CN112941199B - 一种评估猪背膘厚和眼肌面积的方法及其应用 - Google Patents

一种评估猪背膘厚和眼肌面积的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种评估猪背膘厚和眼肌面积的SNP标记及鉴定方法和用途，该SNP标记在ENSSSCG00000004081基因上，位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处，具有T/C多态性。本发明所述评估猪背膘厚和100kg眼肌面积相关的SNP标记的确定，可以辅助选择低背膘厚和高眼肌面积的猪优势品种，缩短了育种周期，提高了育种效率和育种精度。

Description

一种评估猪背膘厚和眼肌面积的方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种评估猪背膘厚和眼肌面积的SNP标记、方法和用途。
背景技术
在猪的养殖过程中，生产性能一直是饲养过程中的重要影响因素，直接关系到整个养猪业的经济效益。猪背膘厚和眼肌面积是数量性状，在猪育种中的具有较高的育种价值。因此，有必要对猪背膘厚和眼肌面积性状形成的分子机制进行深入研究，为进行猪基因组育种提供基础。
微效多基因是指影响表型的基因数量众多，但每个基因效应微小，不能把它们个别的作用区别开来的一类基因。微效多基因主要与数量性状有关，对性状的影响有累加作用，而数量性状表型一般呈连续变异的特征，且易受环境影响。发生在单个碱基上的变异表现为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，此类变异包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记数量很多，且多态性丰富。SNP标记已经广泛应用于分子育种的遗传连锁图构建和候选基因定位，极大地提高了遗传图谱的分辨率以及基因定位的精确度。
相关研究者利用高密度的遗传图谱和适用于特定性状的分离群体在多个群体中定位出控制重要性状的基因和重要数量性状位点(Quantitative Trait Locus,QTL)，目前，通过QTL定位分析以发现了多个与猪生长速度相关的基因，如GH，IGF1，PIT1等。Andersson等利用野公猪与大白猪建立了三个世代的家系，并对生长性状的QTL进行了定位，结果表明第4号染色体上有一个与背膘厚和腹脂相关的QTL，第13号染色体上有一个与生长速度有关的QTL。
在目前研究的候选基因中，以生长激素(Growthhormone，GH)基因，类胰岛素生长因子-1(Insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)基因和PIT1基因等基因的研究较多。早期研究发现，外源生长激素可提高猪的日增重、瘦肉率和饲料转化率，降低背膘厚，但对不同的品种，GH的效应有所不同。Nielsen等报道，GH不同遗传位点变异型的转录活性不同，其中转录活性高的变异型导致血浆中GH的含量升高，从而提高了猪的生长速度；Knorr等对GH位点进行了RFLP分析，发现在中国梅山猪与皮特兰杂交的F2群体中，GH基因的突变与胴体组成性状间存在着显著的相关，且GH变异位点可解释11.7％～17.7％的总表型方差；Cassas-Carrillo等将GH基因和IGF-1基因作为猪生长性状和胴体性状的候选基因，对不同基因型与生长性状和胴体性状的关系进行了分析，结果表明IGF-1基因与猪的日增重密切相关；u等通过候选基因分析法发现，PIT1基因是与猪出生重和背膘厚相关的主效基因，且位于Andersson等发现的第13号染色体上与生长速度有关的QTL中。其它基因如主要组织相容性复合体(MHC)，RYR1基因等与猪生长性状的关系，也有不少学者进行了研究。
尽管现有技术对于猪生长性状相关基因进行了大量研究，但是对于猪的背膘厚和眼肌面积这两种性状的分子机制和关联位点的研究尚不明确，缺乏可直接用于评估猪背膘厚和眼肌面积的工具及方法。
发明内容
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，首次在ENSSSCG00000004081基因上发现了与猪背膘厚和100kg眼肌面积相关的SNP标记，其具有T/C多态性，可以通过鉴定该SNP标记的不同等位基因来筛选猪背膘厚低和100kg眼肌面积高的猪个体，从而丰富了用于猪育种的SNP标记，缩短了育种周期，提高猪群的经济效益与社会价值，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
第一方面，提供一种评估猪背膘厚和眼肌面积的SNP标记，其中，所述SNP标记位于ENSSSCG00000004081基因上。
其中，所述SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处；
所述SNP标记具有T/C多态性。
其中，所述国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC猪有更低的背膘厚和更高的眼肌面积.
第二方面，提供一种用于检测第一方面所述SNP标记的引物对，其中，
所述引物对为P1和P2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
第三方面，提供一种第一方面所述的SNP标记或第二方面所述的引物对在鉴定猪背膘厚和眼肌面积，或者在猪繁殖育种中的应用。
第四方面，提供一种筛选第一方面所述SNP标记的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
步骤1，提取猪的基因组DNA；
步骤2，进行基因分型；
步骤3，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
第五方面，提供一种第一方面所述的SNP标记或第四方面所述方法筛选得到的SNP标记在鉴定猪背膘厚和眼肌面积方面的应用。
第六方面，提供一种第一方面所述的SNP标记或第四方面所述方法筛选得到的SNP标记在筛选低背膘厚和高眼肌面积猪群体方面的应用，其中，所述应用包括以下步骤：
步骤I，提取待测猪的基因组DNA；
步骤II，检测待测猪位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型；
步骤III，根据基因型筛选低背膘厚和高眼肌面积猪群体。
第七方面，提供一种鉴定或辅助鉴定猪背膘厚及眼肌面积的方法，所述方法包括确定国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型的步骤。
第八方面，提供一种猪背膘厚和眼肌面积性状的遗传改良方法，所述方法包括确定猪位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型，并根据基因型进行相应选择的步骤。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明所提供的与猪背膘厚和100kg眼肌面积相关的SNP，可以增加优良猪种的选育速度，加快猪分子育种的步伐；
(2)本发明所提供的与猪背膘厚和100kg眼肌面积相关的SNP，从一定程度上为低背膘厚和高眼肌面积的猪育种提供切实可行的方案，提高猪生产企业的经济效益；
(3)本发明所提供的与猪背膘厚和100kg眼肌面积相关的SNP，可以通过鉴定该SNP标记的不同等位基因来筛选猪背膘厚低和100kg眼肌面积高的猪个体，从而提高猪群的经济效益与社会价值。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
本发明的第一方面，提供了一种与猪背膘厚和眼肌面积相关的SNP标记，所述标记位于ENSSSCG00000004081基因上。
其中，所述猪眼肌面积优选为猪达100kg体重的眼肌面积，所述眼肌面积为猪背最长肌的横断面面积。
优选地，所述SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处。
其中，所述Chromosome1:16,077,935处指的是1号染色体第16,077,935位碱基。
在本发明中，所述SNP标记在Ensembl上对应的位点号为rs330973858。
根据本发明一种优选的实施方式，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记具有T/C多态性。
其中，所述位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸片段的第251bp处，该位点碱基的差异导致猪背膘厚和眼肌面积的不同。
在本发明中，所述SNP位点对应的三种基因型分别为TT、TC和CC，TT基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基均为T，TC基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基为T和C，CC基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基均为C。
优选地，所述国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC猪有更低的背膘厚和更高的眼肌面积。
因此，可以通过选育rs330973858核苷酸位点的TT型个体作为种猪，就能够筛选出更低背膘厚和更高眼肌面积的猪。
为获得与猪背膘厚和100kg眼肌面积相关的基因型类型，首先需要获得猪该SNP位点的基因分型信息。
根据本发明一种优选的实施方式，所述SNP位点的基因分型采用Sequenom技术进行。
其中，Sequenom技术利用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，其主要步骤是：首先PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过飞行时间检测器检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。
由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现。
由上述可知，在对SNP位点进行基因分型的过程中涉及PCR扩增反应和单碱基延伸反应。
优选地，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的PCR扩增反应的引物为P1和P2，所述引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。
更优选地，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的单碱基延伸引物为P3、P4和P5，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在本发明中，SNP标记的单碱基引物具有3条，分别为UEP、EXT1和EXT2，其中，UEP为延伸引物，EXT1和EXT2为针对位点不同基因型设计的检测引物。
其中，上述引物对优选采用Sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1，综合考虑引物设计的各项原则设计得到。
本发明的第二方面，提供了一种基因分型试剂盒，优选用于对第一方面所述的SNP标记进行基因分型，
所述基因分型试剂盒包括PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
优选地，所述PCR扩增引物包括位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的PCR扩增引物P1和P2；
所述单碱基延伸引物包括位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的单碱基延伸引物为P3、P4和P5。
其中，所述引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述引物P3～P5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
更优选地，所述基因分型试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶、SAP缓冲液和SAP(碱性磷酸酶)。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测第一方面所述SNP标记的引物对，其中，
所述用于检测位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的引物对为P1和P2，所述P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
在本发明中，采用上述引物对对待测猪个体的基因组DNA进行扩增，能够获得含有上述SNP标记位点的核苷酸片段(如SEQ ID NO.1所示的序列)，进而能够判定相应SNP位点的碱基类型。
本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第三方面所述引物对在鉴定猪背膘厚和眼肌面积，或者在猪繁殖育种中的应用。
其中，所述猪繁殖育种优选为分子标记辅助选择育种。
本发明的第五方面，提供了一种筛选第一方面所述SNP标记的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，提取猪的基因组DNA。
其中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪的基因组DNA，优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。
步骤2，进行基因分型。
根据本发明一种优选的实施方式，优选按照包括以下步骤的方法进行基因分型检测：
步骤2-1，对基因组DNA进行扩增。
在本发明中，优选采用如核苷酸序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物P1和P2对猪基因组DNA进行扩增。
优选地，所述PCR扩增的体系包括10×PCR Buffer(15mM MgCl2)、MgCl2(25mM)、dNTP mix10(25mM)、引物混合物(0.5μM)、HotstarTaq(5U/μl)和水(HPLC grade)。
更优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃∞。
步骤2-2，对扩增产物进行SAP消化处理。
其中，对PCR扩增产物进行碱性磷酸酶(SAP)处理，以除去游离的dNTP和剩余扩增引物。
在本发明中，所述进行碱性磷酸酶处理的体系包括超纯水、10×SAP Buffer和SAP(1.7U/μl)。将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min使SAP酶充分发挥作用，85℃孵育5min使SAP酶失活，4℃维持。
优选地，对扩增得到的PCR产物进行测序分析，判读SNP标记位点的多态性。
步骤2-3，对消化处理后的产物进行单碱基延伸反应。
其中，进行单碱基延伸反应能够检测单碱基或插入/缺失多态性。
在本发明中，所述基因分型优选采用基因分型试剂盒进行，如基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set 384 Kit。
所述单碱基延伸的体系包括超纯水、10×iPLEX Buffer plus、iPLEXterminator、引物混合物(0.6～1.3μM)和iPLEX酶。
所述单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s；4℃∞。
优选地，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的单碱基延伸引物为P3、P4和P5，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
步骤2-4，将延伸产物进行质谱检测。
其中，将延伸产物稀释后，使用树脂进行脱盐，以降低质谱仪的背景噪声；然后将样品点在样品靶上，自然结晶，采用质谱仪进行质谱检测，收集数据，获得SNP标记的基因型。
步骤3，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
其中，在进行关联分析之前，先获得猪群体的表型数据。
在本发明中，优选在猪个体体重处于85～105kg范围时测定其眼肌面积，采用B超扫描测定猪倒数第1～2肋骨间背最长肌的横断面面积，以平方厘米为单位，然后河北省地方标准(DB 13/T2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正。
优选地，按照如下校正公式转换成达100kg体重的活体眼肌面积：
校正眼肌面积(cm2)＝实际眼肌面积(cm2)+{[100-实际体重(kg)]×实际眼肌面积(cm2)}/[实际体重(kg)+70]。
在测定猪个体体重时，同时测定活体背膘厚，优选采用B超扫描测定群体中猪个体的倒数第3～4肋间处背膘厚，以毫米为单位。然后，按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×CF(其中：CF＝A÷{A+[B×(实测体重-100)]})。
其中，A/B为不同猪种背膘厚度校正系数。
公猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.826040；母猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615；
其中：校正日龄＝测定日龄-[(实测体重-100)/CF]，实测体重的单位为kg。
在本发明中，优选对测得的表型数据进行质量控制，以清除表型值缺失的个体。
根据本发明一种优选的实施方式，利用GEMMA软件一般线性模型进行基因型对表型的影响效应分析。
优选地，所述分析模型为：
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
通过上述分析模型，可以获得与猪背膘厚和眼肌面积显著相关的SNP标记，以及低背膘厚和高眼肌面积的基因型。
本发明的第六方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第四方面所述方法筛选得到的SNP标记在鉴定猪背膘厚和眼肌面积方面的应用。
本发明的第七方面，提供了一种第一方面所述SNP标记或第四方面所述方法筛选得到的SNP标记在筛选低背膘厚和高眼肌面积猪群体方面的应用，所述应用包括以下步骤：
步骤I，提取待测猪的基因组DNA。
步骤II，检测待测猪位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型。
步骤III，根据基因型筛选低背膘厚和高眼肌面积猪群体。
其中，位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型为TT的猪为低背膘厚和高眼肌面积的猪。
本发明的第八方面，提供了一种鉴定或辅助鉴定猪背膘厚及眼肌面积的方法，所述方法包括确定国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型的步骤。
其中，位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC或CC的猪具有较低的背膘厚和较高的眼肌面积。
本发明的第九方面，提供了一种猪背膘厚和眼肌面积性状的遗传改良方法，所述方法包括确定猪位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的基因型，并根据基因型进行相应选择的步骤。
优选地，种猪的继代选择国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的个体，淘汰该SNP位点基因型为TC和CC的个体，以逐代提高该位点的纯合基因型TT的频率，从而降低背膘厚、提高眼肌产量。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1
1、试验动物
本实施例所采用的试验猪群体为河北衡水种猪场的约克夏纯种猪，共384头，其中公猪27头，母猪357头。
2、眼肌面积测定与校正
在每头猪个体体重在85-105kg范围内时测定个体的眼肌面积、体重，并记录测定日龄等数据。利用河北省地方标准(DB 13/T 2065-2014)文件《种猪场场内生产性能测定技术规程》的遗传评估性状测定规程对采集的数据进行表型数据校正。同时，对试验猪群体的猪耳朵组织样进行采集，置于PBS缓冲液，低温保存。
在测定体重时，同时测定活体眼肌面积。采用B超扫描测定倒数第1-2肋骨间背最长肌的横断面面积，以平方厘米(cm2)为单位。最后按如下校正公式转换成达100kg体重的活体眼肌面积：
校正眼肌面积(cm2)＝实际眼肌面积(cm2)+{[100-实际体重(kg)]×实际眼肌面积(cm2)}/[实际体重(kg)+70]
3、背膘厚测定与校正
在测定体重时，同时测定活体背膘厚；采用B超仪扫描测定倒数第3～4肋间处的背膘厚，以毫米为单位；最后按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×CF(其中：CF＝A÷{A+[B×(实测体重-100)]})；
其中，公猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.826040；
母猪CF值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615；
校正日龄＝测定日龄-[(实测体重-100)/CF]
在本实施例中，约克夏公母猪背膘厚的校正系数(A/B)如下：
公猪：A：12.402 B：0.106530
母猪：A：13.706 B：0.119624
4、提取猪基因组DNA
采集384头猪的耳组织样4份/头，其中1份用于个体DNA提取；
参考天根生物科技公司组织DNA提取试剂盒说明书，按以下步骤顺序进行DNA提取：
(1)先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入68mL和200mL无水乙醇，充分混匀。
(2)采集组织样约100mg置于2mLEP管内，完全剪碎后加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
(3)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，随后以12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，以12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。
5、基于Sequenom平台的SNP分型检测
采用基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set 384Kit进行分型检测。
(1)以提取的384个约克夏纯种猪的DNA为模板，用PCR扩增引物P1和P2进行扩增，采用的扩增体系如下：
Figure BDA0002663182990000141
Figure BDA0002663182990000151
扩增的反应条件为：
94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃维持。
(2)对PCR扩增产物进行SAP消化处理，反应体系如下：
Figure BDA0002663182990000152
将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min，85℃孵育5min，4℃维持。
(3)向消化处理后的体系中加入单碱基延伸引物，进行延伸反应，反应体系如下：
Figure BDA0002663182990000153
其中，单碱基延伸引物为P3、P4和P5，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s；4℃∞。
(4)将反应产物(共9μL)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；采用MassArray质谱仪进行质谱检测，收集数据，判读rs330973858位点的基因型。
采用PopGene 3.2计算rs330973858位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002663182990000161
6、采用GEMMA软件的一般线性模型对上述SNP位点的基因型对猪背膘厚和眼肌面积的影响效应进行关联分析，采用的分析模型如下：
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
关联分析的结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002663182990000162
由表2可知，在rs330973858突变个体中，基因型为TT的猪背膘厚显著低于TC型和CC型的猪(P<0.1)；且基因型为TT的猪的100kg眼肌面积显著高于TC型和CC型的猪(P<0.1)。
由此可见，在猪群体中，继代选育TT基因型的个体，可以逐代提高该位点TT基因型的频率，培育低背膘厚且眼肌面积大的猪群体，进而达到提高猪的生产效率的目的，为育种生产活动带来较高的效益。
本发明基于Sequenom技术进行基因分型和与表型性状的关联分析，发现了定位于猪ENSSSCG00000004081基因上的SNP位点rs330973858对背膘厚和100kg眼肌面积有显著影响，TT基因型猪背膘厚显著低于TC型和CC型，并且TT型猪100kg眼肌面积显著高于CC型和TC型。因此，可以通过选育rs330973858核苷酸位点的TT型个体作为种猪，就能够筛选出更低背膘厚和更高100kg眼肌面积的猪。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 一种评估猪背膘厚和眼肌面积的方法及其应用
<130> 2019
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 401
<212> DNA
<213> 核苷酸片段（Sus scrofa）
<400> 1
aagtccccta caatttaacc tacagggcat tctttatctg aaccttgaag ttttttcctc 60
actatagagc actaacctta gaaactgtca ttatatcatt gaactgtgtt ttcagttcct 120
cttgagcggt ctccttgaat gactcatcct cagtcttctg gtaaagctcc ctggccttgg 180
caacgagccg ctgcagggct ccagcgtgat cttccgcctc cgatactagg gactgaaaat 240
ggtccagaag cgaaaacttc tctttcagac caggctgcag ttgcaaagga tgttctactt 300
tctgatccac ttcttccatc cactgctcca actggttttt ccactctaga tagtcattcc 360
attggctaat cacagatgct aacgtgctgg aattaatgtc a 401
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增引物P1（人工序列）
<400> 2
acgttggatg tcttctggta aagctccctg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增引物P2（人工序列）
<400> 3
acgttggatg ttcagtccct agtatcggag 30
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P3（人工序列）
<400> 4
ccctgggcgg aagatcacgc tg 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P4（人工序列）
<400> 5
ccctgggcgg aagatcacgc tga 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P5（人工序列）
<400> 6
ccctgggcgg aagatcacgc tgg 23

Claims (4)

1.检测与猪背膘厚相关的SNP分子标记的试剂在鉴定猪背膘厚中的应用，其特征在于，
所述SNP分子标记的SNP位点为国际猪基因组10.2版本参考序列1号染色体上第16,077,935个核苷酸位点；
所述SNP位点具有T/C多态性；
所述SNP位点的基因型为TT的猪的背膘厚低于基因型为TC或CC的猪的背膘厚；
所述猪为约克夏纯种猪。
2.检测与猪背膘厚相关的SNP分子标记的试剂在筛选低背膘厚猪群体中的应用，其特征在于，
所述SNP分子标记的SNP位点为国际猪基因组10.2版本参考序列1号染色体上第16,077,935个核苷酸位点，
所述应用包括以下步骤：
步骤I，提取待测猪的基因组DNA；
步骤II，检测待测猪位于所述SNP位点的基因型；
步骤III，选择所述SNP位点的基因型为TT的猪群体，
所述猪为约克夏纯种猪。
3.一种鉴定或辅助鉴定猪背膘厚的方法，所述方法包括确定国际猪基因组10.2版本参考序列1号染色体上第16,077,935个核苷酸位点的基因型的步骤，所述第16,077,935个核苷酸位点具有T/C多态性，所述第16,077,935个核苷酸位点的基因型为TT的猪的背膘厚低于基因型为TC或CC的猪的背膘厚，所述猪为约克夏纯种猪。
4.一种猪背膘厚性状的遗传改良方法，所述方法包括确定猪位于国际猪基因组10.2版本参考序列1号染色体上第16,077,935个核苷酸位点的基因型的步骤，所述第16,077,935个核苷酸位点具有T/C多态性，选育第16,077,935个核苷酸位点的基因型为TT的猪，所述猪为约克夏纯种猪。
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