CN113699247A - 一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的snp分子标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602个核苷酸位点，该位点的碱基是A或C。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪剩余采食量，选育上述性状的优良种猪，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其 用途

技术领域

本发明涉及一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途。

背景技术

猪肉是人类重要的肉类来源，大约占世界人口消费肉类的40％。受中国人肉食消费习惯影响，我国对猪肉的需求更甚。自八十年代以来，猪肉一直是城乡居民餐桌上的主打肉类，城乡居民猪肉消费始终占到肉类消费的60％以上，占据主导地位。2020年，我国生猪年出栏总数为5.27亿头，占世界生猪出栏数的一半；猪肉产量为4113万吨，占全球猪肉产量的42.02％，同样稳居头号交椅。猪肉消费具有不可替代性，其安全性和有效供给既是关系到老百姓切身利益的大事，也是影响社会发展和稳定的大事。

随着生猪养殖逐渐朝着规模化方向发展，生猪养殖成本越来越被重点关注。生猪养殖的成本包括猪场建设、种猪、饲料、药物和劳动力等，其中饲料费用占比65-80％，是养猪生产中最大投入。另外，养猪场普遍采用配合饲料，对玉米、大豆等农作物的需求量逐年上升，而我国的耕地面积有限，“人猪争粮”的矛盾日益凸显。此外，提高饲料利用效率在降低农作物原材料消耗的同时，还可降低粪便产量和潜在温室气体排放总量。因此，在资源有限的情况下，如何通过合理手段提高猪的饲料利用效率，是当前及将来育种工作中的重点。

饲料利用效率主要反映猪在采食饲料时对饲料的利用能力。常见的衡量饲料利用效率的指标有饲料转化效率(Feed conversion ratio,FCR)和剩余采食量(Residual feedintake,RFI)两种。其中，剩余采食量表示实际采食量与预测的用于维持生命和生长所需要的采食量之差，因反映个体本身由遗传背景决定的代谢差异而使用范围较广。尽管，饲料利用效率相关性状的重要性早就被重视，但由于早期饲料消耗难以直接测量或者难以整个周期内持续跟踪测量，饲料利用效率相关性状的表型测定一直制约着饲料利用效率性状遗传改良的快速发展。不管是计算FCR还是RFI，活体重和采食量总是必不可少。活体重表型值相对容易获取，但如何精准的获取采食量数据才是获取饲料利用效率相关性状表型值的难点和重点。早期针对该性状的遗传改良主要依靠与饲料利用效率相关性状正相关的日增重、背膘厚、瘦肉率等性状的遗传改良而间接提升，导致饲料利用效率相关性状的选育与改良一直进展缓慢。随着计算机技术和电子测定技术的快速发展，猪自动生长性能测定系统的出现让饲料利用效率相关性状的测定成为可能。目前，在猪的遗传改良过程中，育种目标已由重点提高生长速度、瘦肉率转向为更加平衡的选择，逐渐强调生产效率和肉质的提高，饲料利用效率等相关性状已经成为重点关注的选育性状。

饲料转化效率为采食量和增重两个性状的比值，是一个典型的比值性状。从现场育种的角度来说，具有低饲料摄入量和低日增重的猪也同样可能具有低的饲料转化效率，这显然不符合育种选择目标。剩余采食量表示实际采食量与预测的用于维持生命和生长所需要的采食量之差，反映的是个体本身由遗传背景决定的代谢差异。研究表明，剩余采食量与体重等生长性状的遗传相关性较低，相互独立。因此，在针对剩余采食量性状进行选择时对生长性状几乎没有影响，剩余采食量被认为是改良饲料利用效率性状更准确更有效的方法和指标。

然而，剩余采食量作为种猪遗传改良工作中的重要性状，却少有在杜洛克猪群体中鉴定与剩余采食量相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点而提供一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途，本发明还提供了一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对和试剂盒，本发明还提供了一种筛选低剩余采食量性状的猪品种的方法，本发明还提供了一种猪的遗传改良的方法。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602个核苷酸位点，该位点的碱基是A或C。

优选地，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第123位碱基是A或C。所述SNP分子标记的位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为123位的C123-A123的核苷酸突变。

优选地，所述猪包括杜洛克及其合成系。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述所述的引物对。

本发明提供了一种筛选低剩余采食量性状的猪品种的方法，所述方法包括以下步骤：

检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602个核苷酸位点的基因型，选择第34718602个核苷酸位点的AA型个体作为种猪。

优选地，所所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用上述所述的引物对或上述所述的试剂盒，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的上述所述的SNP标记的基因型。

本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述所述的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602位点为CA、AA基因型的种猪个体，淘汰在第34718602位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而降低后代猪的剩余采食量。

优选地，所所述种猪包括杜洛克及其合成系。

本发明还提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定猪剩余采食量相关性状、筛选低剩余采食量性状的猪品种、猪遗传育种或降低猪剩余采食量，提高猪对饲料利用效率中的用途。

有益效果：

(1)本发明研究并确定影响猪剩余采食量相关的分子标记位于猪的1号染色体上的核苷酸序列上，验证其对剩余采食量性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪降低剩余采食量的遗传改良中，从而减少后代猪对饲料的采食，提高企业经济利润，增加核心竞争力。通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪剩余采食量，选育上述性状的优良种猪，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

(2)本发明提供一种鉴定上述猪1号染色体上与剩余采食量相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对剩余采食量性状进行选育，加快育种进程。

附图说明

图1是加系杜洛克猪在1号染色体上关于剩余采食量性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型猪的剩余采食量的表型差异结果分析图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种加系杜洛克头，为种猪分公司核心群。

本实验共选取该资源群体中1265头杜洛克猪，每个个体在30kg到100kg体重之间时用奥饲本种猪生产性能测定系统进行数据收集。

本实验猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

杜洛克猪产仔数较少，大群平均仅为9～10头，但生长快，饲料转化率高，胴体瘦肉率高，肌内脂肪含量较高，抗逆性强。国内商品猪生产已建立起较为成熟的杂交配套体系。其中杜长大的杂交组合在我国的内销和外销市场中持续保持绝对优势地位，作为终端父本的杜洛克种猪，对商品猪的遗传贡献率占50％。因此，提高杜洛克种公猪的生产性能的研究显得尤为重要。

(2)样本采集

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)猪全基因组50K SNP判型

从上述资源群体中选取的1265头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。)。检测结果OD260/280比值在1.8-2.0之间、OD260/230比值介于1.5-2.3之间则判定合格。检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL LoadingBuffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。每一个样品电泳结果须有一条单一的大于50Kb的明亮条带，无RNA无蛋白污染。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用软件PLINKv1.9对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP。

(4)重测序个体筛选和测序

进一步结合系谱信息和遗传贡献程度，利用R语言从进行SNPs分型的个体中151个加系杜洛克猪进行全基因组重测序。其中110头测序深度20X，41头测序深度10X。在诺禾致源公司的Hiseq2500测序平台进行150bp得双端测序模式的高通量测序，测序结果为FASTQ格式。

(5)重测序数据分析

基于最新版的软件Genome Analysis Toolkit(GATK，version4.1.4.1)联合bwa、vcftools和samtools等软件，构建了加系杜洛克重测序数据分析流程，最终获取所有个体的变异位点信息结果。

(6)基因型填充

缺失基因型填充主要过程为将前期进行重测序的个体组成参考群体，并构建参考群体的参考单倍型库，再利用软件基于参考单倍型库将50K的SNPs芯片数据填充成全基因组测序数据。因为50K的SNPs芯片使用的是Illumina的TOP和BOT等位基因分型策略，所以SNPs芯片和重测序数据有时会存在同一位点的基因型不一致的情况。而高质量imputation特别依赖于研究和参考数据等位基因要求相对于参考序列位于同一条DNA物理链上(Strand)。因此在填充之前，还需要修正SNPs芯片和重测序数据同一位点基因型不一致的情况。具体流程为先将每个SNP的引物序列利用BWA软件比对到参考基因组上，确认每个SNP位于正义链还是反义链上，再根据Illumina的TOP和BOT等位基因分型策略推断出SNPs芯片基因型，最后用PLINK软件将SNP位于反义链上的等位基因互补回去。本研究采用软件EAGLE结合软件Minimac4进行基因型填充，采用交叉验证(6-fold cross validation)的方法评估其填充准确性为97％。

(7)全基因组关联(GWAS)分析

选择来自美国密歇根大学的Xiang Zhou和芝加哥大学的Matthew Stephens共同研发的GEMMA软件进行全基因组关联分析。考虑到亲缘关系以及群体分层效应对关联分析造成的假阳性结果的可能性，需提前利用GEMMA软件构建n×n亲缘关系矩阵，n表示个体数。亲缘关系矩阵由SNPs芯片基因型填充后所有SNPs进行构建。

本研究采用单变量混合线性模型进行变异位点与性状之间的GWAS，其中显著性检验采用Wald检验。单变量混合线性模型如下：

y＝Wα+Xβ+u+ε

y为所有个体的表型构建的n×1向量；W表示协变量(固定效应)的指示矩阵，包括场际效应和性别，α为包括截距在内的协变量对应的相关系数；X为SNPs的基因型构成的n×1向量，β为每个标记对应的效应值；u为随机效应，ε为残差。

针对基于SNPs芯片的全基因组关联分析结果，往往会采用严格的Bonferroni多重校正法来设定显著性阈值，从而减低关联分析结果的假阳性率。而针对基因型填充的全基因组关联分析结果，Bonferroni多重校正法过于严格，基于在基因组上猪和人的独立单倍型框的数量基本相同的假设，而参考人类相关的全基因组关联分析的研究设置的基因组显著性阈值为5×10^-8，我们在研究中使用了相同的全基因组显著性阈值，此外还设定了一个更宽松的染色体显著水平的阈值5×10^-6。

(8)不同基因型与剩余采食量表型的关联性分析

通过GWAS分析，如图1所示，我们发现在1号染色体存在一个显著影响剩余采食量性状的主效QTL，其最显著关联位点g.123C>A位于基因PTPRK内含子区域，因此被重点关注。进一步根据表1分析可知，分子标记的SNP位点g.123C>A与剩余采食量性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的剩余采食量性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而降低该群体剩余采食量，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，CC型比AA和CA型的平均剩余采食量高，说明纯合子CC对平均剩余采食量是最不利的。通过图2进一步得知，纯合子CC与AA和CA基因型显著差异，而CC与AA基因型更是差异极显著，这进一步说明纯合子CC对剩余采食量最不利。剩余采食量是饲料效率性状的重要指标，剩余采食量低意味着猪只除维持生命和生长所需要的采食量外，其他饲料采食需求很少，说明该猪的满足正常的生长和发育外节约了粮食。特别的，如果猪的剩余采食量为负值，表明该猪采食量低于预期的，其对饲料的利用效率更高。因此，CC基因型的猪的饲料效率性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC型的种猪，保留AA和CA型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因A的频率。目前，该群体的优势等位基因频率仅为10.6％，说明具有重大的遗传改良空间。

表1分子标记的SNP位点g.123C>A与剩余采食量的相关性分析

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的14号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。设计的引物的DNA序列如下所示：

P001-F：5’-GGGATGGAGCAGAGAGGTAGGAAC-3’，

P002-R：5’-TCTATACCCAGGCCGAGAGCAAAG-3’；

(2)PCR扩增

10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的SNP位点g.123C>A效应分析

根据表1和图2可知，对于剩余采食量，SNP位点g.123C>A优势等位基因型(TT)的效应比CC型表型平均显著降低每日采食量141g/天。以达100kg的体重日龄为165天计算，每头猪可节约饲料23.27kg。如在年出栏10万头的猪场估算，可节约饲料2327吨，按照每公斤饲料成本3.5元，可节约饲料成本8.1亿元。因此，通过分子标记辅助选择，逐步对群体内基因型为CC的猪进行淘汰，则能显著提高等位基因A的等位基因频率，降低群体的剩余采食量，使猪饲料利用效率性能得到改善，这将给企业节约养殖成本，给企业带来巨大的经济收益，增加其核心竞争力。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第123位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的剩余才说了性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

ctatgccttg gagtcactga gaaccaaagg aattcttgcc gtaaagaaag ctgggcagga 60

gattccaggc aaagagtaca acctgcatga agatatggag actggagaga agaggacaga 120

agmcccacca tagttggaga ggaggctgtg aaaaggagct tggctgtaag tcatcatgag 180

ggttttgtta caaggaaaaa aggggaacca aggtggaaga aagacatgat caggttttca 240

ttttataagg gtctctctta gcccagtgtg aaagatggtt tggaggccat atggattttg 300

gggagaccag ctgggaggac atctgtaatc caagg 335

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gggatggagc agagaggtag gaac 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tctataccca ggccgagagc aaag 24

Claims (10)

1.一种猪1号染色体上与猪剩余采食量相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602个核苷酸位点，该位点的碱基是A或C。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ IDNO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第123位碱基是A或C。

3.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述猪包括杜洛克及其合成系。

4.一种用于检测如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

5.一种用于检测如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的引物对。

6.一种筛选低剩余采食量性状的猪品种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602个核苷酸位点的基因型，选择第34718602个核苷酸位点的AA型个体作为种猪。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用权利要求4所述的引物对或如权利要求5所述的试剂盒，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的如权利要求1-3任一所述的SNP标记的基因型。

8.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的如权利要求1-3任一的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本1号染色体上第34718602位点为CA、AA基因型的种猪个体，淘汰在第34718602位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而降低后代猪的剩余采食量。

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述种猪包括杜洛克及其合成系。

10.如权利要求1-3任一所述的SNP分子标记、如权利要求4所述的引物对或如权利要求5所述的试剂盒在鉴定猪剩余采食量相关性状、筛选低剩余采食量性状的猪品种、猪遗传育种或降低猪剩余采食量，提高猪对饲料利用效率中的用途。

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