CN113355429B - 一种鉴定猪背膘厚和达100kg体重日龄的SNP标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定猪背膘厚和达100kg体重日龄的SNP标记及其应用，该标记落在SYNE1基因内，具体位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处，具有T/C多态性。本发明提供的与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记，丰富了猪育种的分子标记，可以通过选择该位点的基因型为CC的猪来筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪个体，缩短了猪育种周期，加快了猪优良生长性状育种的步伐，同时提高了猪养殖业的经济效益与社会价值。
Description
技术领域
本发明属于猪育种技术领域，具体涉及与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记、检测方法和用途。
背景技术
猪的生长性状在猪遗传改良中占有非常重要的地位，该环节成功与否直接影响整个养猪业的经济效益。猪的生长性状多为数量性状，受许多基因的调控，研究基因与生长性状之间的关系对加速生长性状的遗传改良非常重要。
传统的育种方法是通过选择育种或杂交育种的方式，经历多代选育来不断改良动物的优良性状。由于传统育种技术依赖于育种工作者的经验，往往存在很大的盲目性和不可预测性，而且所需育种年限很长，效果甚微。随着标记辅助选择、遗传标记、全基因组重测序、全基因组高通量SNP(single nucleotide polymorphism)标记定位等分子技术的完善和发展，将分子育种技术和常规育种方法相结合，可以显著缩短育种年限，弥补传统育种中的不足。
猪的生长性状受到品种、性别、日常管理、营养、疾病控制、遗传等多种因素的影响。如何提高和改善猪生长性状一直是国内外研究的热点话题，也是猪育种选择的目标性状之一。其中，猪背膘厚是遗传力较高的性状，容易测量且与其他性状密切相关，可直接反映胴体品质及瘦肉率的高低；猪达100kg体重日龄是评估猪生长速度的重要指标，属于中高等遗传力性状，可以间接反映饲料利用率。大量研究表明，猪达100kg体重日龄越短，生长速度越快，可以减少猪场的生产成本，从而提高经济效益。因此在生产和育种中十分重视对背膘厚和达100kg体重日龄性状的选择。
但是，目前缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记。
发明内容
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，首次在SYNE1基因上发现了与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记，其位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处，具有T/C多态性，可以通过选择该位点的基因型为CC的猪来筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪个体，缩短猪育种周期，提高养殖业的经济效益与社会价值，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
本发明提供了一种与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记，其中，所述SNP标记位于SYNE1基因上。
其中，所述与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处，具有T/C多态性。
其中，所述位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点的基因型为CC的猪，相较于基因型为CT的猪，具有较低的背膘厚和较短的达100kg体重日龄。
本发明还提供了一种上述SNP标记的获取方法，其中，所述方法包括以下步骤：
步骤I，选取猪群体，提取个体的基因组DNA，并测定表型数据；
步骤II，进行基因型检测；
步骤III，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
其中，步骤I中，对获得的表型数据进行质量控制，所述质量控制包括清除表型值缺失的个体以及清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
其中，所述步骤II包括以下子步骤：
步骤II-1，对基因组DNA进行扩增；
步骤II-2，对扩增产物进行SAP消化处理；
步骤II-3，对消化处理后的产物进行单碱基延伸反应；
步骤II-4，将延伸产物进行质谱检测。
其中，步骤II-2中，所述消化处理的反应条件为：首先37℃孵育40min，然后85℃孵育5min。
其中，所述关联分析采用的分析模型为：
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。本发明还提供了一种上述SNP标记在筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪群体方面的应用，其中，所述应用包括以下步骤：
步骤i，提取待测猪的基因组DNA；
步骤ii，检测待测猪个体位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的基因型；
步骤iii，根据基因型筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪群体。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明提供的与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记，可用于猪的早期选育，降低育种成本，缩短育种周期，促进猪的育种进程；
(2)本发明提供的与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记，可以通过直接鉴定该标记来筛选更低背膘厚和更短达100kg体重日龄的猪品系，提高了养殖企业以及整个生猪养殖业的经济效益与社会价值；
(3)本发明提供的鉴定或者辅助鉴定猪背膘厚和达100kg体重日龄的方法，操作简单，鉴定准确性高，可以为猪生产性状的分子标记辅助选择提供科学依据。
附图说明
图1示出本发明实施例1中基因型效应的箱线图。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
本发明的第一方面，提供了一种与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记，其位于SYNE1基因上。
其中，SYNE1基因与nesprin-1蛋白合成有关，该蛋白是一种肌动蛋白纤维，位于核外膜上，该蛋白质的N-末端与F-肌动蛋白相连，可以介导肌细胞核与细胞骨架的连接，广泛表达于各种组织上，尤其在横纹肌上表达丰富。因此，推测该基因会影响动物的产肉性状。
根据本发明一种优选的实施方式，所述与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处。
其中，该SNP位点在Ensembl上对应的位点号为rs324114713。
在进一步优选的实施方式中，所述位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记具有T/C多态性。
优选地，所述SNP标记位于SEQ ID NO.1所示核苷酸片段的第202个核苷酸处，该位点碱基的差异导致猪背膘厚和达100kg体重日龄的不同。
在本发明中，优选所述SNP位点的碱基与SEQ ID NO.1所示核苷酸片段第202个核苷酸处的碱基互补。
在更进一步优选的实施方式中，所述位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点的基因型为CC的猪，相较于基因型为CT的猪，具有较低的背膘厚和较短的达100kg体重日龄。
其中，所述位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点具有两种基因型，CC和CT，CC基因型是该SNP位点为碱基C的纯合子，CT基因型是该位点为碱基C和T的杂合子。
因此，可以通过选育位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点的CC型个体作为种猪，以筛选出更低背膘厚和更短达100kg体重日龄的猪。
为获得与猪背膘厚和达100kg体重日龄的基因型类型，首先需要获得该SNP位点的基因分型信息。
根据本发明一种优选的实施方式，所述SNP位点的基因分型采用Sequenom技术进行。
其中，Sequenom技术利用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，其主要步骤是：首先PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过飞行时间检测器检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。
由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现。
由上述可知，在对SNP位点进行基因分型的过程中涉及PCR扩增反应和单碱基延伸反应。
在进一步优选的实施方式中，所述位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的PCR扩增反应的引物为P1和P2，所述引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
在更进一步优选的实施方式中，所述位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的单碱基延伸引物为P3、P4和P5，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在本发明中，SNP标记的单碱基引物具有3条，分别为UEP(P3)、EXT1(P4)和EXT2(P5)，其中，UEP为延伸引物，EXT1和EXT2为针对位点不同基因型设计的检测引物。上述引物对优选采用Sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1，综合考虑引物设计的各项原则设计得到。
本发明的第二方面，提供了一种基因分型试剂盒，优选用于对第一方面所述的SNP标记进行基因分型，
所述基因分型试剂盒包括PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
优选地，所述PCR扩增引物包括位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的PCR扩增引物P1和P2；
所述单碱基延伸引物包括位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的单碱基延伸引物P3、P4和P5。
其中，所述扩增引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述单碱基延伸引物P3～P5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
更优选地，所述基因分型试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶、SAP缓冲液和SAP(碱性磷酸酶)。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测第一方面所述SNP标记的引物对，其中，
所述用于检测位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的引物对为P1和P2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
在本发明中，采用上述引物对对猪的基因组DNA进行扩增，能够获得含有上述SNP标记位点的核苷酸片段(如SEQ ID NO.1所示的序列)，进而通过测序能够判定相应SNP位点的T/C多态性。
本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第三方面所述引物对在鉴定猪背膘厚和达100kg体重日龄，或者在猪繁殖育种中的应用。
其中，所述猪繁殖育种优选为分子标记辅助选择育种。
本发明的第五方面，提供了一种检测第一方面所述SNP标记的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，提取猪基因组DNA。
其中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪的基因组DNA，优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。
步骤2，对基因组DNA进行扩增。
在本发明中，优选采用如核苷酸序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物P1和P2对猪基因组DNA进行扩增，获得包括位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的核苷酸片段。
优选地，所述PCR扩增的体系包括10×PCR Buffer(15mM MgCl2)、MgCl2(25mM)、dNTP mix(25mM)、引物混合物(0.5μM)、HotstarTaq(5U/μl)和水(HPLC grade)。
更优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃∞。
步骤3，检测SNP位点的多态性。
其中，对扩增得到的PCR产物进行测序分析，判读SNP标记位点的多态性。
本发明的第六方面，提供了一种第一方面所述与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记的获取方法，所述方法包括以下步骤：
步骤I，选取猪群体，提取个体的基因组DNA，并测定表型数据。
其中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪的基因组DNA，优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。
在本发明中，所述猪群体的表型数据为猪背膘厚和达100kg体重日龄。
具体地，在猪个体体重处于85～105kg范围时，测定活体背膘厚，优选采用B超扫描测定群体中猪个体的倒数第3～4肋间处背膘厚，以毫米为单位。然后，按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×CF(其中：CF＝A÷{A+[B×(实测体重-100)]})。
其中，A/B为不同猪种背膘厚度校正系数。
公猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.826040；
母猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.714615。
测定达100kg体重日龄时，称重前进食12小时，采用电子称重台称重，记录猪的体重和测定时的实际日龄。然后对猪达100kg体重的实际日龄进行校正，利用河北省地方标准(DB-13/T 2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正，
具体按下述校正公式进行：
校正日龄＝测定日龄(d)-[(实测体重(kg)-100)/CF]
其中，公猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.826040；母猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.714615。。
对测定后的表型数据进行质量控制：清除表型值缺失的个体，清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
步骤II，进行基因型检测。
根据本发明一种优选的实施方式，优选按照包括以下步骤的方法进行基因分型检测：
步骤II-1，对基因组DNA进行扩增。
在本发明中，优选采用如核苷酸序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物P1和P2对猪基因组DNA进行扩增，获得包括位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的核苷酸片段。
优选地，所述PCR扩增的体系包括10×PCR Buffer(15mM MgCl2)、MgCl2(25mM)、dNTP mix(25mM)、引物混合物(0.5μM)、HotstarTaq(5U/μl)和水(HPLC grade)。
更优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃∞。
步骤II-2，对扩增产物进行SAP消化处理。
其中，对PCR扩增产物进行碱性磷酸酶(SAP)处理，是为了除去游离的dNTP和剩余扩增引物。
在本发明中，所述进行碱性磷酸酶处理的体系包括超纯水、10×SAP Buffer和SAP(1.7U/μl)。将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min使SAP酶充分发挥作用，85℃孵育5min使SAP酶失活，4℃维持步骤II-3，对消化处理后的产物进行单碱基延伸反应。
其中，进行单碱基延伸反应能够检测单碱基或插入/缺失多态性。
在本发明中，所述基因分型优选采用基因分型试剂盒进行，如基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set 384Kit。
所述单碱基延伸的体系包括超纯水、10×iPLEX Buffer plus、iPLEXterminator、引物混合物(0.6～1.3μM)和iPLEX酶。
所述单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s；4℃∞。
优选地，所述单碱基延伸引物为P3、P4和P5，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
步骤II-4，将延伸产物进行质谱检测。
其中，将延伸产物稀释后，使用树脂进行脱盐，以降低质谱仪的背景噪声；然后将样品点在样品靶上，自然结晶，采用质谱仪进行质谱检测，收集数据，获得SNP标记的基因型。
优选地，在分型过滤时，清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(Minimum Allele Frequency，MAF)小于1％的个体。
步骤III，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
根据本发明一种优选的实施方式，利用GEMMA软件的混合线性模型进行统计分析，所述分析模型为：
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
通过上述分析，可以获得与猪背膘厚和达100kg体重日龄显著相关的SNP标记，以及低背膘厚和达100kg体重日龄短的基因型。
本发明的第七方面，提供了一种鉴定或者辅助鉴定猪背膘厚和达100kg体重日龄的方法，所述方法包括确定待测猪个体位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的基因型的步骤。
其中，若待测猪个体上述SNP位点处的基因型为CC，则具有较低的背膘厚和较短的达100kg体重日龄；若待测猪上述SNP位点处的基因型为CT，则具有较高的背膘厚和较长的达100kg体重日龄。
本发明的第八方面，提供了一种第一方面所述SNP标记在筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪群体方面的应用，所述应用包括以下步骤：
步骤i，提取待测猪的基因组DNA。
步骤ii，检测待测猪个体位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的基因型。
其中，所述基因型检测可以采用直接测序法或试剂盒法进行，本发明中优选采用试剂盒法进行，所述试剂盒优选采用第二方面所述基因分型试剂盒。
步骤iii，根据基因型筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪群体。
其中，位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点的基因型为CC的猪为低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪。
本发明的第九方面，提供了一种猪背膘厚和达100kg体重日龄的遗传改良方法，所述方法包括确定猪个体位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点的基因型，并根据基因型进行相应选择的步骤。
优选地，种猪的继代选择位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点的基因型为CC的个体，淘汰该SNP位点基因型为CT的个体，以逐代提高该位点的纯合基因型CC的频率，从而降低背膘厚，缩短达100kg体重日龄。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1
1、试验动物
本实施例所采用的试验猪群体为河北衡水种猪场的约克夏纯种猪，共384头，其中公猪27头，母猪357头。
2、背膘厚(ABFT)和达100kg体重日龄(A100D)的测定与校正
在猪个体体重处于85～105kg范围时，测定活体背膘厚，采用B超扫描测定群体中猪个体的倒数第3～4肋间处背膘厚，以毫米为单位。然后，按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×CF(其中：CF＝A÷{A+[B×(实测体重-100)]})。
其中，A/B为不同猪种背膘厚度校正系数，约克夏猪(大白猪)的A为13.706，B为0.119624；
公猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.826040；
母猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.714615。
称重前进食12小时，采用电子称重台称重，记录猪的体重和测定时的实际日龄。然后对猪达100kg体重的实际日龄进行校正，利用河北省地方标准(DB-13/T 2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正，
具体按下述校正公式进行：
校正日龄＝测定日龄(d)-[(实测体重(kg)-100)/CF]
其中，公猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.826040；
母猪CF值＝[实测体重(kg)/测定日龄(d)]×1.714615。
对测定后的表型数据进行质量控制：清除表型值缺失的个体，清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
3、提取猪基因组DNA
采集384头猪耳组织样4份/头，其中1份用于个体DNA提取；
参考天根生物科技公司组织DNA提取试剂盒说明书，提取按以下步骤顺序进行：
(1)先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入68mL和200mL无水乙醇，充分混匀。
(2)采集组织样约100mg置于2mLEP管内，完全剪碎后加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
(3)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，随后以12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，以12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。
经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。
4、基于Sequenom平台的SNP分型检测
采用基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set384Kit进行分型检测。
(1)以提取的384个约克夏纯种猪的DNA为模板，用PCR扩增引物P1和P2进行扩增，采用的扩增体系如下：
所述PCR扩增的反应条件为：94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃∞。
(2)对PCR扩增产物进行SAP消化处理，反应体系如下：
将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min，85℃孵育5min，4℃维持。
(3)向消化处理后的体系中加入单碱基延伸引物，进行延伸反应，反应体系如下：
其中，单碱基延伸引物为P3、P4和P5。
单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s；4℃∞。
(4)将反应产物(共9μL)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；采用MassArray质谱仪进行质谱检测，收集数据，判读rs324114713位点的基因型。
分型的过滤时清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(Minimum Allele Frequency，MAF)小于1％的个体。
采用PopGene 3.2计算rs324114713位点在试验群体中的基因型频率和等位基因频率，结果如表1所示。
表1
由表1可知，在rs324114713位点检测到两个基因型：CC型和CT型，并且CC基因型为猪校正背膘厚和达100kg体重日龄的优势基因型。
5、采用GEMMA统计分析软件的混合线性模型进行统计分析分析模型为
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
关联分析的结果如表2所示：
表2
其中，P＜0.1代表差异极显著。
由表2可知，rs324114713位点与猪校正背膘厚和达100kg体重日龄显著相关(P<0.1)。在rs324114713突变个体中，CC型个体校正背膘厚显著低于CT型个体(P<0.1)；CC型个体达100kg体重日龄显著短于CT型个体(P<0.1)。
进一步地，采用QQ-plot软件绘制两种基因型效应的箱线图，结果如图1所示。
由图1可知，CC基因型的个体校正背膘厚(16.89mm)比CT基因型(18.44mm)的低1.55mm，CC基因型的个体校正达100kg体重日龄(160.45天)比CT基因型(160.14天)的低0.31天。
综上可知，继代选育rs324114713位点的CC型纯合子个体的种猪可逐步降低猪群体校正背膘厚，缩短达100kg体重日龄，可以作为选择校正背膘厚和达100kg体重日龄优秀种猪的分子标记。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 一种鉴定猪背膘厚和达100kg体重日龄的SNP标记及其应用
<130> 2020
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 402
<212> DNA
<213> 核苷酸片段（Sus scrofa）
<400> 1
catcacaaat actttctgaa aaaatcctcc aaatgtatat atctttctga gtagatttca 60
acagcatcaa tttaaaaaaa aaaaaaagtc ccagagttga gtagctggca tatctctgtg 120
atgaatatcc ttcagtggca tgcttttatt ctacaggaaa tacaaaaaga gcttcaaagt 180
cagcaaagca acatcagctc cgcccaagaa aatctcaata gcctgtgccg caagtaccac 240
tcggtggagt tggagagctt gggcagtgcg atgaccgggc tgattaagag acacgaggct 300
gtgagccagt cttgctccaa gacgcaggcc agccttcagg agtcgctgga aaaacacttc 360
catggtgagc tcccagaggc cttcgcgtga atagtttgtt ta 402
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增引物P1（人工序列）
<400> 2
acgttggatg gagcttcaaa gtcagcaaag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增引物P2（人工序列）
<400> 3
acgttggatg gagcttcaaa gtcagcaaag 30
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P3（人工序列）
<400> 4
aagtcagcaa agcaacatca gctcc 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P4（人工序列）
<400> 5
aagtcagcaa agcaacatca gctcca 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P5（人工序列）
<400> 6
aagtcagcaa agcaacatca gctccg 26
Claims (6)
1.一种与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记在筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪群体中的应用，其特征在于，
所述与猪背膘厚和达100kg体重日龄相关的SNP标记位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处，具有T/C多态性；
所述应用包括以下步骤：
步骤i，提取待测猪的基因组DNA；
步骤ii，检测待测猪个体位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP标记的基因型；
步骤iii，根据基因型筛选低背膘厚和达100kg体重日龄短的猪群体；
所述位于国际猪基因组11.1版本参考序列1号染色体第13,937,363个核苷酸处的SNP位点的基因型为CC的猪，相较于基因型为CT的猪，具有较低的背膘厚和较短的达100kg体重日龄；
所述猪为约克夏纯种猪。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNP标记的获取方法包括以下步骤：
步骤I，选取猪群体，提取个体的基因组DNA，并测定表型数据；
步骤II，进行基因型检测；
步骤III，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤I中，对获得的表型数据进行质量控制，所述质量控制包括清除表型值缺失的个体以及清除与平均值的偏差大于3倍标准差的个体。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤II包括以下子步骤：
步骤II-1，对基因组DNA进行扩增；
步骤II-2，对扩增产物进行SAP消化处理；
步骤II-3，对消化处理后的产物进行单碱基延伸反应；
步骤II-4，将延伸产物进行质谱检测。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤II-2中，所述消化处理的反应条件为：首先37℃孵育40min，然后85℃孵育5min。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述关联分析采用的分析模型为：
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
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| CN107828898A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-03-23 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 与猪100公斤体重背膘厚相关的snp分子标记及其应用 |
| CN107828896A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-03-23 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 与猪达100公斤体重日龄相关的snp分子标记及其应用 |
| CN110541038A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-12-06 | 华南农业大学 | 一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的snp分子标记及应用 |
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-
2020
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Patent Citations (3)
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| http://www.sep2019.archive.ensembl.org/.rs324114713.《Ensembl》.2019,全文. * |
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| rs324114713;http://www.sep2019.archive.ensembl.org/;《Ensembl》;20190930;全文 * |
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