CN113355427B - 一种与猪背膘厚相关的snp标记及其利用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪背膘厚显著相关的SNP标记及其利用方法，所述SNP标记位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处，具体C/T多态性，该位点的基因型为TT的猪，相对于基因型为TC和CC的猪具有更低的背膘厚度。本发明提供的与猪背膘厚显著相关的SNP标记，可以用于鉴定或者辅助鉴定猪背膘厚较低的个体，丰富了辅助育种的分子标记，增加了优良猪种的选育速度，加快了猪分子育种的步伐，同时为低背膘厚的猪育种提供了切实可行的方案，提高了猪生产企业的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于猪育种技术领域，具体涉及一种与猪背膘厚相关的SNP标记及其利用方法。
背景技术
猪生长性能的高低主要体现在肌肉含量、脂肪含量、猪肉品质以及饲料利用率等方面。在现代畜牧养殖过程中，背膘厚是一类重要的活体性能测定指标。该性状不仅可以影响与瘦肉率相关的生长性状，还会影响与产仔数相关的繁殖性状。同时，在猪重要经济性状遗传改良中，背膘厚也是衡量猪品种优劣的一个重要参考指标，常用于选育优良品种。
研究发现，遗传因素是影响猪背膘厚最主要的原因，但是，目前发现的与猪背膘厚相关的数量性状基因座(QTL)数量比较多，且置信区间较大，因此很难通过QTL图谱鉴定到影响背膘厚的致因突变。
全基因组关联分析是鉴定表型和基因型之间遗传联系的主要手段之一，可以用于鉴定影响背膘厚的SNPs(单核苷酸多态性)。单核苷酸多态性是指在基因组DNA序列上由单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失。
因此，发掘与猪背膘厚相关的SNP标记，对猪生长性状的改良和优良猪品种的培育具有重要意义。
发明内容
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，得到一种与猪背膘厚显著相关的SNP标记，该SNP标记位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处，具有C/T多态性，该位点的基因型为TT的猪，相对于基因型为TC和CC的猪具有更低的背膘厚度，可以通过鉴定该SNP位点的不同等位基因来筛选低背膘厚的猪种，以对猪的生长性状进行改良，缩短了育种周期，加速了改良进程，提高了猪群的经济效益与社会价值，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
本发明提供了一种与猪背膘厚相关的SNP标记，其中，所述SNP标记位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处。
其中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP标记具有C/T多态性。
其中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP标记的等位基因C的基因频率为0.9773，T的基因频率为0.0627。
其中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点的基因型为TT的猪，相对于基因型为TC和CC的猪具有更低的背膘厚度。
本发明还提供了一种上述SNP标记在评估猪背膘厚方面的应用。
本发明还提供了一种猪背膘厚的遗传改良方法，其中，所述方法包括确定猪核心群中种猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP标记，并根据所述标记做出相应选择的步骤。
其中，所述种猪的继代选育猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点的基因型为TT的个体，淘汰该位点基因型为TC和CC的个体。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明所提供的与猪背膘厚相关的SNP标记，可以用于鉴定或者辅助鉴定猪背膘厚较低的个体，丰富了辅助育种的分子标记，增加了优良猪种的选育速度，加快了猪分子育种的步伐；
(2)本发明所提供的与猪背膘厚相关的SNP标记，为低背膘厚的猪育种提供了切实可行的方案，提高了猪生产企业的经济效益；
(3)本发明所提供的与猪背膘厚相关的SNP标记，可通过鉴定该SNP标记的不同等位基因来筛选猪背膘厚低的猪个体，从而提高猪群的社会价值。
附图说明
图1示出本发明实施例2中基因型效应的箱线图。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
本发明提供了一种与猪背膘厚相关的SNP标记，所述SNP标记位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处。
其中，所述SNP标记位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体的正义链上，记为WU_10.2_1_3128134519。
根据本发明一种优选的实施方式，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP标记具有C/T多态性。
其中，该SNP位点的两种等位基因为C和T，C的基因频率为0.9773，T的基因频率为0.0627，C为优势等位基因。
在进一步优选的实施方式中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点的基因型为TT的猪，相对于基因型为TC和CC的猪具有更低的背膘厚度。
在本发明中，所述位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点对应的基因型有三种，分别为TT、TC和CC，TT基因型是该位点为碱基T的纯合子，TC基因型是该位点为杂合子，CC基因型是该位点为碱基C的纯合子。
其中，对SNP位点进行基因分型可以在一定程度上排除表型选择中饲养环境、饲料、疾病等因素对猪优良基因的误淘和误选，增强目标性状选择准确性。因此，本发明中优选对SNP位点进行基因分型。
优选地，所述基因分型选择高密度SNP芯片技术，其相对于传统的基因分型方法(如PCR、RFLP等)，可以在很短的时间周期内对大量的SNP进行分型，效率高，其能极大地降低成本。
本发明还提供了一种上述SNP标记的获取方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，选择猪群体，进行背膘厚测定。
在本发明中，优选在猪个体体重处于85～105kg范围时测定活体背膘厚，采用B超扫描测定群体中猪个体的倒数第3～4肋间处背膘厚，以毫米为单位。然后，采用全国畜牧兽医总站[2000]60号文件《全国种猪遗传评估方案》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正，具体按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×CF(其中：CF＝A÷{A+[B×(实测体重-100)]})。
其中，A、B为不同猪种背膘厚度校正系数。
公猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.826040；母猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615。
常见的公母猪背膘厚校正表如表1所示：
表1
步骤2，提取猪个体的基因组DNA，进行基因型分型。
在本发明中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪群体中每个个体的基因组DNA，优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。
优选采用分光光度计和电泳对提取的猪基因组DNA进行浓度测定和质量检测，其中，提取的DNA的A260/A280比值在1.8～2.0，A260/A230比值在1.7～1.9判定为纯度合格；将浓度高于300ng/μL判定为浓度合格。
进一步地，将检测合格的DNA利用高密度SNP芯片进行基因型检测，如纽勤公司的Neogen_POR80K芯片，优选利用分型软件GenCall Version7.0.0进行。
步骤3，对背膘厚数据和基因型分型数据进行质量控制。
在本发明中，对背膘厚数据进行的质量控制为：清除表型值缺失的个体，清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
对基因型分型数据进行的质量控制为：清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(MAF)小于1％的个体；清除哈代-温伯格平衡(HWE)卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点；清除性染色体上的SNP位点。
步骤4，对步骤3处理后的数据进行关联分析，获得所述SNP标记。
根据本发明一种优选的实施方式，优选采用R语言包GAPIT Version 3对所有分型SNP位点与校正背膘厚进行全基因组关联分析。
其中，该软件包的统计模型为压缩混合线性模型，GAPIT的设计目的是在大数据集上准确地执行GWAS和基因组预测，混合线性模型(Mixed Liner Model，MLM)包括固定和随机效应，模型将种群结构作为固定效应，同时将个体纳入随机效应进行个体亲缘关系矩阵的构建，其统计分析模型如下：
Y＝Xβ+Zu+e
其中，Y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值；u是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。
通过上述关联分析，能够得到与猪背膘厚显著相关的SNP位点，还需要进一步比较分析所得SNP位点中不同基因型与校正背膘厚度的关联结果。
在进一步优选的实施方式中，采用Rstudio软件利用Kruskal-Wallis方法对所得SNP位点的基因型数据和校正背膘厚数据进行差异显著性检验，以获得与猪校正背膘厚显著相关的基因型类型。
本发明还提供了一种上述SNP标记或上述方法获取的SNP标记在评估猪背膘厚方面的应用。
本发明还提供了一种鉴定或者辅助鉴定猪背膘厚的方法，所述方法包括检测猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点基因型的步骤。
其中，若待测猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点的基因型为TT，则该待测猪具有较低的背膘厚；若待测猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点的基因型为TC或CC，则该待测猪具有较高的背膘厚。
本发明还提供了一种猪背膘厚的遗传改良方法，所述方法包括确定猪核心群中种猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP标记，并根据所述标记做出相应选择的步骤。
优选地，种猪的继代选育猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点的基因型为TT的个体，淘汰该位点基因型为TC和CC的个体。
本发明还提供了一种鉴定上述SNP标记的引物对，所述引物对为P1和P2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种上述引物对在鉴定或者辅助鉴定猪背膘厚中的应用。
进一步地，所述应用包括以下步骤：
步骤i，提取待测猪的基因组DNA；
步骤ii，采用上述引物对对待测猪的基因组DNA进行扩增，获得PCR扩增产物；
步骤iii，对扩增产物进行测序，获得包括所述SNP位点的核苷酸序列；
步骤iv，根据测序结果，获得待测猪在该SNP位点的基因型。
其中，根据获得的待测猪在该SNP位点的基因型判断猪背膘厚的大小，当待测猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP标记的基因型为TT时，具有较低的背膘厚；当待测猪位于猪参考基因组Sscrofa10.2版本序列1号染色体第312,813,451bp处的SNP位点的基因型为TC或CC时，则该待测猪具有较高的背膘厚。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1 SNP位点的获得
1、试验群体
本实施例所应用的猪群体为来自河北美神原种猪基础母猪场的1148头猪，包括588头大白猪，371头长白猪和189头杜洛克猪。
2、背膘厚测定与校正
在猪个体体重处于85～105kg范围时测定活体背膘厚，采用B超仪扫描测定倒数第3～4肋间处的背膘厚，以毫米为单位；最后按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×CF(其中：CF＝A÷{A+[B×(实测体重-100)]})；
其中，母猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615。
在本实施例中，由于猪群体均为母猪，大白猪的A为13.706，B为0.119624；长白猪的A为13.983，B为0.126014；杜洛克猪的A为15.654，B为0.156646。
3、DNA提取与SNP分型
对试验猪群体的猪耳朵组织进行采样，采用0.5mL裂解液(0.5mol/L EDTA、0.5mol/L EDTA、1mol/L NaCl、10％SDS、RNase stock)进行裂解，采用10μl蛋白酶K(5mg/ml)进行消化处理，采用酚仿法进行DNA提取，具体步骤如下：
(1)将组织剪碎加到1.5ml离心管，在管中加裂解液和蛋白酶K，放入摇床(56℃,5h)；
(2)加入等体积的Tris饱和酚(500μl)，摇匀(10min)；
(3)12000rpm离心5分钟，取上层液体转移到新的离心管；
(4)配置Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1；
(5)向装有上清液的新离心管中加入0.45mL步骤4配置的混合液；
(6)12000rpm离心5分钟，取上清液转移到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液0.4mL(氯仿：异戊醇＝24:1)；
(7)12000rpm离心5分钟，取上清液转移到新的离心管，加入2.5倍-20℃预冷的无水乙醇，-20℃过夜；
(8)12000rpm离心5分钟，弃上清，保留白色沉淀，加入0.4mL 75％乙醇，反复吹打，离心去液体；
(9)重复步骤8；
(10)加入ddH2O，提取完成。
用紫外分光光度计和凝胶电泳进行DNA质量检测，将检测合格的DNA放置于-20℃保存。
取检测合格的DNA，利用纽勤公司的Neogen_POR80K芯片进行基因型分型。
4、数据的质量控制
在背膘厚表型值测定过程中，清除表型值缺失的个体，清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体；
基因分型过程中，清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率小于1％的个体；清除哈代-温伯格平卡方检验P值小于1.0E-4的SNP位点；清除性染色体上的SNP位点。
5、全基因组关联分析
采用R语言包GAPIT Version 3对所有分型SNP位点与校正猪背膘厚进行全基因组关联分析，采用的统计分析模型如下：
Y＝Xβ+Zu+e
其中，Y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值；u是来自个体或者系的多个背景QTL的随机加性遗传效应的未知值；X和Z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。
统计分析结果表明，位点WU_10.2_1_312813451的不同基因型与猪校正背膘厚性状显著相关。
实施例2 SNP位点不同基因型与背膘厚的关联结果
取实施例1中猪群体的基因组DNA，采用纽勤公司的Neogen_POR80K检测每个个体的基因型，通过R语言提取多态性位点的序列，统计SNP位点的基因型频率和基因频率分布，结果如表2所示：
表2
由表2可以看出，C为优势等位基因，CC基因型为试验群体优势基因型。
采用Rstudio软件对基因型数据和表型数据利用Kruskal-Wallis方法进行差异显著性检验，其中，P-value＜0.05表明差异显著。关联分析结果如表3所示：
表3
由表3可知，上述SNP位点的三种基因型的猪的校正背膘厚有显著差异，TT基因型猪背膘厚在统计学上显著低于TC和CC基因型猪个体。
进一步地，利用R语言的ggplot2、ggpubr和magrittr函数包绘制三种基因型效应的箱线图，结果如图1所示。
由图1可知，TT基因型的个体校正背膘厚比TC基因型的低1.21mm，TT基因型的个体校正背膘厚比CC基因型的低2.87mm。
因此，综上所述，位点WU_10.2_1_312813451的多态可以作为猪背膘厚鉴定的分子标记，应用于分子育种中以改良猪的产肉性状，提高瘦肉率和产肉量。在猪分子育种过程中，继代选育该位点的TT基因型个体作为种猪，可以筛选出低背膘厚的猪群体，进而达到提高猪的生产效率的目的。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 一种与猪背膘厚相关的SNP标记及其利用方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物P1（人工序列）
<400> 1
tcccacatgc agtcgaaagt 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物P2（人工序列）
<400> 2
tgcctattgt ctgtactttc tgtta 25
Claims (2)
1.一种猪背膘厚的遗传改良方法，其特征在于，所述方法包括确定猪核心群中种猪位于国际猪参考基因组10.2版本1号染色体第312,813,451个核苷酸位点的基因型，
所述猪的品种为大白猪、长白猪和杜洛克猪，
所述种猪的继代选育国际猪参考基因组10.2版本1号染色体第312,813,451个核苷酸位点的基因型为TT的个体，淘汰该位点基因型为TC和CC的个体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种猪位于国际猪参考基因组10.2版本1号染色体第312,813,451个核苷酸位点具有C/T多态性。
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-
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