CN112266968B

CN112266968B - 一种猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记及应用

Info

Publication number: CN112266968B
Application number: CN202011375394.0A
Authority: CN
Inventors: 吴珍芳; 杨杰; 邱益彬; 丁荣荣; 蔡更元; 郑恩琴; 庄站伟; 吴杰; 李紫聪; 顾婷; 徐铮
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112266968A

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记及应用。所述的猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记的拷贝数变异区域对应于国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上位于206578011bp‑208240759bp区间的片段，该区间内易发生拷贝数变异。本发明通过优选该拷贝数变异分子标记的优势拷贝数变异类型，能够逐代增加优势拷贝数变异类型的频率，缩短上市体重日龄，提高日增重，协同选育上述两个性状的优良种猪，加快猪遗传育种进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记及应用。

背景技术

猪是一种重要的经济动物，也是研究疾病的模式动物，猪的一些重要的经济性状如生长、繁殖和肉质性状等一直受到育种研究人员的关注。近年来，随着人民猪肉消费水平的不断增长，瘦肉型猪占据了猪肉消费市场很大的市场份额。因此，优质瘦肉型猪的选育成为育种工作的重点，影响生长的相关性状是重要的育种目标。猪的生长性状主要包括上市体重日龄和日增重等。其中，上市体重日龄是指达上市体重时的天龄，而日增重则是指达上市体重时的平均每日增重。在养猪生产中，猪的生长性能是重要的经济性状，是影响养殖企业经济效益的重要因素之一。

美系杜洛克作为终端父本，在我国的育种和商业化养殖中应用非常广泛，如果能加快杜洛克猪生长性状的遗传改良，将会为养殖业带来巨大的经济效益。然而，生长性状是复杂的数量性状，受到多基因的控制。因此，采用常规的育种方法难以快速实现预期的育种目标。随着高通量测序技术的发展及全基因组芯片的出现，全基因组关联分析(Genome-wide Association Study，GWAS)在复杂性状的遗传解析中取得了巨大的突破，目前已经被广泛应用于各类研究中。但是传统的GWAS方法所解析出来的遗传变异位点往往只占据总遗传力的一部分。在人和动物的基因组中，变异不仅仅局限于单位点的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)，还包括小片段的插入和缺失(Insertion/Deletion，INDEL)以及拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)等。而CNV作为遗传多样性的重要来源，可能为传统GWAS方法无法解释的遗传变异提供一种新的思路。

CNV是一种片段长度在50bp甚至数Mb以上的遗传变异，对比参考基因组，该区域内可能发生不同程度的拷贝数缺失或者增加。而正是由于该片段拷贝数变异类型的不同，可能会导致基因的剂量效应或者改变基因的结构，从而显著的影响基因的表达量以及其所控制的对应表型。因此，在猪的遗传改良育种进程中，CNV与关联分析策略的结合，为进一步解析生长性状等复杂性状的遗传机制提供了重要的途径。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异(CNV)分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种检测上述拷贝数变异分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记，其拷贝数变异区域对应于国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上位于206578011bp-208240759bp区间的片段；

所述的猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记的核苷酸序列对应于国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上位于206578011bp-208240759bp区域内，序列的拷贝数正常、增加或缺失，导致猪上市体重日龄和日增重的差异；其中，序列的拷贝数＝2，为拷贝数正常；序列的拷贝数>2，为拷贝数增加，序列的拷贝数<2为拷贝数缺失；

所述的猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记在鉴定猪上市体重日龄、日增重相关性状和猪遗传育种中的应用；

一种用于鉴定上述拷贝数变异分子标记的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:1，序列的拷贝数正常、增加或缺失，导致猪上市体重日龄和日增重的差异；其中，序列的拷贝数＝2，为拷贝数正常；序列的拷贝数>2，为拷贝数增加，序列的拷贝数<2为拷贝数缺失；

利用上述猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记筛选高生长效率的猪品种的方法，包含如下步骤：

检测上述猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记，所述分子标记区间内的核苷酸序列是拷贝数正常、增加或缺失，其中，当猪的个体拥有该片段的正常拷贝数或高拷贝数(即拷贝数大于等于2)时，则有利于提高猪的生长效率；

所述的猪为杜洛克其合成系；

所述的猪优选为美系杜洛克及其合成系；

一种检测上述拷贝数变异分子标记的引物对，包含引物对P1和P2，其中，引物对P1包含引物F1和引物R1，引物对P2包含引物F2和引物R2，其核苷酸序列如下所示：

上游引物F1：5’-ACCTGGTGGCTGTGGCTGAG-3’，

下游引物R1：5’-CTGGTGCTGCTGTGGCTGTG-3’；

上游引物F2：5’-TGCAGAACTACAGGGCTCAGGAC-3’，

下游引物R2：5’-GTGGAACAGGGCAGGTGGAAAG-3’；

所述的引物对在鉴定猪上市体重日龄和日增重相关性状中的应用；

所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对在提高猪生长效率中的应用；

一种检测上述拷贝数变异分子标记的试剂盒，包含上述引物对；

一种用于检测上述拷贝数变异分子标记的方法，包含如下步骤：

以猪组织样全基因组DNA为模板，以检测上述拷贝数变异分子标记的引物对或上述试剂盒中的引物对为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增13号染色体上位于206578011bp-208240759bp区域内的特异性序列SEQ ID NO:1以及作为内参的GCG基因的部分片段，根据定量结果鉴定拷贝数变异区域的拷贝数类型；

所述的根据定量结果鉴定拷贝数变异区域的拷贝数类型的具体操作优选为：

实时荧光定量PCR结束后，根据2×2^-ΔΔCt计算方法将实时荧光定量PCR结果分为三类：正常型，2×2^-ΔΔCt＝2；增加型，2×2^-ΔΔCt>2；缺失型，2×2^-ΔΔCt<2；

其中，ΔΔCt的计算公式为[(Ct_目标序列-Ct_参考序列)]_试验组-[(Ct_目标序列-Ct_参考序列)]_对照组。其中，Ct_目标序列和Ct_参考序列分别指目标序列(SEQ ID NO:1)和参考序列(GCG)的Ct值，试验组即为需要检测是否存在拷贝数变异的待测样本，对照组即为已知的无拷贝数变异的对照样本；

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述拷贝数变异分子标记的区域，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本13号染色体上位于206578011bp-208240759bp区域内为拷贝数增加或正常的种猪个体，淘汰在206578011bp-208240759bp区域内为拷贝数缺失的种猪个体，以逐代提高该区域内的拷贝数增加或正常类型的频率，从而提高后代猪的生长效率；

所述的猪为杜洛克猪及其合成系；

所述的猪优选为美系杜洛克猪及其合成系；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明在杜洛克猪种猪群体中采用关联分析的策略，研究并确定影响猪上市体重日龄和日增重相关的拷贝数变异分子标记位于猪的13号染色体上206578011bp-208240759bp区域内，验证其对上市体重日龄和日增重相关性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪生长效率的遗传改良中，从而改善后代猪的生长性能，减少育种损失的同时提高动物福利，提高企业经济利润，增加核心竞争力。通过优选该CNV片段拷贝数增加或正常的个体，能够逐代提高拷贝数增加或正常类型的频率，缩短种猪达上市体重时的日龄、提高种猪的日增重，协同选育上述两个性状的优良猪种，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

(2)本发明提供一种鉴定猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记的引物对和方法，通过P1和P2引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对种猪生长效率进行选育改良，加快育种进程。

附图说明

图1是美系杜洛克在13号染色体上关于上市体重日龄、日增重性状的关联分析曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值；A：上市体重日龄，B：日增重。

图2是测试样本拷贝数变异分子标记区域内的拷贝数类型检测图；其中：横坐标表示测试样本的ID号；纵坐标表示根据公式2×2^-ΔΔCt计算出来的拷贝数值。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种美系杜洛克3770头，为种猪分公司核心群。

本实验共选取该资源群体中3770头美系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

(2)样本采集

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)猪全基因组50K SNP判型

从上述资源群体中选取的3770头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到39600个SNP的有效基因型数据。

(4)CNV片段关联分析

使用PennCNV软件对质控后的SNP芯片数据进行分析，并通过Bedtools和CNVRuler软件获得该群体的拷贝数变异片段数据，经过质控和校正，保留了拷贝数变异频率在0.5％以上的拷贝数变异片段，最终有116个CNV片段以及3261个个体用于关联分析。本发明采用一般线性模型单点回归分析并结合GEMMA软件进行关联分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定CNV与上市体重日龄和日增重性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效CNV数量，即显著水平阈值为4.31E-04，即0.05/116(有效CNV数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效CNV数量，即染色体显著水平阈值为8.62E-03，即1/116(有效CNV数量)。

关联分析结果如图1所示。从图1可知，在美系杜洛克猪中，在13号染色体中存在显著影响上市体重日龄和日增重的CNV片段，最强关联的CNV为Chr13:206578011bp-208240759bp(P值分别为2.11E-07、1.43E-08)。

(5)不同拷贝数类型与上市体重日龄和日增重表型的关联性分析

根据表1可知，Chr 13:206578011bp-208240759bp片段内存在拷贝数变异，且与体重日龄极显著相关(P<0.001)。说明此分子标记显著影响猪的上市体重日龄性状，可以通过对猪的此CNV片段的辅助选择，从而缩短该群体的达上市目标体重的日龄，进而加快育种进程。

根据表2可知，Chr 13:206578011bp-208240759bp片段内存在拷贝数变异，且与日增重极显著相关(P<0.001)。说明此分子标记显著影响猪的日增重性状，可以通过对猪的此CNV片段的辅助选择，从而提高该群体的达上市体重时的日增重，进而加快育种进程。

另外根据表1～2可知，拷贝数增加和拷贝数正常的个体，其达上市体重所需要的日龄比拷贝数缺失的个体短，其日增重则比拷贝数缺失的个体大。对于上市体重日龄性状，拷贝数增加型个体表型平均值比拷贝数缺失型个体表型平均值小6.36，且两者之间差异显著(P<0.05)；对于日增重性状，拷贝数增加型个体表型平均值比拷贝数缺失型个体表型平均值大26.42，且两者之间差异显著(P<0.05)。这些结果表明，在育种中逐步剔除拷贝数缺失型的种猪，以逐代提高该区域内的拷贝数增加型和正常型的频率，可以显著缩短上市体重日龄以及显著提高日增重，为养殖企业带来更多的经济效益。

表1分子标记的CNV片段拷贝数类型与上市体重日龄的相关性分析

表2分子标记的CNV片段拷贝数类型与日增重的相关性分析

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载位于猪的13号染色体上206578011bp-208240759bp序列内具有特异性的DNA序列(SEQ ID NO:1)为参考序列，并利用引物设计软件primer premier 6.0设计qPCR引物(引物对P1)。同时，以NCBI公布的猪GCG基因序列(NC_010457.5)作为参考序列，采用相同方法设计qPCR引物(引物对P2)。设计的引物对P1和P2的DNA序列如下所示。

引物对P1为：

上游引物F1：5’-ACCTGGTGGCTGTGGCTGAG-3’，

下游引物R1：5’-CTGGTGCTGCTGTGGCTGTG-3’；

引物对P2为：

上游引物F2：5’-TGCAGAACTACAGGGCTCAGGAC-3’，

下游引物R2：5’-GTGGAACAGGGCAGGTGGAAAG-3’；

(2)qPCR扩增

10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Power-Up SYBR greenmaster mix 5μL，上下游引物各0.3μL。qPCR反应条件为：95℃预变性10min后，95℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸20s，40个循环。溶解曲线：95℃持续10s，65℃持续1min，95℃持续15s。每个样本分别用P1和P2引物对进行扩增，并且每对引物3个重复。

(3)拷贝数变异类型检测

实验组样本的拷贝数变异分子标记的拷贝数类型可根据实验组与对照组Ct值(Cycle threshold)的差异进行推算，及通过计算2×2^-ΔΔCt将拷贝数变异分子标记的拷贝数类型分为3类：正常型，2×2^-ΔΔCt＝2；增加型，2×2^-ΔΔCt>2；缺失型，2×2^-ΔΔCt<2。ΔΔCt的计算公式为[(Ct_目标序列-Ct_参考序列)]_试验组-[(Ct_目标序列-Ct_参考序列)]_对照组。其中，Ct_目标序列和Ct_参考序列分别指目标序列(SEQ ID NO:1)和参考序列(GCG)的Ct值，试验组即为需要检测是否存在拷贝数变异的待测样本，对照组即为已知的无拷贝数变异的对照样本，可以为实施例1中已确定为无拷贝数变异的样本。

根据图2可知，在随机挑选的7个待测样本中，检测到了分子标记区域内拷贝数数目的变化。检测结果显示：1个样本的2×2^-ΔΔCt<2，其分子标记区域内拷贝数类型判定为缺失型；3个样本的2×2^-ΔΔCt＝2，其分子标记区域内拷贝数类型判定为正常型；剩余3个样本的2×2^-ΔΔCt>2，其分子标记区域内拷贝数类型判定为增加型；该结果与实施例1CNV片段关联分析一致。

(4)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应拷贝数变异区域(SEQ ID NO:1)。测序结果如下所示：

注：序列表中，用标有下划线显示的为所验证的拷贝数变异区域，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

GCG基因qPCR扩增序列：

注：序列表中，用标有下划线显示的为扩增区域，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3拷贝数变异分子标记的拷贝数类型效应分析

根据表1～2可知，对于上市体重日龄，CNV区域内优势拷贝数类型(拷贝数增加)的效应比拷贝数缺失型表型平均值显著缩短了6.36。而对于日增重，CNV区域优势拷贝数类型(拷贝数增加)的效应比拷贝数缺失型表型平均值显著提高了26.42。因此，通过分子标记辅助选择，逐步对群体内拷贝数类型为缺失的猪进行淘汰，则能显著提高拷贝数增加类型和正常类型的频率，缩短群体的上市体重日龄，提高群体的日增重，使猪生长及生产性能得到改善，可产出更多优质商品瘦肉型猪肉以满足人们对高品质猪肉的需求，从而带动了猪肉销量的增长，这将给企业带来巨大的经济收益。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列的拷贝数变异进行检测，初步进行其拷贝数类型与猪的上市体重日龄和日增重性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的拷贝数变异分子标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记及应

用

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 138

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ ID NO:1

<400> 1

acctggtggc tgtggctgag tcgtcatgta tttttatttt gtgtttttac caccacactt 60

gtggcatatg gaaactccca ggctaggggt cgaatcagcg acagctgcca gtccacacca 120

cagccacagc agcaccag 138

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GCG基因qPCR扩增序列

<400> 2

tgcagaacta cagggctcag gacactgcac acacgaagtt ctgaaaagag tctcactctc 60

tttccacctg ccctgttcca c 81

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物F1

<400> 3

acctggtggc tgtggctgag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物R1

<400> 4

ctggtgctgc tgtggctgtg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物F2

<400> 5

tgcagaacta cagggctcag gac 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物R2

<400> 6

gtggaacagg gcaggtggaa ag 22

Claims

1.SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在鉴定猪上市体重日龄、日增重相关性状中的应用，其特征在于：所述的核苷酸序列的拷贝数正常、增加或缺失，导致猪上市体重日龄和日增重的差异；其中，序列的拷贝数＝2，为拷贝数正常；序列的拷贝数＞2，为拷贝数增加，序列的拷贝数＜2为拷贝数缺失。

2.利用猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记筛选高生长效率的猪品种的方法，其特征在于包含如下步骤：

检测权利要求1中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，该核苷酸序列是拷贝数正常、增加或缺失，其中，当猪的个体拥有该序列的正常拷贝数或高拷贝数时，则有利于提高猪的生长效率。

3.一种检测用于鉴定猪13号染色体上影响上市体重日龄和日增重的拷贝数变异分子标记的引物对在鉴定猪上市体重日龄和日增重相关性状中的应用，其特征在于：

所述的引物对包含引物对P1和P2，其中，引物对P1包含引物F1和引物R1，引物对P2包含引物F2和引物R2，其核苷酸序列如下所示：

上游引物F1：5′-ACCTGGTGGCTGTGGCTGAG-3′，

下游引物R1：5′-CTGGTGCTGCTGTGGCTGTG-3′；

上游引物F2：5′-TGCAGAACTACAGGGCTCAGGAC-3′，

下游引物R2：5′-GTGGAACAGGGCAGGTGGAAAG-3′。

4.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，并根据所述的核苷酸序列做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择该核苷酸序列拷贝数增加或正常的种猪个体，淘汰该核苷酸序列拷贝数缺失的种猪个体，以逐代提高该序列的拷贝数增加或正常类型的频率，从而提高后代猪的生长效率。