CN103290113B

CN103290113B - 一种快速检测黄牛sirt1基因snp的rflp方法

Info

Publication number: CN103290113B
Application number: CN201310169313.5A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 李明勋; 孙晓梅; 蓝贤勇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-05-06
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2033-05-06
Also published as: CN103290113A

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛SIRT1基因启动子区SNP的RFLP方法，以黄牛血液全基因组DNA为模板，以引物对P（F、R）为引物，PCR扩增黄牛SIRT1基因启动子区，用限制性内切酶SmaI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛SIRT1启动子区单核苷酸多态性。由于SIRT1涉及到的肌肉分化、脂肪生成等重要功能与黄牛肉质性状密切相关，该SNP又能显著影响SIRT1基因的启动子活性，并且与黄牛多种重要经济性状相关，本发明提供的检测方法为SIRT1基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，可用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，以便于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种快速检测黄牛SIRT1基因SNP的RFLP方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测沉默调节因子1(SIRT1)基因单核苷酸多态性(SNP)的RFLP（限制性片段长度多态性）方法，具体地说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点，由于SNP具有其它标记无比拟的优点，所以它作为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判，而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

SIRT1是酵母染色质沉默因子SIR2（silentinformationregulator2）的哺乳动物同源体，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的组蛋白脱乙酰酶。SIRT1在成熟组织中广泛表达，在胚胎早期和生殖细胞中含量尤其丰富，参与调节机体内许多生理功能，包括众多基因转录、能量代谢以及细胞衰老过程的调节等，尤其在糖代谢、脂代谢、调节胰岛素分泌中发挥着重要的作用。在脂肪组织中SIRT1负调控白色脂肪细胞中的过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferatorsactivatedreceptors，PPARγ)，促进脂肪动员。在成肌细胞中，降低内源SIRT1导致肌细胞标志基因表达增加，促进肌细胞分化。对于黄牛育种来讲，分析SIRT1基因在牛脂肪代谢及肌肉分化中的机制，对于提高黄牛的育肥效率、提高肉品质具有重要的理论意义。

目前国内外未见关于牛SIRT1基因遗传变异的研究，由于SIRT1基因功能涉及脂肪代谢及肌肉分化等重要生长性状，本发明提供的检测方法为SIRT1基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛SIRT1基因启动子区的单核苷酸多态性，分析其对SIRT1基因启动子活性的影响，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

以黄牛血液全基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg^2＋、dNTPs存在的情况下，利用引物F、R进行PCR扩增，然后用限制性内切酶对其进行酶切，再通过3.0%琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定SIRT1基因转录起始位点上游274位（-274位，即SEQIDNO.1第127位）的单核苷酸多态性。

所述的PCR扩增引物为：

上游引物F：5′-GTATAGTCCACGGGGTTACAG-3′，

下游引物R：5′-CCAAACTTGTCTTTCAGAGTC-3′。

所述的PCR扩增条件是:25μL反应体系包括1UTaqDNA聚合酶(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25MMgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mMdNTPs2.5μL，50ng黄牛血液基因组DNA，10μM的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL；

所述的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min；

所述的限制性内切酶为SmaI，10μLSmaI酶切体系为：权利要求2中的PCR产物5μL，10×TBuffer1.0μL，0.1%BSA1.0μL，SmaI(10U/μL)0.5μL，ddH₂02.5μL，酶切消化条件：30℃恒温水浴5～8h。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%。

所述的SmaI酶切3.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，电泳条带表现为：CC基因型表现为273bp，CG基因型表现为273bp、235bp和38bp，GG基因型表现为235bp和38bp。

本发明根据SIRT1基因启动子的序列设计引物，分别以5种黄牛品种的血液基因组DNA为模板，进行PCR扩增，测序后与NCBI公布的序列进行比较，发现转录起始位点上游274位（-274位，即SEQIDNO.1第127位）存在单核苷酸多态性。

针对上述SNP位点，本发明通过设计引物进行PCR扩增，利用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性。

本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛重要生长性状进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。

附图说明

图1为黄牛SIRT1基因-274SNP位点测序图，箭头所示为突变位点，图1A为CC基因型，图1B为CG基因型，其中方框内为突变碱基，图1C为GG基因型；

图2为PCR扩增产物SmaI酶切3.0%琼脂糖凝胶电泳检测图，泳道1为CC基因型，表现为273bp；泳道2为CG基因型，表现为273bp、235bp和38bp；泳道3为GG基因型，表现为235bp和38bp；泳道4为Marker；

图3为-274SNP位点区域转录因子结合情况示意图；

图4为-274SNP对SIRT1基因启动子活性的影响。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛SIRT21基因-274位的单核苷酸多态性进行检测，下面对本发明做进一步的详细说明。

1.黄牛血液样本的采集

本发明以5个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：

表1黄牛样本的采集

2.血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1）冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min（4℃），弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3）加蛋白酶K至3μL（20mg/mL）并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6）加氯仿、异戊醇混合液（24：1）500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存；

11）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12）5℃保温10h左右；

13）等体积苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提一次；

14）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16）倒掉液体，70%乙醇洗涤后晾干，加60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3.设计黄牛SIRT1基因的PCR扩增引物

以NCBI公布的牛SIRT1序列(NC_007329)为参考，利用Primer5.0设计引物扩增SIRT1基因启动子区273bp片段，引物序列如下：

上游引物F：5′-GTATAGTCCACGGGGTTACAG-3′，

下游引物R：5′-CCAAACTTGTCTTTCAGAGTC-3′。

4.以引物F、R进行PCR扩增SIRT1基因启动子区273bp片段

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

25μL反应体系包括1UTaqDNA聚合酶(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25MMgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mMdNTPs2.5μL，50ng黄牛基因组DNA，10μM上、下游引物各0.25μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min；

对5个黄牛品种1255个样本的基因组DNA分别用引物F、R进行PCR扩增，获得1255个包含SIRT1基因启动子区273bp片段的DNA序列。

5.用限制性内切酶SmaI酶切消化PCR扩增的SIRT1基因启动子区273bp基因片段

1）酶切反应消化体系（10μL）：PCR产物5μL，10×TBuffer1.0μL，0.1%BSA1.0μL，SmaI(10U/μL)0.5μL，ddH₂02.5μL。

2）酶切消化条件：30℃恒温培养箱中消化5～8h。

6.限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1）制作3.0%的琼脂糖凝胶（已经加入核酸染料），点样后120V电压电泳40min；

2）待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGelDoc2000凝胶成像系统成像；

3）根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性。

黄牛SIRT1基因-274位（即SEQIDNO.1第127位）的单核苷酸多态性为（图2）：CC基因型表现为273bp，CG基因型表现为273bp、235bp和38bp，GG基因型表现为235bp和38bp。

7.黄牛SIRT1基因-274SNP位点的频率统计分析

1）基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋N_Aa3＋N_Aa4＋……＋N_Aan）/2N，式中P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种SIRT1基因的-274SNP中，基因型频率及遗传学参数如表3所示。

表3黄牛SIRT1基因-274SNP基因型频率及遗传学参数

χ² _0.05(df=2)=5.99.

aχ²(HWE),哈代温伯格平衡χ²值.

8.黄牛SIRT1基因-274SNP位点对所处区域转录因子结合的影响

生物信息学分析表明-274附近序列存在一个细胞周期元件（CDE）结合位点（图3），而-274C>G突变正处于该结合位点的核心区域，G等位基因存在会导致CDE结合位点消失（图3），表明-274C>G突变可能影响SIRT1基因的启动子活性。

9.黄牛SIRT1基因-274SNP位点对SIRT1基因启动子活性的影响

荧光素酶活性分析表明，在3T3-L1细胞中含G等位基因的启动子片段活性是含C等位基因的60%左右(P<0.05,图4)，说明该突变能显著影响SIRT1基因的启动子活性。

10.黄牛SIRT1基因-274SNP位点基因效应的关联分析

表4SIRT1基因启动子区-274位SNP南阳牛生长性状的关联分析

注：*P<0.05;**P<0.01.

基因型数据：SmaI识别的基因型（CC、CG和GG）。

生产数据：南阳牛6月、12月和24月的体重、体高、体长、胸围、坐骨端宽和日增重等数据。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS19软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk=μ++A_i+G_j+e_ijk，

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i个月观测的固定效应，G_j为第j个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijk为随机误差。

结果表明（见表4）：关联分析表明，南阳牛在6月龄、12月龄、24月龄时，GG纯合基因型比C等位基因携带者（CG和CC基因型）有更高的体重、体高、体长，胸围、坐骨端宽和平均日增重，尽管有些数值并未达到统计学意义上的显著水平。说明-274位的GG基因型可以作做为一个提高黄牛体重的候选分子遗传标记。

Claims

1.一种快速检测黄牛SIRT1基因启动子区SNP的RFLP方法，其特征在于：以黄牛血液基因型DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增SIRT1基因启动子，再用限制性内切酶SmaI进行酶切PCR扩增产物，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果鉴定黄牛SIRT1基因启动子区的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物F：5`-GTATAGTCCACGGGGTTACAG-3`，

下游引物R：5`-CCAAACTTGTCTTTCAGAGTC-3`。

2.如权利要求1所述的检测黄牛SIRT1基因启动子区SNP的RFLP方法，其中所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33℃个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的检测黄牛SIRT1基因启动子区SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。

4.如权利要求1所述的检测黄牛SIRT1基因启动子区SNP的RFLP方法，其特征在于：所述的SNP位点为C/G单核苷酸多态性，位于SIRT1基因转录起始位点-274位。

5.如权利要求1所述的检测黄牛SIRT1基因启动子区SNP的RFLP方法，其特征在于，SmaI酶切3.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，电泳条带表现为：CC基因型表现为273bp，CG基因型表现为273bp、235bp和38bp，GG基因型表现为235bp和38bp。

6.权利要求1-5中任意一项权利要求所述的方法在作为辅助选择黄牛分子育种、从而加快良种选育速度中的应用。