CN102649962B - 黄牛wnt10b基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛WNT10B基因单核苷酸多态性的方法，以包含WNT10B基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P3为引物，PCR扩增黄牛WNT10B基因，用限制性内切酶NaeI、ApaI分别消化用引物对P1、P3扩增后的PCR产物，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛WNT10B基因第220、3980位的单核苷酸多态性。本发明的方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的分子遗传标记，以用于黄牛的辅助选择和分子育种，加快黄牛良种繁育速度。

Description

黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛WNT10B基因内含子1及外显子2、4、5的单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

脂肪组织不仅是重要的能量贮库和赋形组织，还是保持内环境稳定的重要内分泌器官。动物体内存在棕色和白色两种脂肪。白色脂肪堆积在皮下，负责储存多余热量；棕色脂肪负责分解引发肥胖的白色脂肪，将后者消耗，加快新陈代谢。

WNT10B(wingless-type MMTV integration site family，member 10B，WNT10B)是Wnt蛋白家族19个成员之一，该蛋白家族主要负责调节胚胎发生的复杂过程，其中也包括脂肪组织的形成。WNT10B能够抑制脂肪沉积包括白色脂肪组织发育以及棕色脂肪生成。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛WNT10B基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

黄牛WNT10B基因单核苷酸多态性位点，其中，该基因单核苷酸多态性包括：

黄牛WNT10B基因第220位点为A或G的单核苷酸多态性位点；和

第3980位点为G或T的单核苷酸多态性位点。

黄牛WNT10B基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，包括以下步骤：

(1)、以包含WNT10B基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增黄牛WNT10B基因获得第一扩增产物，并用限制性内切酶NaeI酶切第一扩增产物；

(2)、以引物对P3为引物，PCR扩增黄牛WNT10B基因获得第三扩增产物，并用限制性内切酶ApaI酶切第四扩增产物；

(3)、分别对步骤(1)和(2)酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛WNT10B基因第220和3980位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：ggggaaactg aggcaaagag a；

下游引物R1：agcgggcaag cacagaact；

所述的引物对P3为：

上游引物F3：tcagacctac ccctatccac ac；

下游引物R3：aaacgccagg aagacccag。

上述技术方案所述的黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，步骤(1)中的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，66.0℃退火45s，72℃延伸45s，30～35个循环；72℃延伸10min；

步骤(2)中PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，65.5℃退火45s，72℃延伸45s，30～35个循环；72℃延伸10min。

上述技术方案所述的黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，所述的琼脂糖凝胶电泳所采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

上述技术方案所述的黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性为：

第220位点为A或G的单核苷酸多态性，表现为AA、AG、GC三种基因型；和

第3980位点为G或T的单核苷酸多态性，表现为GG、GT、TT三种基因型。

具体的：第220位的多态性为：AA基因型表现为355bp条带，AG基因型表现为355、235和120bp条带，GG基因型表现为235和120bp条带；

第3980位的多态性为：GG基因型表现为244和208bp条带，GT基因型表现为452、244和208bp条带，TT基因型表现为452bp条带。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了与黄牛生长性状相关的功能基因WNT10B的第202、1617、3980、4711位的单核苷酸多态性，并且针对上述位点的SNP多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对WNT10B基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与三品种成年牛的生长性状之间进行了性状关联分析；结果表明：在第220位点、第3980位点的郏县红牛和鲁西牛的突变纯合个体有较大的体尺性状，且差异极显著；而其他两个位点的多态性与性状关联不大。这表明WNT10B基因的第220位和3980位检测SNP位点可用作黄牛生长性状选择的分子标记：优选该位点的纯合个体进行育种。

本发明提供的检测方法为WNT10B基因的SNP与黄牛的生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

1、图1黄牛WNT10B基因P1检测SNP位点扩增电泳图；

2、图2黄牛WNT10B基因P1检测SNP位点酶切结果电泳图；

3、图3黄牛WNT10B基因P1检测SNP的不同基因型测序图；

4、图4黄牛WNT10B基因P2检测SNP位点扩增电泳图；

5、图5黄牛WNT10B基因P2检测SNP位点酶切结果电泳图；

6、图6黄牛WNT10B基因P2检测SNP位点不同基因型测序图；

7、图7黄牛WNT10B基因P3检测SNP位点扩增电泳图；

8、图8黄牛WNT10B基因P3检测SNP位点酶切结果电泳图；

9、图9黄牛WNT10B基因P3检测SNP位点不同基因型测序图。

10、图10黄牛WNT10B基因P4检测SNP位点扩增电泳图；

11、图11黄牛WNT10B基因P4检测SNP位点酶切结果电泳图；

12、图12黄牛WNT10B基因P4检测SNP位点不同基因型测序图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下通过对黄牛样本采集及基因组DNA提取、检测、纯化与浓度分析、黄牛WNT10B基因第1内含子及第2、4、5外显子的PCR扩增、黄牛WNT10B基因第1内含子及第2、4、5外显子的PCR-RFLP分析实施例来进一步说明本发明技术及其效果。所述是对本发明的解释而不是限定。

一、黄牛WNT10B基因部分DNA序列的扩增及其多态性的检测

1、黄牛血样的采集及处理

取黄牛血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了3个黄牛品种共计435个无血缘关系的母牛血样，具体为：

(1)、鲁西牛血样：分别从60头纯种鲁西成年牛采集，采自山东省鲁西黄牛原种场；

(2)、秦川牛血样：分别从115头的纯种秦川成年牛采集，采自陕西大荔县；

(3)、郏县红牛血样：分别从260头的郏县成年红牛采集，采自河南省郏县；

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)、将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)、在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌，调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)、加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)、将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)、加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)、加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)、4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)、4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)、干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，1％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)、500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL。

(11)、5℃保温10h左右。

(12)、等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次。

(13)、12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

(14)、加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

(15)、倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、DNA池的构建

(1)、1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)、OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(μg/mL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)、品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从秦川牛品种100个个体、浓度为50ng/μL DNA的样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

按照同样的方法也构建鲁西牛和郏县红牛DNA池。

4、PCR扩增引物设计

根据GenBank公开的牛基因组序列为参考，具体根据No.NC_007303序列设计引物扩增WNT10B基因的第1内含子及第2、4、5外显子的序列，扩增第1内含子、第2、4、5外显子所对应的引物对序列P1、P2、P3和P4如下：

所述的引物对P1为：

上游引物F1：GGGGAAACTGAGGCAAAGAGA；

下游引物R1：AGCGGGCAAGCACAGAACT；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：TGGCGTAAGTCCCAGTTTCTA；

下游引物R2：CTCTAACCCAGGGCTTTCTCT；

所述的引物对P3为：

上游引物F3：TCAGACCTACCCCTATCCACAC；

下游引物R3：AAACGCCAGGAAGACCCAG。

所述的引物对P4为：

上游引物F4：ACCTCTGTGCTCTGTCCATTTG

下游引物R4：GCTGGTGGCTCGTCTTGTT

该4对引物能够扩增WNT10B基因第1内含子及第2、4、5外显子的基因片段。并且已经过DNA池测序证明，所设计的4对引物扩增区域含有第220、1617、3980、4711位的单核苷酸多态性(见图3、6、9、12)。

5、PCR克降黄牛WNT10B基因

分别以3个黄牛品种的DNA池为模版，以引物对P1、P2、P3和P4为引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为15μL，见表1；PCR总反应程序，见表2，其中表2中的X℃表示不同的引物对所使用的退火温度不同，P1为66.0℃，P2为62.1℃，P3为65.5℃，P4为64.9℃；

表1 PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		2×Reaction Mix	7.50
上游引物(10pmol/L)	0.60
		下游引物(10pmol/L)	0.60
Golden DNA聚合酶(0.05U/μL)	0.12
		DNA模板(50ng/μL)	0.60
灭菌超纯水(H2O)	5.58
		总体积	15.00

表2PCR反应程序

6、PCR产物测序

PCR分别扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1、4、7、10所示，可以清楚看到355、371、452、371bp的条带，说明目的基因片段扩增成功；

把以上三个黄牛品种DNA池为模板的PCR纯化产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行单向或双向测序；黄牛WNT10B基因的第1内含子及第2、4、5外显子的片段测序结果分别如图3、6、9、12所示；其中在同一位点有两个不同峰是突变的杂合类型。

对测序峰图进行分析，图3中显示位于黄牛的WNT10B基因第220位出现单核苷酸突变，其多态性分别为A/G；图6中显示位于黄牛的WNT10B基因第1617位出现单核苷酸突变，其多态性分别为C/T；图9中显示位于黄牛的WNT10B基因第3980位出现单核苷酸突变，其多态性分别为G/T；图12中显示位于黄牛的WNT10B基因第4711位出现单核苷酸突变，其多态性分别为G/C；即筛查到黄牛WNT10B基因的4个SNP多态性。

二、黄牛WNT10B基因第1内含子及第2、4、5外显子单核苷酸多态性的RFLP检测：

1、酶切消化PCR扩增的WNT10B基因片段

(1)、酶切反应消化体系(10μL)：2.5μL PCR产物，10×缓冲液(含BAS)1μL，酶(10U/μL)为0.5μL，灭菌纯水(H₂O)6μL；

(2)、酶切消化条件：37℃恒温水浴锅中消化12～16h。

2、酶切消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析检测

1)、制作2.5％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压、100mA电流电泳30min，电泳结束后在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像检测；

2)、根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性：

(1)、上述的4个SNP多态性的序列变化为：

当第220位点发生A＞G突变时，即A突变为G，使原来的序列CACC也相应的突变成CGCC；

当第1617位点发生C＞T突变时，即C突变为T，使原来的序列TCGG也相应的突变成TTGG；

当第3980位点发生G＞T突变时，即G突变为T，使原来的序列CGGG也相应的突变成CTGG；

当第4711位点发生G＞C突变时，即G突变为C，使原来的序列CGTC也相应的突变成CCTC；

(2)、本发明对于上述4处SNP的检测，利用引物对扩增，通过PCR-RFLP检测方法实现SNP的检测，以下限制性内切酶的酶切条件均采用限制性内切酶使用说明书中的条件进行：

①、当第220bp(即WNT10B基因内含子1第19位)的A突变G为时，P1引物对扩增的WNT10B基因产物的第219bp～222bp序列为CGCC，形成了限制性内切酶NaeI的酶切位点，将扩增片段切为2段；当在220位点没有突变时，PCR扩增WNT10B基因产物的第219bp～222bp序列为CACC，限制性内切酶NaeI不能识别，如图2所示，其中，泳道2、4、5、6包含355bp和235bp条带，其为AG基因型个体，泳道3包含235bp条带，为GG基因型个体，泳道7、8包含355bp条带，为AA基因型个体，由于120bp较小，在聚丙烯酰胺电泳分析中不太清楚，泳道Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。

②、当1617位点(即WNT10B基因外显子2第81位)由C突变为T时，导致编码第54位的密码子由TCG突变为TGG，从而形成错义密码子突变，即由54Ser突变为54Leu。

当1617位点由C突变为T时，P2引物对扩增的WNT10B基因产物的第1616bp～1619bp序列为TTGG，形成了限制性内切酶EcoT14I的酶切位点，将扩增片段切为2段；当在1617位点没有突变时，PCR扩增WNT10B基因产物的第1616bp～1619bp序列为TCGG，限制性内切酶EcoT14I不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测，如图5所示，其中，泳道1包含371bp条带，其为CC基因型个体，泳道2、4包含278bp和93bp条带，为TT基因型个体，泳道3、5、6包含371bp、278bp和93bp条带，为CT基因型个体，由于93bp较小，在聚丙烯酰胺电泳分析中不太清楚，泳道Marker(2000bp，1250bp，1000bp，750bp，500bp，375bp，250bp，125bp)。

③、当3980bp(即WNT10B基因外显子4第203位)由C突变为T时，导致编码第224位的密码子由TCG突变为TCT，从而形成同义密码子突变，即由224Ser。

当3980位点没有突变时，P3引物对扩增的WNT10B基因产物的第3979bp～3982bp序列为CTGG，形成了限制性内切酶ApaI的酶切位点，将扩增片段切为2段；当在3980位点由C突变为T时，PCR扩增WNT10B基因产物的第3979bp～3982bp序列为CGGG，限制性内切酶ApaI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测，如图8所示，其中，泳道2包含452bp条带，其为GG基因型个体，泳道3、5、6包含244bp、208bp条带，为TT基因型个体，泳道4包含452bp、244bp、208bp条带，为GT基因型个体，泳道Marker(2000bp，1250bp，1000bp，750bp，500bp，375bp，250bp，125bp)。

④、当4711bp(即WNT10B基因外显子5第45位)由G突变为C时，导致编码第296位的密码子由ACG突变为ACC，从而形成同义密码子突变，即由296Thr。

当4711bp由G突变为C时，P4引物对扩增的WNT10B基因产物的第4710bp～4713bp序列为CGTC，形成了限制性内切酶KnpI的酶切位点，将扩增片段切为2段；当在4711位点没有突变时，PCR扩增WNT10B基因产物的第4710bp～4713bp序列为CCTC，限制性内切酶KnpI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测，如图11所示，其中，泳道1包含371bp、266bp和105bp条带，其为GC基因型个体，泳道2包含266bp和105bp条带，为CC基因型个体，泳道3、4包含371bp条带，为GG基因型个体，由于105bp较小，在聚丙烯酰胺电泳分析中不太清楚，泳道Marker(2000bp，1250bp，1000bp，750bp，500bp，375bp，250bp，125bp)。

由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的WNT10B基因某个位点的突变杂合子出现3条带。

3)、不同基因型个体PCR产物的测序验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，测序图结果表明某位点处为双峰的确为杂合突变，单峰中与GenBank序列相同的为野生型，不同的为突变纯合型，分别如图3、6、9、12所示。

三、黄牛WNT10B基因SNP位点的频率统计分析

1)、基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

例如：研究所涉及的等位基因为C和T，所以具体的基因频率计算公式为：

P_C＝(2N_CC+N_TC)/2N

P_T＝(2N_TT+N_TC)/2N

式中，P_T，P_C分别表示等位基因T和C等位基因的频率，N_TT、N_TC和N_CC分别表示TT、TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。

在不同黄牛品种WNT10B基因4个SNP中的各等位基因频率变化幅度如表3-6所示，220位处，等位基因A的频率较高为优势基因；1617位处，等位基因C的频率较高为优势基因；3980位处，等位基因G的频率较高为优势基因；4711位处，等位基因G的频率较高为优势基因。

表3黄牛WNT10B基因第220位SNP基因频率分布表

表4黄牛WNT10B基因第1617位SNP基因频率分布表

表5黄牛WNT10B基因第3980位SNP基因频率分布表

表6黄牛WNT10B基因第4711位SNP基因频率分布表

四、黄牛WNT10B基因SNP位点基因效应的关联分析

生产数据：三种成年牛在的生长性状：体重、体高、体长和胸围。

关联分析样本：有完整生长性状记录的三种牛435头。

关联分析模型：

利用SPSS(13.0)软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用t分析、ANOVA或多元线性模型分析基因型效应。

在数据处理中，根据影响初生重、成年体重等生长发育指标的因素不同，考虑到场效应(Farm)、品种效应(Breed)、种公畜效应(S)、种公畜内母畜间效应(SD)、年龄(Age)和性别效应(Sex)、基因型效应(Genotype)及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：

y_ijklmnpq＝μ+Farm_i+Breed_j+S_p+SD_q+Age_k+Sex_l+Genotype_m+X_n+e_ijklmnpq

其中：y_ijklmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farm_i：场别效应；Breed_j：品种效应；S_p：种公畜效应；SD_q：种公畜内母畜间效应；Age_k：年龄效应；Sex_l：性别效应；Genotype_m：标记基因型效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应，如：Farm×Breed，Farm×Age，Farm×Sex，Farm×Genotype，Breed×Age，Breed×Sex，Breed×Genotype，Age×Sex，Age×Genotype，Sex×Genotype，Breed×Age×Genogype等；e_ijklmnpq：随机误差；运用SPSS(13.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间生产性状指标进行差异显著性检验。分析结果如表7所示：

表7WNT10B基因4个位点基因型与郏县牛生长性状的相关分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

表8WNT10B基因4个位点基因型与秦川牛生长性状的相关分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

统计结果显示，如表7，在第3980位点，TT基因型的郏县红牛个体体长和胸围高于GG基因型个体且差异显著(P＜0.05)，TT基因型的郏县红牛个体体长和体重高于GT基因型个体且差异显著(P＜0.05)。如表8，在第202位点，GG基因型的秦川牛个体体高、体长、胸围高于AA和AG基因型个体且差异显著(P＜0.05)，GG基因型的秦川牛个体体重高于AA基因型个体且差异极显著(P＜0.01)。而在其他两个位点和鲁西牛中未发现显著差异(未表明数据)。这些结果表明：郏县红牛和秦川牛的突变纯合个体有较大的体尺性状，因此，第220位和3980位检测SNP位点可用作成年黄牛生长性状选择的分子标记。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (4)

1.黄牛WNT10B基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、以包含WNT10B基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增黄牛WNT10B基因获得第一扩增产物，并用限制性内切酶NaeI酶切第一扩增产物；

(2)、以引物对P3为引物，PCR扩增黄牛WNT10B基因获得第三扩增产物，并用限制性内切酶ApaI酶切第三扩增产物；

(3)、分别对步骤(1)和(2)酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛WNT10B基因第220和3980位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：ggggaaactg aggcaaagag a；

下游引物R1：agcgggcaag cacagaact；

所述的引物对P3为：

上游引物F3：tcagacctac ccctatccacac；

下游引物R3：aaacgccagg aagacccag。

2.如权利要求1所述的黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：步骤(1)中的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，66.0℃退火45s，72℃延伸45s，30～35个循环；72℃延伸10min；

步骤(2)中PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，65.5℃退火45s，72℃延伸45s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

4.如权利要求1所述的黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性为：

第220位点为A或G的单核苷酸多态性，表现为AA、AG、GC三种基因型；和第3980位点为G或T的单核苷酸多态性，表现为GG、GT、TT三种基因型。