CN111910008B - 一种鸡生长发育相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡生长发育相关的分子标记及其应用，属于分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域。本发明所述的分子标记是通过对大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡组建的F2代资源群体741只试验鸡进行全基因组关联(GWAS)分析得到，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本3号染色体上的第101578531bp处有一个A>G的核苷酸单碱基突变(命名为：Chr.3101578531A>G)，定位在其附近区域的基因为RNA结合蛋白PUM2（pumilio RNA binding family member 2）基因，突变显著影响了鸡的体重。本发明公开了该分子标记的获得及应用。本发明还提供了一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型检测方法，利用该方法可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡生长发育遗传改良中，从而提高鸡的生长发育。

Description

一种鸡生长发育相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助选择技术及动物遗传育种技术领域，特别涉及一种鸡生长发育相关的分子标记及其应用。

背景技术

禽肉已成为世界最重要的肉品来源之一，随着人们对优质肉鸡需求不断增加，优质肉鸡育种及扩繁对家禽业的发展越来越重要。而人类对家鸡的表型进行选择以提高其生产性能是家鸡育种的重要内容。目前，占我国肉鸡出栏量50％的白羽肉鸡完全依赖进口，一旦供应链断裂，我国肉鸡市场必然受到严重打击。

近年来发达国家纷纷抢占生物物种资源,争夺生物基因资源,生物种质资源的竞争已成为无硝烟的战场。而家鸡种质资源是人类社会赖以生存和发展的重要生物资源之一，是培育新品种的基本素材。家鸡种质资源对家禽业发展的直接贡献在40％以上。因而保护其多样性,是未来家禽产业可持续发展的根本保证。家鸡资源具有重要的科学价值。具有特殊基因的家鸡品种更是研究的理想对象,在许多方面都会具有极重要的科学价值。

中国地方鸡种资源独特、丰富，养殖生态、地理类型多样，具有发展优质特色肉鸡产业的先天优势。但是，由于我国家鸡种质资源开发研究主要集中在资源评价与调查，没有形成有效的育种制种技术和具有自主知识产权的品种(系)，使得资源优势长期不能转化为经济优势。我国家鸡育种多采用的技术是简单针对生长速度、产蛋量等数量性状进行的表型选择，而运用数量遗传学进行选择的数量性状也仅限生长性状、体尺性状和产蛋性状。虽然优质鸡也有采用杂交配套育种技术，但是杂交配套缺乏统筹规划，存在很多杂交乱配现象。这导致我国家鸡育种选择强度低、育种周期长、育种成本高，整体育种效率低。且我国家鸡传统育种是对生长速度、产蛋量等数量性状进行选择，难以进行精准的定向选择，导致不能迅速进行优良品种的繁殖推广和有效地进行家鸡种质资源的保存与交换，降低了家鸡育种的效率。

随着测序技术的飞速发展，测序成本急剧下降，家鸡育种已进入以全基因组重测序为基础的全基因组选择(GS)时代。利用基因组信息和大数据及人工智能直接进行GS，可对家鸡目标性状进行高效、快速、定向及模块化选育，加速新品种培育。基因组育种已成为世界一流家鸡育种公司争夺的战略高地。美国安伟捷育种公司最早于2012年宣布将GS技术应用于蛋鸡和肉鸡商业育种流程，美国科宝公司于2015年将GS全面纳入常规育种体系。

因此，采用全基因组关联分析的方法找到与家鸡体重相关的SNP分子标记，对我国家鸡育种有着重要的意义。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明的首要目的在于提供一个与鸡生长发育相关的SNP分子标记及其应用。本发明基于云南地方鸡种与隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，运用全基因组关联分析的方法寻找与鸡体重相关的SNP分子标记，以此作为鸡生长发育相关的SNP分子标记在标记辅助选择中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述鸡生长发育相关的分子标记在鉴定鸡生长发育和遗传育种中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型检测方法。

本发明的第四个目的在于提供一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型在鉴定鸡生长发育中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种与鸡生长发育相关的SNP分子标记的获取方法，其在于下列步骤：

1)组建大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡F2代资源群体，获得741只试验鸡，均于90日龄时测定体重；

2)提取F2代群体鸡基因组DNA；

3)构建DNA文库，进行全基因组重测序；

4)对测序原始数据质控、过滤后，利用BWA、Samtools等软件进行SNP检测；

5)结合体重表型数据，采用GEMMA软件进行表型和基因型以及协变量的关联分析，确定与鸡体重相关联的SNP。利用ANNOVAR软件对目标区域内的基因进行功能注释；

本发明通过全基因组关联分析(GWAS)的方法得到与鸡体重相关联的SNP分子标记，在鸡参考基因组Gallus_gallus.GRCg6a版本3号染色体上的第101578531bp处有一个A>G的核苷酸单碱基突变(命名为：g.101578531A>G)，定位在其附近的基因为RNA结合蛋白PUM2(pumilio RNA binding family member 2)基因，突变显著影响了鸡的体重。

所述的与鸡生长发育相关的分子标记在鉴定鸡生长发育和遗传育种中的应用。

一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型检测方法：以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；若Chr.3 101578531A>G为G碱基，则为GG基因型；若Chr.3 101578531A>G为A碱基，则为AG基因型。

采用的特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-GCTTTGCCAGCCATCCAATC-3’；

下游引物primer-R：5’-AGCGTTGCCTGTTGTGTTTG-3’。

一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型在鉴定鸡生长发育中的应用，所述的基因分型是利用上述影响鸡生长发育的分子标记基因分型检测方法获得。

一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型在鸡遗传育种中的应用，所述的基因分型是利用上述影响鸡生长发育的分子标记基因分型检测方法获得，淘汰GG基因型，保留AG基因型，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代鸡的生长速度。

所述的种鸡优选为大围山微型鸡。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明研究并确定影响体重相关的分子标记，验证其对体重的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于鸡生长速度的遗传改良中，从而提高选择强度，降低育种周期，进而提高育种效率，降低育种成本。

附图说明

图1为在鸡3号染色体上关于体重的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2为有关鸡体重主效突变位点Chr.3 101578531A>G不同基因型的测序结果峰图；

其中(a)表示基因型为AG型的测序结果峰图,(b)表示基因型为GG型的测序结果峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实验例1实验鸡群饲养与体重测定

(1)实验动物

本发明所使用的试验鸡群体是由大围山微型鸡和隐性白洛克肉鸡杂交而来的F2代资源群体。

F0代是从大围山微型鸡(来源于云南农业大学实习鸡场)和隐性白洛克肉鸡(来源于昆明云岭广大种禽饲料有限公司)分别选取种鸡，所选公母鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正。大围山微型鸡一个未经选育的小型鸡种，其个体小(平均体重0.7-1.2kg)、耗料少、基础代谢低等优点，是培育优质、节粮型家鸡新品种(系)的优良素材。隐性白洛克肉鸡属于快大白羽肉鸡，是从白洛克中选育而成，其羽毛的白色为隐性性状。

大围山微型鸡-隐性白洛克肉鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建正交系和反交系各4个，正交系：大围山微型鸡♂×隐性白洛克肉鸡♀；反交系：隐性白洛克肉鸡♂×大围山微型鸡♀。正交系和反交系均按照公母鸡1：3比例配组而成。F0代采用人工授精共产生F1后代数为正交80只，反交146只。正交系挑选公母鸡各20只(1:1配对)进行F1代的横交，反交系挑选公母鸡各30只(1:1配对)进行F1代的横交，得到F2代资源群741只鸡，其中正交259只，反交482只。

(2)饲养实验

试验鸡于云南农业大学实习鸡场进行饲养，饲养至12周龄。日粮饲喂分为两个阶段：0-4周龄为雏鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.00MJ/Kg，粗蛋白为19.80％；5-12周龄为生长鸡阶段，日粮营养水平代谢能为12.10MJ/Kg，粗蛋白为18.00％。

(3)活重测定

试验鸡于12周龄早晨测定活重，测定前12小时停止提供日粮和饮水。

实验例2鸡生长发育相关的分子标记的获得

(1)血液样品采集

采用含有EDTA-二钾的真空采血管进行试验鸡翅静脉采血。

(2)基因组DNA的提取及鉴定

采用Gentra Puregene Blood Kit(Qiagen)柱式离心法试剂盒提取血液基因组DNA，待DNA完全溶解后用NannoDrop核酸分析仪检测其浓度，并在1％琼脂糖凝胶电泳条件下检测DNA条带的完整性。

(3)DNA文库构建与测序

文库的构建利用NEBNext DNA library kit(NewEnglandBiolabs)完成，具体操作步骤为：首先将基因组DNA随机打断成小片段，然后在长度为500bp左右的片段上连接上Illumina双末端接头，经过PCR扩增和纯化后得到DNA文库，使用Illumina Hiseq 2500高通量测序仪对试验样本进行测序。

(4)基因组内变异检测

1)数据质控

对测序得到的原始reads，我们首先利用FastQC软件对数据的质量进行质量分析。根据数据的质量，我们接下来利用NGSQC Toolkit对原始reads进行质控，主要剔除在建库和测序中残留的引物和接头和质量较低的reads。

2)测序reads比对和变异检测

采用Ensembl数据库中原鸡基因组Gallus_gallus.GRCg6a，利用BWA软件对参考基因组构建索引。将质控之后的高质量reads利用BWA-MEM比对到鸡的参考基因组上，利用Picard软件将比对后的SAM文件转换成二进制的BAM文件，再利用Samtools软件按照参考基因组的物理位置信息对比对好的BAM文件进行排序，并进行SNP分析，得到SNP数据集。

3)全基因组关联分析

GEMMA(http://www.xzlab.org/software.html)是一款专门用于GWAS分析的软件，利用该软件采用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM)同时对群体结构和个体亲缘关系进行校正，性别作为固定效应，同时减少计算时间。使用GEMMA对群体的体重进行关联分析，筛选出潜在的符合哈迪-温伯格平衡检验P＜1×10-6(卡方检验)和最小等位基因频率(MAF)≤0.05的SNP。

4)基因组变异的功能注释

基于Ensembl数据库中的鸡基因组注释信息，利用ANNOVAR软件对所检测到的所有SNP变异进行注释。

(5)不同基因型与体重的关联性分析

根据表1可知，分子标记的SNP位点Chr.3 101578531A>G与体重极显著相关(P<0.001)，在其附近区域的基因是RNA结合蛋白PUM2(pumilio RNA binding family member2)基因，说明此分子标记显著影响鸡的生长发育，可以通过对此SNP位点的辅助选择，促进鸡的生长发育，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，AG型比GG的平均体重高(未检测到AA基因型)，说明纯合子GG对平均体重是最不利的。通过表2进一步得知，杂合子AG与纯合子GG基因型体重显著差异，这进一步说明杂合子AG对体重最有利，可促进鸡的生长发育。因此，GG基因型的鸡的生长性能是最差的，在进行育种的过程中需要淘汰GG型的种鸡，保留AG型的种鸡，以逐代提高该杂合基因型的频率。

表1分子标记的SNP位点Chr.3 101578531A>G与体重的相关性

表2分子标记的SNP位点Chr.3 101578531A>G不同基因型组间差异性

实验例3一种影响鸡生长发育的分子标记基因型检测方法

(1)实验动物

本发明所使用的实验鸡群群体为云南农业大学的150日龄大围山微型鸡种鸡200只(公母各100只)，为种鸡核心群。鸡群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致。测定体重。

(2)目的DNA序列扩增及测序

1)引物设计

通过NCBI网站下载鸡的3号染色体的DNA序列，并利用引物设计软件primerpremier 6.0设计引物。

设计的引物的DNA序列如下所示：

上游引物primer-F：5’-GCTTTGCCAGCCATCCAATC-3’；

下游引物primer-R：5’-AGCGTTGCCTGTTGTGTTTG-3’。

2)PCR扩增

10uL的反应体系中加入DNA模板1.0μL，双蒸水10.5uL，2×TSINGKE^TM Master Mix12.5μL，引物primer-F和primer-R各0.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50-68℃退火30s，72℃延伸30s，经35个循环，72℃延伸7min，4℃保温。

3)DNA序列测定

最后对PCR扩增后的产物进行测序，基因片段测序要求为双向测通。

测序结果如SEQ ID NO:1所示。

注：序列表中N为突变位点。

(3)分子标记的SNP位点g.352A>G基因型分析

根据表3可知，大围山微型鸡种鸡中分子标记的SNP位点g.352A>G基因型AG型比GG的平均体重高，说明杂合子AG对平均体重是最有利的。这进一步说明杂合子AG可促进鸡的生长发育。

表3分子标记的SNP位点g.352A>G不同基因型体重差异

实验例4分子标记的SNP位点g.352A>G效应分析

本发明提供一个能显著提高鸡生长发育SNP分子标记，使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快鸡生长发育育种进程。若本发明将影响鸡生长发育的分子标记的GG型个体全部选育成AG型个体，则大围山微型鸡种鸡群体平均体重可以提高142.02g，可显著提高种鸡的生长速度。

本SNP分子标记个体中，通过优选云南地方鸡该SNP的优势等位基因(A)，可最终实现提高商品鸡的经济效益，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 一种鸡生长发育相关的分子标记及其应用

<130> 2020-7-24

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 689

<212> DNA

<213> Gallus gallus

<220>

<221> misc_feature

<222> (352)..(352)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gctttgccag ccatccaatc tgataggtct cctgatcagg gctggagatt ttttttttta 60

tttttttttt tataattcac tccccaaaaa tatacaaaag aataaaaatt ttacaaatgg 120

atgaacaaag tcaataaata gatttaaaaa aatcagaaca tttatagtta agttgtatgt 180

tttgatcatt cacaataaaa tttttcttcc acttcctttt tttttttttg ccttttacag 240

catcccattt ggtggtccac ctattggccc cagatcagca ctgttcttca ggtaatactt 300

ttccagcttc gccagaatgt gtttgccgta ggtgtattta cgcagagttg tnatgtgggg 360

tcgaatctgt aggaagaaat gtgttatttt tttcctcaca aactgtaaga ggagccacta 420

cacttgggaa caattacatt aaaaaaaatc aaacaagaag ctgcctatca tttcacacct 480

atggaagctt ctggaaagat gtgaggtggg tgatgctgca tcaccaacca actgatgtac 540

ctctcctaag tattcagttg atgactccac ttttgttttc agatttcaga ccatggattt 600

cttcaacatc aacaaatgac taaagaagac agcaggtgtt ttgacaacaa aacactatac 660

tatgtgatac aaacacaaca ggcaacgct 689

Claims (2)

1.一种鸡生长发育相关的SNP分子标记在鉴定大围山微型鸡鸡体重或大围山微型鸡鸡体重调控相关的遗传育种中的应用，其特征在于：该分子标记位于鸡参考基因组Gallus_gallus .GRCg6a版本3号染色体上的第101578531bp 处有一个A>G 的核苷酸单碱基突变，命名为：Chr .3 101578531A>G，定位在其附近的基因为RNA结合蛋白PUM2基因，突变显著影响了鸡的体重。

2.一种影响鸡生长发育的分子标记基因分型在鉴定大围山微型鸡鸡体重或大围山微型鸡鸡体重调控相关的遗传育种中的应用，其特征在于：该分子标记位于鸡参考基因组Gallus_gallus .GRCg6a版本3号染色体上的第101578531bp 处有一个A>G 的核苷酸单碱基突变，命名为：Chr .3 101578531A>G；所述的基因分型通过如下方法获得：以待测鸡的全基因组DNA为模板，采用特异性引物进行扩增，对扩增后的产物进行测序；特异性引物包含引物primer-F和primer-R，其核酸序列如下：上游引物primer-F：5’-GCTTTGCCAGCCATCCAATC-3’；下游引物primer-R：5’-AGCGTTGCCTGTTGTGTTTG-3’；若Chr .3101578531A>G为G碱基，则为GG基因型；若Chr .3 101578531A>G为A碱基，则为AG基因型；AG基因型的体重生长速度优于GG基因型；淘汰GG基因型，保留AG基因型。

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