CN103695416A - 一种检测秦川牛cfl2基因的单核苷酸多态性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性检测方法及其应用，其基因单核苷酸多态性包括：以包含CFL2基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增秦川牛CFL2基因；用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛CFL2基因第2213位的碱基多态性。由于这一突变位点与秦川牛肉用性状（胸围，胸宽，胸深和体重）密切关联该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与秦川牛生长性状密切相关分子遗传标记的方法，以用于秦川牛的辅助选择和分子育种，加快秦川牛良种繁育速度。

Description

一种检测秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以秦川牛的功能基因的单核苷酸多态性（SNP）作为分子遗传标记，特别涉及一种秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性及其检测方法。 

背景技术

在肉牛育种中，人们期望通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。 

分子育种，即分子标记辅助选择育种（Molecular Mark-Assist Selection,MAS），该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。 

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。 

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander（1996）提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90%以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1%的此种变异被称为突变，而只有频率大于1%时 才被称为单核苷酸多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。 

根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性（Coding-region SNPs,cSNPs）、基因周边单核苷酸多态性（Perigenic SNPs,pSNPs）以及基因间单核苷酸多态性（Intergenic SNPs,iSNPs）。 

研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP（Synonymous cSNP），即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP（Non-Synonymous cSNP），即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。 

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、聚合酶链反应—单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）与DNA测序结合法、等位特异性PCR（Allele Specific PCR，AS-PCR）方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA 测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。 

本研究检测基因SNPs所使用的限制性片段长度多态性-聚合酶链反应（Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR）方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后设计上下游引物用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。 

Cofilin是一种低分子量的肌动蛋白结合蛋白，分子量为20kDa，在体内调节肌动蛋白的装配，该蛋白家族广泛分布于生物体内各种细胞内，包括肌肉细胞和非肌肉细胞。CFL2(Cofilin2)基因是肌动蛋白结合蛋白cofilin家族的新成员，主要在哺乳动物的骨骼肌和心肌表达．被认为是肌肉组织肌动蛋白装配的调节器，对正常肌肉功能和肌肉再生起着重要的作用。因此，CFL2基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对肌肉性状、生长发育性状具有重要的作用。 

关于动物CFL2基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠、猪等动物，而未有秦川牛CFL2基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前中国秦川牛CFL2基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因 遗传变异与经济性状（如：产肉、生长发育等性状）关联的研究成为空白。发明内容 

本发明解决的问题在于提供秦川牛CFL2基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，利用PCR-RFLP方法针对其基因位点上的错义突变可能导致编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，提前淘汰产生错义突变的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。 

本发明通过以下技术方案来实现： 

一种秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括： 

秦川牛CFL2基因第2213位为C或G的单核苷酸多态性。 

上述秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性的检测方法为： 

以包含CFL2基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增秦川牛CFL2基因；用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛CFL2基因第2213位的单核苷酸多态性； 

所述的引物对P为： 

上游引物：5’-TGCACTTGACTGCAGTTCTGTGGG-3’   24nt； 

下游引物：5’-CACTCAATGGGGGAAAAAAGGC-3’     22nt。 

所述的PCR扩增反应程序为： 

94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，每个循环-1℃，72℃延伸25s，18个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸25s，20个循环；72℃延伸10min。 

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳。 

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果CFL2基因第2213位碱基多态性为：CC型表现：252bp和24bp；CG型表现：276bp、252bp和24bp；GG型表现：276bp。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 

本发明利用RFLP-PCR方法对黄牛CFL2基因第2213位点上的突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当位点由C突变为G时，在转录过程相应位置的蛋白质编码氨基酸发生改变（肽链312位的脯氨酸变丙氨酸，Pro312Ala），使具有重要生理功能的CFL2基因所编码蛋白的空间二、三级构型发生变化，以至影响蛋白的生物学功能。 

本发明公开了与秦川牛生长性状相关的功能基因CFL2的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。 

针对上述CFL2基因的SNP多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP-PCR方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。 

本发明对CFL2基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与秦川牛生长性状之间进行了关联分析；结果显示CFL2基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。 

本发明提供的检测方法为CFL2基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国秦川牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的秦川牛种群。 

附图说明

图1为秦川牛血样基因组DNA电泳检测图； 

图2为秦川牛CFL2基因PCR扩增的276bp片段的电泳图； 

图3为秦川牛CFL2基因第4外显子276bp PCR产物的HaeIII酶切电泳检测CFL2基因多态性的电泳结果图；泳道2，3：GG基因型个体（276bp）；泳道4,5：CG基因型个体（276bp，252bp，24bp）；泳道1,6：CC基因型 个体（252bp，24bp）；M：Marker（600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）另外，由于24bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不可见,但276bp和252bp片段能鉴别CC型和CG型； 

图4为秦川牛CFL2基因2213位SNP的不同基因型测序峰图。 

具体实施方式

本发明以CFL2基因保守序列设计引物扩增CFL2基因第4外显子276bp片段，以秦川牛基因组为模板，进行PCR扩增，扩增产物经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得CFL2基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的秦川牛种群提供依据。 

a、秦川牛CFL2基因多态性的检测 

1、秦川牛血样的采集及处理 

取秦川牛血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。 

本发明采用秦川牛品种，具体如表1所示。 

表1秦川牛样品来源表 

2、血样基因组DNA的提取 

（1）将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。 

（2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。 

（3）加蛋白酶K3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。 

（4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。 

（5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。 

（6）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。 

（7）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。 

（8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。 

（9）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。 

（10）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL； 

（11）5℃保温10h左右； 

（12）等体积苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提一次； 

（13）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中； 

（14）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA； 

（15）倒掉液体，70%乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。 

3、DNA池的构建 

（1）1%琼脂糖凝胶电泳检测 

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。 

（2）OD值测定 

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。 

DNA浓度（ng/μL）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数 

（3）品种DNA池的构建 

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从秦川牛50个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池； 

秦川牛血样基因组DNA的检测结果见图1，从图中可以看出秦川牛基因组DNA的质量非常高。 

4、PCR扩增 

以秦川牛DNA池为模版，用设计的引物对P进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表2；PCR总反应程序，见表3。 

表2PCR反应体系 

体系成分	体积（μL）
		2*Reaction Mix	12.5
上游引物（10pmol/L）	1.0
		下游引物（10pmol/L）	1.0
Taq DNA聚合酶（0.5U/μL）	0.3

[0071] 

DNA模板（50ng/μL）	1.0
		灭菌超纯水（H2O）	9.2
总体积	25.0

表3PCR反应程序 

5、PCR产物纯化和测序 

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到276bp的条带；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下： 

（1）首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 

（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。 

（3）向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。 

（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 

（5）向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。 

（6）向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。 

（7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000r/min离心1min收集DNA溶液。 

（8）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。 

把以秦川牛DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。秦川牛CFL2基因目的片段276bp的测序结果如图4所示。 

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于秦川牛CFL2基因的第2213位出现了C、G两种检测结果，即为筛查到的秦川牛CFL2基因的SNP多态性，该位点是为C或G的碱基多态性。 

b、秦川牛CFL2基因C>G突变多态性的RFLP-PCR检测 

由于筛查到的碱基多态性为自然酶切位点，能被常用的内切酶进行PCR-RFLP来鉴定。当秦川牛的CFL2基因第2213位未发生C>G突变时，即为突变前C，利用引物对P扩增的CFL2基因序列ggcc，为HaeIII的限制性内切酶识别位点；可直接通过HaeIII对目的片段的酶切进行基因分型。1、RFLP-PCR引物设计 

针对测序峰图包含的第2213位的C>G突变，利用引物设计软件Primer5.0进行设计引物，在突变位点的上下游区段设计引物，具体引物设计为： 

上游引物：5’-TGCACTTGACTGCAGTTCTGTGGG-3’   24nt； 

下游引物：5’-CACTCAATGGGGGAAAAAAGGC-3’     22nt。 

上述引物能够扩增秦川牛CFL2基因第3外显子276bp片段。 

2、RFLP-PCR反应条件 

PCR产物扩增体系和反应条件分别如表2和表3所述，PCR扩增产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示，可以看到设计的引物对P能够扩增276bp的片段。 

3、PCR扩增产物的HaeIII酶切 

（1）20μL HaeIII酶切反应体系：10μL PCR产物，10×buffer(缓冲液) 

2.0μL，HaeIII（10U/μL）为0.6μL，7.4μL灭菌纯水（H₂O）； 

（2）酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化12～16h。 

（3）HaeIII消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析 

用3.0%的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1小时，核酸染料染色检测酶切结果，用BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型； 

由于PCR-RFLP扩增的276bp片段中不包含其它的HaeIII酶切识别位点，当CFL2基因第2213位未发生C>G突变时，PCR扩增的CFL2基因产物被限制性内切酶HaeIII识别后，在gg/cc对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而当CFL2基因第2213位发生突变，不能形成新的限制性内切酶HaeIII酶切识别位点，扩增片段不能被酶切； 

由于秦川牛为2倍体动物，所以当发生C>G的突变时，可形成3种不同的基因型，分别为CC、CG、GG，其PCR-RFLP检测的凝胶结果图如图3所示： 

其中，CC基因型为野生型，它的两条DNA链的SNP位点均能被HaeIII酶切，表现为252bp和24bp条带；发生突变后的野生型GG的两条链的 SNP位点均不能被酶切，表现为276bp条带；杂合子CG的两条链中的一条的SNP位点能够被识别而另一条不能被识别，表现为276bp，252bp和24bp条带；由于24bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不可见，但276bp和252bp片段能鉴别CC型和CG型，根据条带的个数和条带的大小，如图3所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。 

（4）不同基因型个体PCR产物的测序验证 

利用ABI377和ABI3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含276bp、252bp和24bp条带的杂合子CG基因型个体其第2213位的测序图的确表示为C或G，如图4b所示，自左向右第6个峰为两个峰；而CC基因型、GG基因型分别为C、G，分别如图4a，图4c所示。 

c、秦川牛的CFL2基因第2213位的SNP作为分子标记在不同秦川牛群体多态性中的应用 

1、群体单核苷酸多态性的检测 

利用上述的SNP多态性检测方法对秦川牛488份DNA样品，进行SNP多态性的鉴定；统计其SNP位点的频率分布情况。 

2、SNP位点的频率统计分析 

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。 

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋……＋N_Aan）/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等 位基因；统计结果见表4。 

表4秦川牛CFL2基因第2213位SNP基因频率分布表 

3、基因效应的关联分析 

基因型数据：HaeIII识别的基因型（CC、CG和GG） 

生长性状数据：体尺数据（体高、十字部高、体长、胸围、胸宽、胸深、尻长、坐骨端宽、腰角宽、体重） 

关联分析模型： 

利用SPSS（16.0）软件分析基因位点、公畜、场别效应、年龄和品种效应与生长性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下： 

y_ijklmn=μ+Genotype_i+S_j+B_k+F_l+Agem＋Xn＋e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；F_l场别效应；S_j为种公畜效应；B_k：品种效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应,如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS（16.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间体尺指标进行差异显著性检验。 

结果表明（见表5）：对于HaeIII可识别的第2213位的SNP位点，CG基因型为优势基因型；对于胸围，胸宽，胸深和体重，CG基因型个体的数值均显著高于CC和GG基因型个体，研究表明体重性状与产肉性状呈正相关，这说明CG基因型可以成为一个提高秦川牛产肉性状育种速度的分子遗 传标记。根据这个研究结果，人们可以通过选择，建立基因型为CC和GG的两个纯合资源群体，然后相互杂交，其杂交个体表现产肉性状好，而用于商品生产。 

表5HaeIII多态位点与秦川牛体尺之间的方差分析 

注：大写字母不同表示差异极显著（P<0.01），小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。 

Claims (5)

1.一种秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性，其特征在于，其基因单核苷酸多态性包括：

秦川牛CFL2基因第2213位为C或G的单核苷酸多态性。

2.一种秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以包含CFL2基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增秦川牛CFL2基因；用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛CFL2基因第2213位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TGCACTTGACTGCAGTTCTGTGGG-3’   24nt；

下游引物：5’-CACTCAATGGGGGAAAAAAGGC-3’     22nt。

3.如权利要求2所述的秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，每个循环-1℃，72℃延伸25s，18个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸25s，20个循环；72℃延伸10min。

4.如权利要求2所述的秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3%。

5.如权利要求2所述的秦川牛CFL2基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果CFL2基因第2213位碱基多态性为：CC型表现：252bp和24bp；CG型表现：276bp、252bp和24bp；GG型表现：276bp。

Images