CN110541038A - 一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的snp分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记及应用。所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体上第162192627位T>C突变。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高猪的日增重，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记及 应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记及应用。
背景技术
“杜长大”三元杂猪是世界范围内最流行的商品猪杂交品系，杜洛克猪由于具有生长速度快、瘦肉率高、及饲料转化率高的特点，因此在育种生产中常作为终端父本使用。平均日增重(Average Daily Gain，ADG)是指猪在30～100公斤体重内平均每日增加的重量，是用来衡量饲料利用效率的指标之一。另外，在猪的饲养过程中，饲料成本约占养猪总成本的70％。因此提高杜洛克种猪的平均日增重是养殖企业重要的育种目标。平均日增重属于中等遗传力性状，遗传力约为0.3，因此，利用遗传手段对核心群美系杜洛克种猪平均日增重性状进行改良是可行的。
日增重是受多个基因控制的数量性状，基因组上存在大量影响日增重的数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)。人们过去利用候选基因法和QTL定位法鉴定到部分与猪日增重相关的候选基因和QTL。但是候选基因法在基因的选择上具有一定的随机性，无法确认所鉴定出的基因是否为主效基因。而QTL定位法所鉴定的候选基因区域跨度较大，通常包含上百个基因，这极大地限制了复杂性状分子标记在家畜遗传育种中的应用。
相较于候选基因法和QTL定位法，全基因组关联分析(genome-wide associationstudy，GWAS)可以更准确的定位和识别新基因。GWAS是基于SNP间的连锁不平衡，通过统计分析策略来鉴别影响表型和基因型之间关系的分析方法，在鉴别影响种猪重要经济性状的分子标记方面发挥了重要作用。目前，使用连锁分析法和GWAS的方法已在猪基因组上鉴别到超过560个与日增重性状相关的QTL和大量单核苷酸多态位点(single nucleotidepolymorphisms，SNP)，将其中具有显著效应的SNP加入到分子标记辅助选择(markerassisted selection，MAS)中则能显著提高平均日增重的遗传改良进展，进而提高后代商品猪的平均日增重，提高经济效益，增强商品猪生产的竞争力。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记，该分子标记可应用于种猪提高日增重的遗传改良中，可提高后代猪的日增重，提高企业利润，增加核心竞争力。
本发明的另一目的在于提供上述位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的应用。
本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的引物对。
本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体上第162192627位T>C突变；
所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是T或C，导致猪日增重的不同；
所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的SNP位点为SEQIDNO:1序列标注位置为87位的C87-T87的核苷酸突变(位于该序列片段第87核酸单碱基突变，命名为：g.87C>T)；
所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记在鉴定猪日增重相关性状和遗传育种中应用；
一种利用上述位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记筛选高日增重的猪品种的方法，包含如下步骤：
检测猪1号染色体上上述位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记，所述的分子标记的SNP位点(5’端第87位单核苷酸)是T还是C，淘汰C保留T；
所述的猪优选为美系杜洛克及其合成系；
一种用于鉴定上述位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的引物对，包含引物primer-F和primer-R，其核苷酸序列如下：
P001-F：5’-CTGTGTCCCAAGATCCCTGT-3’；
P002-R：5’-TGATGAGTGACCAGGCAGAG-3’；
所述的引物对在鉴定影响猪日增重性状中的应用；
所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用；
所述的引物对在提高猪日增重中的应用；
一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：
确定种猪核心群中的种猪的上述猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述的种猪继代群中选择国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第162192627位点为TT基因型的种猪个体，淘汰在第162192627该位点为CC、TC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而提高后代猪的日增重；
所述的猪优选为美系杜洛克及其合成系；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过GWAS分析策略研究并确定影响猪平均日增重的显著SNP，验证其对日增重性状的影响效应。将其用于分子标记辅助选择中，建立高效准确的分子标记辅助育种技术，选择对提高平均日增重有利的基因型进行留种，从而逐代提高优势等位基因的基因频率，加快种猪育种改良的进程，为生猪养殖带来巨大经济效益。
(2)本发明提供一种用于鉴定上述位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确的对性状进行选育，加快育种进程，将其应用于日增重相关性状遗传改良中，从而增加猪的日增重，进而提高企业利润，增加核心竞争力。
附图说明
图1是美系杜洛克猪在1号染色体上关于日增重性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-log P值。
图2是不同基因型猪的日增重结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、实验动物
本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种美系杜洛克3916头，为种猪分公司核心群，群体系谱记录详细。本实验所选取该资源群体中的3916头美系杜洛克种猪在饲养过程中，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
2、样本采集
收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇中，置于-20℃冰箱保存备用。
3、猪全基因组50K SNP判型
从上述资源群体中选取的3916头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Bμffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。
DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，最终得到38790个SNP的有效基因型数据。
4、全基因组关联分析(GWAS)
为了消除群体层化效应，本发明采用GEMMA软件中的线性混合模型进行GWAS分析，模型中加入亲缘关系对群体结构进行校正，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferroni法确定SNP与日增重性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.29e-6，即0.05/38790(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.58e-5，即1/38790(有效SNP数量)。
GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在美系杜洛克1号染色体中存在显著影响日增重的位点，最强关联的SNP为g.87T>C(P＝1.10e-8)(SEQ NO.1中第87位核苷酸，即对应于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体上第162192627位T>C突变)。
5、不同基因型与日增重表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的SNP位点g.87T>C与日增重性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的日增重性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的日增重，进而加快育种进程。
另外根据表1及图1、图2可知，TT型比TC型、CC型的日增重高，而TC型比CC型的日增重高，说明等位基因C对种猪日增重是不利的，故优先保留TT型的种猪。日增重是衡量猪生长性能的重要指标，提高猪的日增重有利于降低生产成本。因此，淘汰CC、TC基因型的猪可带来更多的经济效益，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC、TC型的种猪，保留TT型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因T的频率。
表1分子标记的SNP位点g.87T>C与日增重的相关性
实施例2目的DNA序列扩增及测序
(1)引物设计
通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的1号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。
设计的引物的DNA序列如下所示：
P001-F：5’-CTGTGTCCCAAGATCCCTGT-3’，
P002-R：5’-TGATGAGTGACCAGGCAGAG-3’；
(2)PCR扩增
10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
(3)DNA序列测定
DNA序列测序鉴定在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。
测序结果如下所示：
注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。
实施例3分子标记的SNP位点g.87T>C效应分析
本发明提供一个能显著增加杜洛克猪日增重的SNP标记，使用该SNP进行标记辅助选择，能够极大地增加杜洛克种猪瘦肉率育种进程。通过对分子标记辅助选择，若本发明将影响猪日增重性状的分子标记的CC型个体全部选育成TT型个体，假设猪养殖至160天出栏，则每头猪出栏可多增重1.76kg，按照50％的屠宰率估算，一个规模化万头猪场可多提供8.8吨猪肉，这将给企业带来巨大的经济效益。
本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第87个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的日增重性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记及应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 165
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记
<400> 1
ctgtgtccca agatccctgt gttctaccat gtgctgggtc ctatgaggta aggccaaaag 60
attgtctcat gtttgctttt tgagtcmtaa tgtcagatgc tgttggcagt catcagccag 120
ggcattctgc agcgactctg ctgagctctg cctggtcact catca 165
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P001-F
<400> 2
ctgtgtccca agatccctgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物P002-R
<400> 3
tgatgagtga ccaggcagag 20

Claims (10)

1.一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记，其特征在于其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体上第162192627位T>C突变；
所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其中序列中的M是T或C，导致猪日增重的不同。
2.权利要求1所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记在鉴定猪日增重相关性状和遗传育种中应用。
3.一种利用权利要求1所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记筛选高日增重的猪品种的方法，其特征在于包含如下步骤：
检测猪1号染色体上权利要求1所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记，所述的分子标记的SNP位点是T还是C，淘汰C保留T。
4.根据权利要求3所述的利用位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记筛选高日增重的猪品种的方法，其特征在于：
所述的猪为美系杜洛克及其合成系。
5.一种用于鉴定权利要求1所述的位于猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的引物对，其特征在于包含引物primer-F和primer-R，其核苷酸序列如下：
P001-F：5’-CTGTGTCCCAAGATCCCTGT-3’；
P002-R：5’-TGATGAGTGACCAGGCAGAG-3’。
6.权利要求5所述的引物对在鉴定影响猪日增重性状中的应用。
7.权利要求5所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用。
8.权利要求5所述的引物对在提高猪日增重中的应用。
9.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于包含如下步骤：
确定种猪核心群中的种猪的权利要求1所述的猪1号染色体上与猪日增重相关的SNP分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述的种猪继代群中选择国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第162192627位点为TT基因型的种猪个体，淘汰在第162192627该位点为CC、TC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而提高后代猪的日增重。
10.根据权利要求9所述的猪的遗传改良的方法，其特征在于：
所述的猪为美系杜洛克及其合成系。
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