦川牛(230)；

表1黄牛样本的采集

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		灭菌超纯水(H₂O)	10.8
2×buffer(内含Mg²⁺、dNTPs等)	12.5
		引物P上游引物(10pmol/L)	0.5

引物P下游引物(10pmol/L)	0.5
		Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)	0.25
DNA模板(50ng/μL)	0.45
		总体积	25

25μL反应体系包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含ANGPTL4基因的黄牛基因组DNA 0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min；

对3个黄牛品种的859个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得859个个体的黄牛ANGPTL4基因中包含该SNP位点的292bp的DNA片段。

c、MspI酶切消化PCR扩增的ANGPTL4基因片段

1、MspI酶切反应消化体系(25～30μL)：10～15μLPCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，MspI(10U/μL)为1.0～1.5μL，灭菌纯水(H₂O)11.5～16.5μL；

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

d、MspI消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

1)将PCR扩增片段进行10％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)检测，点样后200V电压电泳50min，电泳结束后EB染色；

2)用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像照相分析，并人工判型；

ANGPTL4基因的第1422bp由T突变为C时，PCR扩增的ANGPTL4基因产物的第1243bp～1535bp序列为ccgg，限制性内切酶MspI识别后在c/cgg对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而ANGPTL4基因的第1422bp没有发生突变，限制性内切酶MspI不能识别；

具体凝胶成像结果如如图2所示，图中TT基因型个体(292bp)，CC基因型个体(179bp和113bp)，TC基因型个体(292bp、179bp和113bp)M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。

3)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含179bp和113bp条带的杂合子TC基因型个体其1422位的测序图的确表示为T或C，如图3a所示，而CC基因型、TT基因型分别为C、T，如图3b、c所示。

e、黄牛ANGPTL4基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

本研究所涉及的等位基因为T和C，所以具体的基因频率计算公式为：

P_C＝(2N_CC+N_TC)/2N

P_T＝(2N_TT+N_TC)/2N

式中，P_T，P_C分别表示等位基因T和C等位基因的频率，N_TT、N_TC和N_CC分别表示TT、TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。

在不同黄牛品种ANGPTL4基因SNP中的T等位基因频率变化幅度在88.5％～93％，C等位基因频率变化幅度在7.0％～11.5％之间，符合动物分子标记育种中SNP大5％～10％的要求，具备群体遗传多样性特征，可作为标记位点进行育种。

表3黄牛ANGPTL4基因第1422位SNP基因频率分布表

f、黄牛PRDM16基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：MspI识别的基因型(TT和TC，且CC基因型个体太少不作统计)

生产数据：南阳牛体尺数据。

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SAS(9.1)软件的GLM过程分析基因型和瓶中对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl

其中：T_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明(见表4)：在MspI位点，在12月龄和24月龄TT基因型的个体体重，胸围，体斜长等生产性状均高于TC基因型个体且差异显著(P＜0.05)；而在出生重和6、18月龄俩种基因型的个体在体重，胸围，体斜长等生产性状上差异不显著(P＞0.05)。说明TT基因型可以做为一个提高黄牛体重和日增重的候选分子遗传标记。

表4ANGPTL4基因MspI多态位点与南阳牛体尺指标的关联分析

Claims

1.一种检测黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含ANGPTL4基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛ANGPTL4基因；用限制性内切酶MspI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛ANGPTL4基因第1422位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：tgcgaatcca gaatctac 18nt；

下游引物：agcaaaaggt tggacact 18nt。

2.如权利要求1所述的检测黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

3.如权利要求1所述的检测黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的检测黄牛ANGPTL4基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛ANGPTL4基因第1422位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为292bp条带；TC基因型表现为292bp、179bp和113bp条带；CC基因型表现为179bp和113bp条带。