CN107034282A - 一种快速检测黄牛kcnj12基因snp的rflp方法及其应用 - Google Patents

一种快速检测黄牛kcnj12基因snp的rflp方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法及其应用，以黄牛全基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛KCNJ12基因的相应序列，用限制性内切酶PstI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定KCNJ12基因单核苷酸多态性。本发明提供的检测方法可用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，加快地方黄牛品种改良。

Description

一种快速检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测内向整流型钾离子通道亚家族J成员12基因(KCNJ12)单核苷酸多态性的限制性片段长度多态性方法(RFLP)。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)是遗传多样性的主要来源，是分子进化的动力。SNPs与很多表型经济性状显著相关，通过对候选基因的SNPs的筛选和与相关生长性状进行关联分析得出育种方案，能为肉牛核心群的前期选种工作打下良好基础。近年来，人们发展了许多用于探寻SNP的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果受操作者主观因素影响大，而直接测序技术成本较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点基因类型。PCR-RFLP方法不仅具有测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求。
内向整流型钾离子通道亚家族J成员12基因(potassium inwardly-rectifyingchannel subfamily J,member12,KCNJ12)，在动物的心肌细胞和神经元中普遍表达，该基因表达的蛋白质Kir2.2是心脏内向整流钾电流(IK1)主要的分子决定因素，对细胞的兴奋性有控制作用。
由于肌肉纤维的数量出生之后不再增长，肌肉块的增大主要通过后天神经、激素和营养因素刺激肌纤维的长度的增长和横截面积的增大来实现。现在已经发现KCNJ12基因参与人类肌肉收缩过程。KCNJ12基因被标注为GABAB受体活化通道，其中GABAB受体是一种γ-氨基丁酸(GABA)与G蛋白钾离子通道相关的跨膜代谢型感受器。据早期研究报道，它们对于正常发育有重要作用，并与离子移变相关的GABAA感受器一起促进GABA输送，这又从另一角度为KCNJ12基因促进肌肉或脂肪的堆积提供理论支持。牛的拷贝数变异全基因组关联分析中发现KCNJ12基因的功能对牛的肌肉的生长发育有着重要作用。
但是目前，尚未见到定位于KCNJ12基因的遗传变异(SNP)作为与中国黄牛生长性状显著相关的分子标记的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法及其应用，从而加快黄牛良种选育速度。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增KCNJ12基因第三外显子区的一段序列，用限制性内切酶PstI对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果鉴定黄牛KCNJ12基因上的SNP位点的基因型；
所述的引物对P为：
上游引物F：5′-CGAGGAGTGCCCGGTGGCGGTGTTCAT-3′；
下游引物R：5′-TAGGTTGCCCACGCGCCACATGCTGC-3′。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，33～35个循环；72℃延伸10min。
所述PCR扩增的反应体系包括50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pM的上、下游引物各0.4μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL以及去离子水3.7μL。
所述限制性内切酶PstI的酶切体系包括PCR扩增产物5μL，10×T Buffer 1.0μL，10U/μL PstI 0.3μL，ddH2O 3.7μL；酶切条件为：37℃恒温8～10h。
所述琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。
所述SNP位点为T/C单核苷酸多态性，位于KCNJ12基因第34684位。
所述电泳结果包括：CC基因型表现为199bp的一个条带，TT基因型表现为176bp和23bp的两个条带，TC基因型表现为199bp、176bp和23bp的三个条带。
本发明的有益效果体现在：
针对黄牛KCNJ12基因SNP位点，本发明通过设计引物进行PCR扩增，利用特定的限制性内切酶酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，通过分析片段大小，确定位点基因型，从而能够简单、快速、成本低、精确地检测KCNJ12基因单核苷酸的多态性。检测的SNP位点可以作为候选分子标记位点应用于黄牛生长性状分子标记辅助选择中，从而加快黄牛良种选育速度。
附图说明
图1为皮南牛KCNJ12基因第34684位测序图，箭头所示为T/C突变位点。
图2为PCR扩增产物经PstI酶切后电泳检测图，其中：泳道1为Marker；泳道2为TT基因型；泳道3、4、6、7为TC基因型；泳道5为CC基因型。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明利用PCR-RFLP方法检测黄牛KCNJ12基因单核苷酸多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记。
首先，本发明根据KCNJ12基因第三外显子区的序列设计引物，以包含50头皮南牛基因组样本的DNA池为模板，进行PCR扩增，测序后发现KCNJ12基因第34684位存在单核苷酸多态性(图1)。当KCNJ12基因(AC_000176)第34684位的T突变为C时形成错义密码子突变，即该位置的氨基酸由Cys突变为Arg。
(一)根据以上发现，本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛KCNJ12基因第34684位(位于第三外显子区)的单核苷酸多态性进行检测
1.黄牛血液样本的采集
本发明以黄牛品种夏南牛和皮南牛的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：
表1.黄牛样本的采集
2.血液基因组DNA的分离、提取、纯化
1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；
2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；
3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；
4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；
5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
6)加氯仿、异戊醇混合液(24:1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；
8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；
10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存；以下为纯化步骤；
11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；
12)5℃保温10h左右；
13)等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次；
14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；
15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；
16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。
3.设计黄牛KCNJ12基因的PCR扩增引物
以NCBI公布的牛KCNJ12序列AC_000176为参考，利用Primer 5.0设计引物扩增KCNJ12基因第三外显子区199bp片段，引物序列如下：
上游引物F：5′-CGAGGAGTGCCCGGTGGCGGTGTTCAT-3′(参见SEQ.ID.NO.1)
下游引物R：5′-TAGGTTGCCCACGCGCCACATGCTGC-3′(参见SEQ.ID.NO.2)
4.以引物F、R PCR扩增KCNJ12基因片段
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应程序：
PCR扩增10μL反应体系包括50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pM的上、下游引物各0.4μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，去离子水3.7μL；
对367头皮南牛和223头夏南牛样本的基因组DNA分别用引物F、R进行PCR扩增，获得367头皮南牛和223头夏南牛包含KCNJ12基因第三外显子区199bp片段的DNA序列。
5.用限制性内切酶PstI酶切消化PCR扩增的KCNJ12基因199bp片段
1)酶切反应消化体系(10μL)：PCR产物5μL，10×T Buffer 1.0μL，PstI(10U/μL)0.3μL，ddH2O 3.7μL。
2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化8～10h。
6.限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析
1)制作3.0％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，点样后120V电压电泳1.0～1.5h；
2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；
3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性。
皮南牛KCNJ12基因第34684位的单核苷酸多态性为(图2)：CC基因型表现为199bp，TT基因型表现为176bp和23bp，TC基因型表现为199bp、176bp和23bp。23bp因分子量太小而不可见，但不影响基因型鉴定。
(二)不同基因型与黄牛生长性状相关性
本发明对590头牛，其中367头皮南牛和223头夏南牛的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛重要生长性状进行关联分析，结果表明该位点的不同基因型与黄牛生长性状存在显著相关，说明该位点能够作为黄牛生长性状的辅助选择分子标记。
1.皮南牛和夏南牛KCNJ12基因第34684位SNP频率统计分析
1)基因和基因型频率
基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。Paa＝Naa/N，其中Paa代表某一位点的aa基因型频率；Naa表示群体中具有aa基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：Pa＝(2Naa+Naa1+Naa2+Naa3+Naa4+……+Naan)/2N，式中Pa表示等位基因a频率，Naa表示群体中具有aa基因型的个体数量，Naai表示群体中具有aai基因型个体数量，a1～an为等位基因a的n个互不相同的复等位基因。
在皮南牛和夏南牛品种KCNJ12基因第34684位SNP中，基因型频率及遗传学参数如表2所示。
表2.皮南牛和夏南牛品种KCNJ12基因34684位点基因型频率及遗传学参数
χ2(HWE):哈代温伯格平衡χ2值.
2.皮南牛和夏南牛KCNJ12基因34684位点SNP基因效应的关联分析
基因型数据：RFLP判定的基因型(TT、TC和CC)。
生产数据：皮南牛和夏南牛的体重、体高、体斜长、胸围、腹围、管围、腰角宽、十字部高和尻长等。
关联分析模型：
先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS19软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：
Yijk＝μ+Gj+eijk
其中：Yijkl为性状观察值，μ为总体均值，Gj为第j个单SNP标记基因型的固定效应，eijk为随机误差。
表3.KCNJ12基因34684位点SNP与夏南牛生长性状的关联分析
表4.KCNJ12基因34684位点SNP与皮南牛生长性状的关联分析
结果表明(见表3、表4)：夏南牛中，CC基因型个体与TT基因型个体相比在胸围、腹围和体重三个性状均有极显著优势(P<0.01)；皮南牛中，CC基因型个体与TT基因型个体相比体斜长、胸围、十字部高、尻长和腰角宽等性状均有极显著优势(P<0.01)；在体高性状上有显著优势(P<0.05)。说明KCNJ12基因34684位的SNP可以作为一个黄牛的候选分子标记位点。
核苷酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种快速检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 1
cgaggagtgc ccggtggcgg tgttcat 27
<210> 2
<211>26
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 2
taggttgccc acgcgccaca tgctgc 26

Claims (8)

1.一种快速检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：
以黄牛基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增KCNJ12基因第三外显子区的一段序列，用限制性内切酶PstI对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果鉴定黄牛KCNJ12基因上的SNP位点的基因型；
所述的引物对P为：
上游引物F：5′-CGAGGAGTGCCCGGTGGCGGTGTTCAT-3′；
下游引物R：5′-TAGGTTGCCCACGCGCCACATGCTGC-3′。
2.如权利要求1所述的检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，33～35个循环；72℃延伸10min。
3.如权利要求1所述的检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系包括50ng/μL模板DNA 0.5μL，10pM的上、下游引物各0.4μL，2×Taq PCR MasterMix 5μL以及去离子水3.7μL。
4.如权利要求1所述的检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述限制性内切酶PstI的酶切体系包括PCR扩增产物5μL、10×T Buffer 1.0μL、10U/μL PstI 0.3μL以及ddH2O 3.7μL；酶切条件为：37℃恒温8～10h。
5.如权利要求1所述的检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。
6.如权利要求1所述的检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述SNP位点为T/C单核苷酸多态性，位于KCNJ12基因第34684位。
7.如权利要求1所述的检测黄牛KCNJ12基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述电泳结果包括：CC基因型表现为199bp的一个条带，TT基因型表现为176bp和23bp的两个条带，TC基因型表现为199bp、176bp和23bp的三个条带。
8.如权利要求1-7中任意一项权利要求所述的方法在黄牛分子标记辅助选择中的应用。
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