CN104498611B

CN104498611B - 检测黄牛 Notch1 基因 SNP 位点的 RFLP 方法及试剂盒

Info

Publication number: CN104498611B
Application number: CN201410810765.1A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 张晨歌
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2016-10-19
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN104498611A

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒，以黄牛血液全基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛Notch1基因NICD区的一段序列，用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定Notch1基因NICD区单核苷酸多态性。该SNP位于功能非常重要的Notch1基因的NICD区，并且与黄牛多种重要经济性状相关，本发明提供的检测方法为Notch1基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，可用于黄牛生长性状的标记辅助选择，以便于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及基于RFLP(限制性片段长度多态性)的Notch跨膜受体家族1基因单核苷酸多态性(SNP)快速检测。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点，由于SNP具有其它标记无法比拟的优点，所以它作为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果受操作者主观因素影响大，而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求。

Notch基因最早于1917年由Thomas Hunt Morgan在果蝇中发现.因其功能部分缺失会在果蝇翅膀的边缘造成切迹而命名。Notch信号通路在细胞间的交流，形态发生，保持稳态，再生等方面起到至关重要的调节作用。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过三次剪切，由NICD(Notch细胞内结构域)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活HES、HEY、HERP等碱性-螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)转录抑制因子家族的靶基因，发挥生物学作用。这些转录因子促进或抑制下游基因表达，从而促进细胞增殖和抑制细胞分化。

在成肌细胞中，降低内源NICD可导致肌细胞标志基因表达增加，肌管融合加强，促进肌细胞分化。对于黄牛育种来讲，分析Notch1基因在牛肌肉分化中的机制，对于提高黄牛的生长效率、提高肉产量和品质具有重要的理论意义。

目前国内外未见关于牛Notch1基因遗传变异的研究，由于Notch1基因功能涉及肌肉分化和发育等重要生长性状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法及试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法，包括以下步骤：

以黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶HhaI酶切PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定黄牛Notch1基因单核苷酸多态性：

电泳后片段为120bp时为AA基因型，电泳后片段为96bp和24bp时为GG基因型，电泳后片段为120bp、96bp和24bp时为AG基因型，24bp因分子量太小而不可见，但不影响基因型鉴定；

所述的引物对P为：

上游引物F(SEQ.ID.NO.1)：5′-TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3′

下游引物R(SEQ.ID.NO.2)：5′-TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3′

所述的PCR扩增的反应体系为：25μL反应体系包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL(MBI,Fermentas)，10×Buffer 2.5μL(MBI,Fermentas)，25mmol/L MgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，50ng/μL DNA模板1.0μL，10μmol/L的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL。

所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，33个循环；最后72℃延伸10min。

所述的酶切在10μL HhaI酶切体系中进行，HhaI酶切体系包括5μL的PCR扩增产物，1.0μL的10×T Buffer，1.0μL的0.1％BSA，0.5μL的10U/μL限制性内切酶HhaI以及2.5μL的ddH₂O，酶切条件为：37℃恒温培养箱中消化5～8h。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。

检测黄牛Notch1基因SNP位点的试剂盒，包括10μmol/L的上、下游引物各0.25μL：

上游引物(SEQ.ID.NO.1)：5′-TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3′

下游引物(SEQ.ID.NO.2)：5′-TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3′

所述试剂盒还包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25mmol/L MgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL和灭菌超纯水15.0μL。

本发明的有益效果体现在：

本发明提供的检测方法为Notch1基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

附图说明

图1为秦川牛Notch1基因48250SNP位点测序图，箭头所示为突变位点。

图2为PCR扩增产物HhaI酶切3.0％琼脂糖凝胶电泳检测图，泳道1为Marker(M)；泳道2为AA基因型，表现为120bp；泳道3为GG基因型，表现为96bp和24bp；泳道4为AG基因型，表现为120bp、96bp和24bp。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。

本发明根据Notch1基因NICD区的序列设计引物，以包含50头秦川牛基因组样本的DNA池为模板，进行PCR扩增，测序后发现Notch1基因第48250位存在单核苷酸多态性，参见图1。当Notch1基因第48250位的A突变为G时形成错义密码子突变，即第13780位氨基酸由His突变为Arg。针对上述SNP位点，本发明通过设计引物进行PCR扩增，利用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性。本发明对448头秦川牛的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛重要生长性状进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛Notch1基因第48250位的单核苷酸多态性进行检测，下面对本发明做进一步的详细说明。

1.秦川牛血液样本的采集

本发明以地方黄牛品种秦川牛的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：

表1秦川牛样本的采集

2.血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24：1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存；

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3.设计黄牛Notch1基因的PCR扩增引物

以NCBI公布的牛Notch1序列(NC_007309)为参考，利用Primer 5.0设计引物扩增Notch1基因第36外显子(NICD区)120bp片段，引物序列如下：

上游引物F：5′-TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3′，

下游引物R：5′-TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3′。

4.以引物F、R进行PCR扩增Notch1基因片段

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

25μL反应体系包括1U Taq DNA聚合酶(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25mmol/L MgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，50ng秦川牛基因组DNA，10μmol/L上、下游引物各0.25μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min；

对秦川牛品种448个样本的基因组DNA分别用引物F、R进行PCR扩增，获得448个包含Notch1基因NICD区120bp片段的DNA序列。

5.用限制性内切酶HhaI酶切消化PCR扩增的Notch1基因120bp片段

1)酶切反应消化体系(10μL)：PCR产物5μL，10×T Buffer 1.0μL，0.1％BSA 1.0μL，HhaI(10U/μL)0.5μL，ddH₂O 2.5μL。

2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～8h。

6.限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3.0％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，点样后120V电压电泳1.0-1.5h；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性。

秦川牛Notch1基因第48250位的单核苷酸多态性为(图2)：AA基因型表现为120bp，GG基因型表现为96bp和24bp，AG基因型表现为120bp、96bp和24bp。

7.秦川牛Notch1基因第48250位SNP频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+……+N_Aan)/2N，式中P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在秦川牛品种Notch1基因第48250位SNP中，基因型频率及遗传学参数如表3所示。

表3秦川牛品种Notch1基因48250位点基因型频率及遗传学参数

χ² _0.05(df＝2)＝5.99.

aχ²(HWE),哈代温伯格平衡χ²值.

8.秦川牛Notch1基因48250位点SNP基因效应的关联分析

基因型数据：RFLP判定的基因型(AA、AG和GG)。

生产数据：秦川牛48月龄的体重、体高、体长、胸围、胸宽、十字部高和尻长等重要数据。关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS19软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+G_j+e_ijk

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，G_j为第j个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijk为随机误差。结果表明(见表4)：秦川牛在48月龄时，GG基因型个体与AA基因型个体相比体长，体重，胸宽以及十字部高三个性状均有显著优势(P<0.01或P<0.05)。说明48250位的SNP可以作为一个提高黄牛体重的候选分子遗传标记。

表4 Notch1基因48250位点SNP与秦川牛生长性状的关联分析：

Claims

1.检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：

以黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶HhaI酶切PCR扩增产物，再对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析电泳后片段大小，鉴定黄牛Notch1基因单核苷酸多态性：

电泳后片段为120bp时为AA基因型，电泳后片段为96bp和24bp时为GG基因型，电泳后片段为120bp、96bp和24bp时为AG基因型；

所述的引物对P为：

上游引物：5′-TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3′

下游引物：5′-TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3′。

2.根据权利要求1所述检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应体系包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL，10×Buffer 2.5μL，25mmol/LMgCl₂ 1.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，50ng/μL DNA模板1.0μL，10μmol/L的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL。

3.根据权利要求1所述检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，33个循环；最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的酶切在10μL HhaI酶切体系中进行，HhaI酶切体系包括5μL的PCR扩增产物，1.0μL的10×TBuffer，1.0μL的0.1％BSA，0.5μL的10U/μL限制性内切酶HhaI以及2.5μL的ddH₂O，酶切条件为：37℃恒温培养箱中消化5～8h。

5.根据权利要求1所述检测黄牛Notch1基因SNP位点的RFLP方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。

6.检测黄牛Notch1基因SNP位点的试剂盒，其特征在于：包括10μmol/L的上、下游引物各0.25μL：

上游引物：5′-TGCATGGTGCCACCCTGGGCG-3′

下游引物：5′-TGGTGCTGGGCTTGCGGGCCTTCT-3′。

7.根据权利要求6所述检测黄牛Notch1基因SNP位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括0.5U/μL Taq DNA聚合酶2.0μL，10×Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl₂1.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL和灭菌超纯水15.0μL。