CN110106255B

CN110106255B - 位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记及应用

Info

Publication number: CN110106255B
Application number: CN201910251984.3A
Authority: CN
Inventors: 吴珍芳; 杨杰; 吴杰; 周身娉; 郑恩琴; 徐铮; 蔡更元
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN110106255A

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪7号染色体上与杜洛克日增重性状相关的分子标记及其应用。所述的位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记的SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第27045611bp处的A>C突变，该分子标记是通过全基因组关联分析得到，该分子标记显著影响猪30～100kg体重平均日增重的性状。本发明还提供了一种用于鉴定该分子标记的引物对，利用该分子标记和引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪日增重性状遗传改良中，从而提高猪的日增重，提高企业利润，增加核心竞争力。

Description

位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

猪肉是人类消费的主要肉类之一，提高猪的生长性能，以满足人们对猪肉的需求尤为重要。平均日增重是指猪在育肥期(30～100kg)平均每日增加的重量，是衡量猪生长性能的重要指标之一，也是猪育种中的主要育种目标之一。育种工作者一直致力于提高猪的平均日增重，经过长期选育，平均日增重性状得到一定程度上改良。但日增重是受多基因调控的复杂数量性状，通过常规选育来改良日增重，不仅耗时长，而且收效甚微。如若能利用分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)技术提高日增重，将进一步加快其育种进程，降低养殖成本，提高养殖场收益。

目前常用的分子遗传标记方法主要包括候选基因分析(Candidate GeneApproach，CGA)、QTL连锁分析法(Quantitative Trait Locus Linkage Analysis，又称QTL定位)和全基因组关联分析(Genome-wide Association Study，GWAS)。候选基因法虽有操作简便、总费用低的优点，但只能针对已知生物学功能的基因，无法找出未知生物学功能的QTL；与候选基因法相比，QTL定位是较为精细的定位方法，但QTL定位分辨率差，不能一次性精确定位与性状相关的QTL，也无法一次性分析多个性状，周期长且效率低；GWAS被认为是高分辨率遗传分析的新方法。随着基因组学、高通量测序技术、高密度SNP芯片技术以及计算机技术的飞速发展，使得GWAS逐渐取代QTL定位法成为了复杂性状候选基因鉴定以及遗传解析的重要手段，广泛应用于人类、植物和动物。

杜洛克猪为瘦肉型猪种，具有适应性强、分布广、生长速度快、饲料转化效率高、胴体瘦肉率高等特点，被广泛用作杜长大(杜洛克猪×长白猪×大白猪)商品猪的终端父本。杜长大是全球最受欢迎的商品猪，杜洛克猪作为终端父本直接影响杜长大商品猪的生产性能，而商品猪生产性能直接影响养殖场收益。此外，平均日增重直接影响猪的饲养成本，提高平均日增重、缩短出栏时间是育种工作者的主要育种目标之一。因此，对杜洛克猪核心群的平均日增重进行改良，能较大的将改良得到的优势遗传给下一代，增加商品猪的日增重，进而降低猪的饲养成本，提高企业利润。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种杜洛克猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记，其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第27045611位A>C突变；

所述的位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是A或C，导致猪日增重性状的不同；

所述的位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记在鉴定杜洛克猪日增重性状和遗传育种中应用；

一种检测猪日增重性状的方法，包含如下步骤：

检测猪7号染色体上上述位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记，所述的分子标记的SNP位点单核苷酸是A还是C；

所述的猪优选为加系杜洛克及其合成系；

一种鉴定上述位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记的引物对，包含primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-CCAGGAGAACTGGGTCACAT-3’；

下游引物primer-R：5’-TGGCTCATTCAGTGCAGAAC-3’；

所述的引物对在鉴定猪日增重性状中的应用；

所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对在提高猪日增重中的应用；

一种猪的遗传改良方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记，并根据该分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第27045611位点为AA和AC基因型的种猪个体，淘汰在第27045611位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代猪的平均日增重；

所述的种猪优选为加系杜洛克及其合成系；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响猪日增重相关的分子标记(SEQ IDNO:1序列标注位置为第84位的核苷酸突变)位于猪的7号染色体上的核苷酸序列上，验证其对平均日增重性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪提高平均日增重的遗传改良中，从而提高后代猪的平均日增重，提高企业利润，增加核心竞争力。

(2)本发明提供一种用于鉴定位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记的引物对，通过该分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确的对体型进行选育，加快育种进程。

(3)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，能够增加杜洛克猪日增重性状的遗传进展，减少杜洛克猪的日增重性状的育种时间，从而有效提高种猪育种的经济效益，其中，通过该分子标记，本发明将CC型个体全部选育成AA型个体，则每头猪平均日增重可以提高5.26g，每头猪体重达100kg所需时间平均缩短了0.98天，即提前0.98天上市。这对于规模化万头养猪场来说，若每头猪提前0.98天上市，将极大降低猪的饲养成本，给企业带来非常可观的利润。由此可见，高平均日增重为养猪产业提供收益的潜力是巨大的。

附图说明

图1是加系杜洛克猪在7号染色体上关于30～100kg平均日增重性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型猪30～100kg体重的平均日增重分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验猪群：本实验一共使用了2121头加系杜洛克。

实施例1具体解释得到本发明中影响日增重的测定过程

通过Osborne FIRE Pig Performance Testing System(Kansas,NE,USA)测定活体猪体重从30kg达100kg时的平均日增重。本发明所使用的实验猪群群体为广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种加系杜洛克2121头，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。本实验共选取该资源群体中加系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

实施例2具体解释得到本发明中基因标记的发明过程

(1)加系杜洛克猪耳样组织DNA的提取方法参照标注苯酚-氯仿法提取全基因组DNA。用Nanodrop-ND1000分光光度计对纯种加系杜洛克群体的DNA进行质量检测和浓度测定。A260/280比值在1.8～2.0，A260/230比值在1.7～1.9判定为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释成50纳克/微升。

(2)猪全基因组50K SNP基因型检测：GeneSeek Genomic Profiler Porcine50KSNP分型平台，采用Illumina Infinium的使用说明和标准流程进行芯片杂交与结果扫描。最后通过GenomeStudio软件读取基因型数据。用PLINK v1.07对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<99.7％，次等位基因频率(Mimor Allel Frequency,MAF)<0.01％或偏离哈代温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)P≤10^-6的SNP标记，排除检出率<90％，家系孟德尔错误率高于0.1的个体；质控剩余的35952个SNP标记和2121样本用于后续数据分析。

(3)全基因组关联(GWAS)分析：为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与日增重性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.39074×10^-6，即0.05/35952(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.78149×10^-5，即1/35952(有效SNP数量)。

GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克中，在7号染色体中存在显著影响猪30～100kg体重平均日增重的位点，最强关联的SNP为g.84 A>C(P＝2.47×10^-6)。

(4)不同基因型与种猪30kg至100kg体重时平均日增重表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的SNP位点g.84 A>C(SEQ NO.1中第84位核苷酸)与日增重性状极显著相关(P<0.01)，说明此分子标记显著影响猪的日增重，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体日增重，进而加快种猪的育种进程。另外根据表1、图2还可知，CC型比AA和AC型的日增重低，说明纯合子CC种猪的日增重是最不利的。因此，CC基因型的猪的生长性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要逐步淘汰CC型和AC型种猪，保留AA型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因A的频率。

表1分子标记的SNP位点g.84 A>C与30～100kg平均日增重的相关性

实施例3具体解释发明检测SNP标记的发明过程

(1)含有与加系杜洛克30～100kg平均日增重性能显著相关SNP位点的目的片段为7号染色体中的一段214bp的核苷酸序列，序列扩增的上下游引物为primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’-CCAGGAGAACTGGGTCACAT-3’；

下游引物primer-R：5’-TGGCTCATTCAGTGCAGAAC-3’；

(2)PCR扩增的体系与条件设置

配置10μL体系，其中DNA样品1.0μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，PCR mix5.0μL，ddH₂O3.4μL，PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后延伸为72℃5min。

(3)DNA序列测序鉴定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变，测序结果如下所示：

注：序列中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列结合位置。

实施例4分子标记的SNP位点g.84 A>C效应分析

本发明提供一个能显著增加杜洛克种猪日增重SNP分子标记，使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地增加杜洛克种猪日增重育种进程。由表一可知，猪从30kg到100kg体重时，AA型个体比CC型个体体重平均每日增加5.26g，每头猪体重达100kg所需时间平均缩短了0.98天，即比CC型个体提前0.98天上市。这对于规模化万头养猪场来说，若每头猪提前0.98天上市，将极大降低猪的饲养成本，给企业带来非常可观的利润。由此可见高平均日增重为养猪产业提供收益的潜力是巨大的。本SNP分子标记个体中，通过优选加系杜洛克该SNP的优势等位基因(A)，可最终实现提高商品猪的经济效益，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记及应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 214

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记

<400> 1

ccaggagaac tgggtcacat tcatcccatg gcagcctcta caggggacag agagggtccc 60

tgcccaagag cttgtcactg ctgmgaatga gggcccccta gttaaaggca gtgcacctcc 120

atgcccactg gtgatcagct gaagaggggg aaggtgaaag cgctgggagc tacctgagaa 180

tttgcccttg gaaagttctg cactgaatga gcca 214

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物primer-F

<400> 2

ccaggagaac tgggtcacat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物primer-R

<400> 3

tggctcattc agtgcagaac 20

Claims

1.一种位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记，其特征在于其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列7号染色体上第27045611位A>C突变；其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是A或C，导致猪日增重性状的不同；

所述的杜洛克猪为加系杜洛克猪。

2.权利要求1所述的位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记在鉴定杜洛克猪日增重性状和遗传育种中应用，其特征在于：

所述的杜洛克猪为加系杜洛克猪。

3.一种检测猪日增重性状的方法，其特征在于包含如下步骤：

检测猪7号染色体上权利要求1所述的位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记，所述的分子标记的SNP位点单核苷酸是A还是C；

所述的猪为加系杜洛克猪。

4.一种鉴定权利要求1所述的位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记的引物对，其特征在于包含primer-F和primer-R，其核酸序列如下：

上游引物primer-F：5’- CCAGGAGAACTGGGTCACAT-3’；

下游引物primer-R：5’- TGGCTCATTCAGTGCAGAAC-3’；

所述的杜洛克猪为加系杜洛克猪。

5.权利要求4所述的引物对在鉴定猪日增重性状中的应用，其特征在于：

所述的猪为加系杜洛克猪。

6.权利要求4所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用，其特征在于：

所述的猪为加系杜洛克猪。

7.权利要求4所述的引物对在提高后代猪日增重中的应用，其特征在于：所述的猪为加系杜洛克猪。

8.一种猪的遗传改良方法，其特征在于包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的权利要求1所述的位于猪7号染色体上与杜洛克猪日增重性状相关的分子标记，并根据该分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本7号染色体上第27045611位点为AA和AC基因型的种猪个体，淘汰在第27045611位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而提高后代猪的平均日增重；

所述的种猪为加系杜洛克猪。