CN112941197A - 一种基于snp标记评估母猪泌乳力的方法 - Google Patents

一种基于snp标记评估母猪泌乳力的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112941197A
CN112941197A CN202010093285.3A CN202010093285A CN112941197A CN 112941197 A CN112941197 A CN 112941197A CN 202010093285 A CN202010093285 A CN 202010093285A CN 112941197 A CN112941197 A CN 112941197A
Authority
CN
China
Prior art keywords
snp
sow
lactation
weight
genotype
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010093285.3A
Other languages
English (en)
Inventor
唐中林
陈云
易国强
杨亚岚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Original Assignee
Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS filed Critical Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Publication of CN112941197A publication Critical patent/CN112941197A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，所述方法通过鉴定位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处SNP位点的基因型，来筛选21天断奶仔猪个体重和窝重高的猪个体，其中，所述国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪有更高的21天断奶仔猪个体重和窝重，采用本发明所述的方法，可以增加优良猪种的选育速度，加快猪分子育种的步伐，同时提高了猪群的经济效益与社会价值。

Description

一种基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与母猪泌乳力相关的分子标记及基于分子标记评估母猪泌乳力的方法，尤其涉及基于SNP标记评估断奶仔猪个体重和窝重等泌乳力指标的方法。
背景技术
猪为六畜之首，生猪养殖业在世界尤其是我国国民经济中占重要地位，猪繁殖性状是生产中较为重要的经济性状类别之一。利用现代育种技术针对猪繁殖性状进行有效选育，将对于提高养猪业的整体效益有着十分重要的作用。
猪的繁殖性状包括窝产仔数、初生重、21日龄窝重、断奶仔猪数和产仔间隔等。繁殖性状遗传力均较低，传统选育效果不好，需要利用标记辅助选择提高选种准确性，并加快遗传进展。我国是一个养猪大国，且蕴藏各具特点的优良地方品种，因此，开展持续且高效的遗传改良来保持猪种的优良品质并加以改良十分迫切。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是由单个SNP的置换、颠换、缺失或插入所引起的遗传变异现象。SNP是第三代分子遗传标记，据统计，人类基因组中每1,000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP在分子遗传学、药物遗传学、人类疾病诊断和治疗、法医学和基因组学等理论研究方面也扮演着重要角色，具有很大的发展潜力。
现有技术中，科学家已经对猪繁殖性状相关基因及SNP标记做了很多研究。例如，李凤娥和陈克飞等研究了ESR基因中不同SNP位点和基因型对产仔数的影响；赵要风等对促卵泡素β亚基基因(FSHβ)的SNP与产仔数进行关联分析，证明该基因座位在约克夏、长白和杜洛克等商品猪中与产仔数紧密连锁。但是，目前对于与猪断奶仔猪个体重和窝重相关的基因以及标志性SNP研究报道较少。因此，我们需要对相关性状进行深入研究，在分子水平上探索影响断奶仔猪体重和窝重的遗传机制，这对于全面而深入揭示母猪繁殖性能具有重要的理论意义和实践意义。
发明内容
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，提供了一种基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，所述方法通过鉴定位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处SNP位点的基因型，来筛选21天断奶仔猪个体重和窝重高的猪个体，以增加优良猪种的选育速度，加快猪分子育种的步伐，提高猪群的经济效益和社会价值，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供一种基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
步骤1，获得与母猪泌乳力相关的SNP标记及其基因型；
步骤2，提取待测母猪的基因组DNA；
步骤3，检测待测母猪相关SNP标记的基因型；
步骤4，根据基因型评估待测母猪的泌乳力。
其中，与母猪泌乳力相关的指标为21天断奶仔猪个体重和窝重。
其中，所述与母猪泌乳力相关的SNP标记位于ENSSSCG00000004081基因上。
其中，所述与母猪泌乳力相关的SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处，具有T/C多态性。
其中，所述国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪有更高的21天断奶仔猪个体重和窝重。
其中，所述与母猪泌乳力相关的SNP标记及其基因型按照包括以下步骤的方法筛选得到：
步骤i，提取猪群体的基因组DNA；
步骤ii，进行基因分型；
步骤iii，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
其中，步骤ii包括以下子步骤：
步骤ii-1，对基因组DNA进行PCR扩增；
步骤ii-2，对扩增产物进行SAP消化处理；
步骤ii-3，对消化处理后的产物进行单碱基延伸反应；
步骤ii-4，将延伸产物进行质谱检测。
其中，步骤ii-1中，采用扩增引物对基因组DNA进行扩增，所述引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
其中，步骤ii-3中，采用单碱基延伸引物P3、P4和P5对消化处理后的产物进行单碱基延伸，所述P3、P4和P5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明所提供的基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，操作简单，育种评估精准，可以增加优良猪种的选育速度，加快猪分子育种的步伐；
(2)本发明所提供的基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，从一定程度上为21天断奶仔猪个体重和窝重高的猪育种提供切实可行的方案，提高猪生产企业的经济效益；
(3)本发明所提供的基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，通过鉴定SNP标记的不同等位基因来筛选21天断奶仔猪个体重和窝重高的猪个体，从而提高猪群的经济效益与社会价值。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
本发明人发现，SNP具有丰富的多态性，且易于实现高通量自动化基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：(1)鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的相关技术；(2)完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。(3)化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。
本发明基于SNP芯片技术，利用全基因组关联分析等方法，进行猪性状的表型值与不同基因型间的关联分析从而鉴定影响性状遗传变异位点，能够有效提高猪育种效率，便于培育优良品种。
本发明的第一方面，提供了一种基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，获得与母猪泌乳力相关的SNP标记及其基因型。
在本发明中，所述母猪泌乳力指标优选为21天断奶仔猪个体重和窝重。
根据本发明一种优选的实施方式，所述与母猪泌乳力相关的SNP标记位于ENSSSCG00000004081基因上。
优选地，所述SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处。
其中，所述Chromosome1:16,077,935处指的是1号染色体第16,077,935位碱基。
在本发明中，所述SNP标记在Ensembl上对应的位点号为rs330973858。
根据本发明一种优选的实施方式，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记具有T/C多态性。
其中，所述位点位于SEQ ID NO.1所示核苷酸片段的第251bp处，该位点碱基的差异导致21天断奶仔猪个体重和窝重的不同。
在本发明中，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的对应的三种基因型分别为TT、TC和CC，TT基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基均为T，TC基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基为T和C，CC基因型为该SNP标记位点在两个等位基因中的碱基均为C。
在进一步优选的实施方式中，所述国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪有更高的21天断奶仔猪个体重和窝重。
因此，可以通过选育rs330973858核苷酸位点的TT型个体作为种猪，就能够筛选出21天断奶仔猪个体重和窝重较高的猪，提高猪的繁殖性能。
根据本发明一种优选的实施方式，所述位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记按照包括以下步骤的方法筛选得到：
步骤i，提取猪群体的基因组DNA。
其中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取试验猪群体的基因组DNA，优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。
步骤ii，进行基因分型。
为获得与猪21天断奶仔猪个体重和窝重相关的基因型类型，首先需要获得猪该SNP位点的基因分型信息。
根据本发明一种优选的实施方式，所述SNP位点的基因分型采用Sequenom技术进行。
其中，Sequenom技术利用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，其主要步骤是：首先PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过飞行时间检测器检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。
由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现。
优选地，所述基因分型检测包括以下步骤：
步骤ii-1，对基因组DNA进行PCR扩增。
根据本发明一种优选的实施方式，采用扩增引物对基因组DNA进行扩增，所述引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述PCR扩增的体系包括10×PCR Buffer(15mM MgCl2)、MgCl2(25mM)、dNTP mix10(25mM)、引物混合物(0.5μM)、HotstarTaq(5U/μl)和水(HPLC grade)。
更优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃∞。
步骤ii-2，对扩增产物进行SAP消化处理。
其中，对PCR扩增产物进行碱性磷酸酶(SAP)处理，以除去游离的dNTP和剩余扩增引物。
在本发明中，所述进行碱性磷酸酶处理的体系包括超纯水、10×SAP Buffer和SAP(1.7U/μl)。将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min使SAP酶充分发挥作用，85℃孵育5min使SAP酶失活，4℃维持。
优选地，对扩增得到的PCR产物进行测序分析，判读SNP标记位点的多态性。
步骤ii-3，对消化处理后的产物进行单碱基延伸反应。
其中，进行单碱基延伸反应能够检测单碱基或插入/缺失多态性。
根据本发明一种优选的实施方式，采用单碱基延伸引物P3、P4和P5对消化处理后的产物进行单碱基延伸，所述P3、P4和P5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在本发明中，SNP标记的单碱基引物具有3条，分别为UEP、EXT1和EXT2，其中，UEP为延伸引物，EXT1和EXT2为针对位点不同基因型设计的检测引物。
其中，上述引物对优选采用Sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1，综合考虑引物设计的各项原则设计得到。
优选地，所述基因分型优选采用基因分型试剂盒进行，如基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set 384Kit。
所述单碱基延伸的体系包括超纯水、10×iPLEX Buffer plus、iPLEXterminator、引物混合物(0.6～1.3μM)和iPLEX酶。
所述单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s；4℃∞。
步骤ii-4，将延伸产物进行质谱检测。
其中，将延伸产物稀释后，使用树脂进行脱盐，以降低质谱仪的背景噪声；然后将样品点在样品靶上，自然结晶，采用质谱仪进行质谱检测，收集数据，获得SNP标记的基因型。
步骤iii，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
在进行关联分析之前，先获得猪群体的21天断奶仔猪个体重和窝重表型数据，其中，断奶仔猪窝重为断奶时的全窝仔猪的总重量，寄入的仔猪体重计在内，寄出的仔猪体重不计在内。断奶窝重作为母猪泌乳力的重要指标，14日龄以前和38日龄以后的断奶仔猪窝重不能寄入，以保证21日校正断奶窝重的准确性。
根据实际断奶窝重和称重日龄的校正因子计算得到21日龄校正断奶窝重，其中，21日龄的校正窝重公式如下：
21日龄校正窝重(kg)＝实际窝重(kg)×校正因子。
21天断奶仔猪个体重为断奶时的仔猪个体的重量，其测量日龄为14～38日，校正个体重公式如下：
21日龄校正个体重(kg)＝实际个体重(kg)×校正因子。
根据本发明一种优选的实施方式，利用GEMMA软件一般线性模型进行基因型对表型的影响效应分析。
优选地，所述分析模型为：
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
通过上述分析模型，可以获得与猪21天断奶仔猪个体重和窝重显著相关的SNP标记，以及较高21天断奶仔猪个体重和窝重的基因型。
在本发明中，通过上述方法筛选得到与猪21天断奶仔猪个体重和窝重显著相关的SNP标记，其位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处，具有T/C多态性；且通过上述方法能够得到上述SNP位点对猪21天断奶仔猪个体重和窝重的影响效应，基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪有更高的21天断奶仔猪个体重和窝重。
步骤2，提取待测母猪的基因组DNA。
采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取待测母猪的基因组DNA，优选采集猪耳组织进行基因组DNA的提取。
步骤3，检测待测母猪相关SNP标记的基因型。
在本发明中，可采用直接测序法或试剂盒法进行基因型测定，所述试剂盒包括PCR扩增引物和单碱基延伸引物。
优选地，所述PCR扩增引物包括位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的PCR扩增引物P1和P2；
所述单碱基延伸引物包括位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP标记的单碱基延伸引物为P3、P4和P5。
其中，所述引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述引物P3～P5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
更优选地，所述基因分型试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶、SAP缓冲液和SAP(碱性磷酸酶)。
步骤4，根据基因型评估待测母猪的泌乳力。
其中，若待测母猪的位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TT，则该待测母猪的21天断奶仔猪个体重和窝重较高，即泌乳力较好；若待测母猪的位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TC或CC，则该待测母猪的21天断奶仔猪个体重和窝重较低，即泌乳力较差。
根据本发明一种优选的实施方式，所述引物对P1和P2，可用于检测所述与母猪泌乳力相关的SNP标记。
其中，采用上述引物对对待测母猪个体的基因组DNA进行扩增，能够获得含有上述SNP标记位点的核苷酸片段(如SEQ ID NO.1所示的序列)，进而能够判定相应SNP位点的碱基类型。
优选地，所述引物对还可用于鉴定或辅助鉴定母猪泌乳力，或者辅助猪繁殖育种。
更优选地，通过上述确定母猪的位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型，可以对母猪21天断奶仔猪个体重和窝重性状进行遗传改良，
具体地，种猪的继代选择国际猪基因组10.2版本参考序列4号染色体上第16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的个体，淘汰该SNP位点基因型为TC和CC的个体，以逐代提高该位点的纯合基因型TT的频率，从而提高母猪21天断奶仔猪个体重和窝重，改善母猪泌乳力。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1
1、试验动物
本实施例所采用的试验猪群体为河北衡水种猪场的约克夏纯种母猪，共357头。
2、21天断奶仔猪个体重和窝重的测定与校正
测量断奶日龄在14～38日内的仔猪窝重和个体重，其中，计算窝重时，寄入的仔猪体重计在内，寄出的仔猪体重不计在内。
通过下式计算得到21日龄校正窝重：
21日龄校正窝重(kg)＝实际窝重(kg)×校正因子；
通过下式计算得到21日龄校正个体重：
21日龄校正个体重(kg)＝实际个体重(kg)×校正因子
不同日龄及相应的校正因子如表1所示：
表1
Figure BDA0002384434590000111
Figure BDA0002384434590000121
3、提取猪基因组DNA
采集357头猪的耳组织样4份/头，其中1份用于个体DNA提取；
参考天根生物科技公司组织DNA提取试剂盒说明书，按以下步骤顺序进行DNA提取：
(1)先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入68mL和200mL无水乙醇，充分混匀。
(2)采集组织样约100mg置于2mLEP管内，完全剪碎后加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
(3)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，随后以12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中
(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，以12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。
4、基于Sequenom平台的SNP分型检测
采用基因分型384孔试剂盒Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set384Kit进行分型检测。
(1)以提取的357个约克夏纯种猪的DNA为模板，用PCR扩增引物P1和P2进行扩增，采用的扩增体系如下：
Figure BDA0002384434590000131
Figure BDA0002384434590000141
扩增的反应条件为：
94℃900s；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃180s；4℃维持。
(2)对PCR扩增产物进行SAP消化处理，反应体系如下：
Figure BDA0002384434590000142
将上述体系混匀、离心后加入PCR反应监测板中，置于PCR仪，反应条件为：37℃孵育40min，85℃孵育5min，4℃维持。
(3)向消化处理后的体系中加入单碱基延伸引物，进行延伸反应，反应体系如下：
Figure BDA0002384434590000143
其中，单碱基延伸引物为P3、P4和P5，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
单碱基延伸的反应条件为：94℃30s；94℃5s，(56℃5s，72℃5s，5个循环)，40个循环；72℃180s；4℃∞。
(4)将反应产物(共9μL)稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；采用MassArray质谱仪进行质谱检测，收集数据，判读rs330973858位点的基因型。
其中，清除表型值缺失的个体；清除基因型检出率小于95％的SNP位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(Minimum Allele Frequency，MAF)小于1％的个体。
采用PopGene 3.2计算rs330973858位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002384434590000151
5、采用GEMMA软件的一般线性模型对上述SNP位点的基因型猪21天断奶仔猪个体重和窝重的影响效应进行关联分析，采用的分析模型如下：
y＝Wa+xβ+μ+ε
其中：y代表个体表型值；W代表协变量；a代表对应系数；x代表SNP基因型；β代表对应的SNP效应；μ代表剩余多基因效应；ε代表剩余残差效应。
关联分析的结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002384434590000152
表3给出了rs330973858突变位点在约克夏猪群体中对猪21天断奶仔猪个体重和窝重的影响效应。在rs330973858突变个体中，TT基因型猪的21天断奶仔猪个体重和窝重显著高于TC型和CC型的猪(P<0.1)。
由此可见，在猪群体中，继代选育rs330973858位点的TT基因型个体，可逐步提高猪群体21天断奶仔猪体重和窝重，进而达到提高猪的生产效率的目的，为育种生产带来较高的效益。
本发明基于Sequenom技术进行基因分型和与表型性状的关联分析，发现了定位于猪ENSSSCG00000004081基因上的SNP位点rs330973858对猪21天断奶仔猪体重和窝重有显著影响，TT基因型猪21天断奶仔猪体重和窝重显著高于TC型和CC型。因此，可以通过判断母猪的rs330973858核苷酸位点的基因型来评估其泌乳力，进而可以通过选育rs330973858核苷酸位点的TT型个体作为种猪，筛选出更高21天断奶仔猪体重和窝重的猪。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 一种基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法
<130> 2019
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 401
<212> DNA
<213> 核苷酸片段（Sus scrofa）
<400> 1
aagtccccta caatttaacc tacagggcat tctttatctg aaccttgaag ttttttcctc 60
actatagagc actaacctta gaaactgtca ttatatcatt gaactgtgtt ttcagttcct 120
cttgagcggt ctccttgaat gactcatcct cagtcttctg gtaaagctcc ctggccttgg 180
caacgagccg ctgcagggct ccagcgtgat cttccgcctc cgatactagg gactgaaaat 240
ggtccagaag cgaaaacttc tctttcagac caggctgcag ttgcaaagga tgttctactt 300
tctgatccac ttcttccatc cactgctcca actggttttt ccactctaga tagtcattcc 360
attggctaat cacagatgct aacgtgctgg aattaatgtc a 401
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增引物P1（人工序列）
<400> 2
acgttggatg tcttctggta aagctccctg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 扩增引物P2（人工序列）
<400> 3
acgttggatg ttcagtccct agtatcggag 30
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P3（人工序列）
<400> 4
ccctgggcgg aagatcacgc tg 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P4（人工序列）
<400> 5
ccctgggcgg aagatcacgc tga 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 单碱基延伸引物P5（人工序列）
<400> 6
ccctgggcgg aagatcacgc tgg 23

Claims (9)

1.一种基于SNP标记评估母猪泌乳力的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，获得与母猪泌乳力相关的SNP标记及其基因型；
步骤2，提取待测母猪的基因组DNA；
步骤3，检测待测母猪相关SNP标记的基因型；
步骤4，根据基因型评估待测母猪的泌乳力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，与母猪泌乳力相关的指标为21天断奶仔猪个体重和窝重。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与母猪泌乳力相关的SNP标记位于ENSSSCG00000004081基因上。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与母猪泌乳力相关的SNP标记位于国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处，具有T/C多态性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述国际猪基因组10.2版本参考序列Chromosome1:16,077,935处的SNP位点的基因型为TT的猪，相较于基因型为TC和CC的猪有更高的21天断奶仔猪个体重和窝重。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与母猪泌乳力相关的SNP标记及其基因型按照包括以下步骤的方法筛选得到：
步骤i，提取猪群体的基因组DNA；
步骤ii，进行基因分型；
步骤iii，进行基因型数据和表型数据的关联分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤ii包括以下子步骤：
步骤ii-1，对基因组DNA进行PCR扩增；
步骤ii-2，对扩增产物进行SAP消化处理；
步骤ii-3，对消化处理后的产物进行单碱基延伸反应；
步骤ii-4，将延伸产物进行质谱检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤ii-1中，采用扩增引物对基因组DNA进行扩增，所述引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤ii-3中，采用单碱基延伸引物P3、P4和P5对消化处理后的产物进行单碱基延伸，所述P3、P4和P5的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
CN202010093285.3A 2019-12-10 2020-02-14 一种基于snp标记评估母猪泌乳力的方法 Pending CN112941197A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911260545 2019-12-10
CN2019112605455 2019-12-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112941197A true CN112941197A (zh) 2021-06-11

Family

ID=76234454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010093285.3A Pending CN112941197A (zh) 2019-12-10 2020-02-14 一种基于snp标记评估母猪泌乳力的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112941197A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114568388A (zh) * 2022-03-30 2022-06-03 上杭傲农槐猪产业发展有限公司 槐猪的保种和育种方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070003956A1 (en) * 2003-03-11 2007-01-04 Iowa State University Research Foundation, Inc. Approaches to identifying genetic traits in animals
CN101139594A (zh) * 2007-07-27 2008-03-12 华中农业大学 猪繁殖性状相关基因zar1的克隆及其在标记辅助选择上的应用
CN106011245A (zh) * 2016-06-01 2016-10-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用
CN106521000A (zh) * 2016-12-20 2017-03-22 东北农业大学 与仔猪断奶重和抗腹泻病相关的分子标记及其在猪育种中的应用
CN107287330A (zh) * 2017-07-28 2017-10-24 深圳华大基因研究院 一种预测待测猪的初生窝重遗传性能的snp位点组合及方法
CN110438236A (zh) * 2019-06-05 2019-11-12 中国农业大学 一种与猪乳头内陷相关的snp标记及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070003956A1 (en) * 2003-03-11 2007-01-04 Iowa State University Research Foundation, Inc. Approaches to identifying genetic traits in animals
CN101139594A (zh) * 2007-07-27 2008-03-12 华中农业大学 猪繁殖性状相关基因zar1的克隆及其在标记辅助选择上的应用
CN106011245A (zh) * 2016-06-01 2016-10-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用
CN106521000A (zh) * 2016-12-20 2017-03-22 东北农业大学 与仔猪断奶重和抗腹泻病相关的分子标记及其在猪育种中的应用
CN107287330A (zh) * 2017-07-28 2017-10-24 深圳华大基因研究院 一种预测待测猪的初生窝重遗传性能的snp位点组合及方法
CN110438236A (zh) * 2019-06-05 2019-11-12 中国农业大学 一种与猪乳头内陷相关的snp标记及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NULL: "rs330973858", 《ENSEMBL》 *
ZHANG: "Genome-Wide Association Study for Reproductive Traits in a Duroc Pig Population", 《ANIMALS》 *
刘碧霞等: "大白母猪LIF基因多态性及其对繁殖性状的影响", 《云南农业大学学报(自然科学)》 *
国家鲆鲽类产业技术研发中心编著: "《国家鲆鲽类产业技术体系年度报告 2016版》", 31 December 2017, 青岛：中国海洋大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114568388A (zh) * 2022-03-30 2022-06-03 上杭傲农槐猪产业发展有限公司 槐猪的保种和育种方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110029178B (zh) 与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用
CN112941199B (zh) 一种评估猪背膘厚和眼肌面积的方法及其应用
CN110317880B (zh) 与猪饲料转化率相关的分子标记、鉴定及其应用
CN114657261B (zh) 一种与绵羊胸椎数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用
CN112481392B (zh) 一种与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用
CN108913787B (zh) 与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用
KR102124652B1 (ko) 개의 불안장애 조기 예측 또는 진단용 조성물
CN109182559B (zh) 一种与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用
CN114107516B (zh) 一种用于评估猪背膘厚的snp标记及其检测方法
CN109207611B (zh) 一种与绵羊发情性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用
KR20190034125A (ko) 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 snp 마커 및 이의 용도
KR102235340B1 (ko) 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 snp 마커 세트 및 이의 용도
CN112941197A (zh) 一种基于snp标记评估母猪泌乳力的方法
CN108315435B (zh) 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及应用
CN114250306B (zh) 一种利用GLRX3基因评估猪达100kg体重日龄的方法及应用
CN114250305B (zh) 一种基于glrx3基因检测猪产活仔数和仔猪出生窝重的方法及应用
CN107815499B (zh) 一个与猪100kg体重背膘厚相关的SNP位点及其应用
CN112342298B (zh) 与猪达100kg体重日龄相关的SNP标记、检测方法及应用
CN116377082A (zh) 绵羊lcorl基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用
CN111139306B (zh) 与猪繁殖性状相关的分子标记及其组合应用
CN111139305B (zh) 与猪总产仔数性状相关的分子标记及其组合应用
KR20190034124A (ko) 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 snp 마커 및 이의 용도
CN113355429B (zh) 一种鉴定猪背膘厚和达100kg体重日龄的SNP标记及其应用
CN109439773B (zh) 一种绵羊多羔性状的snp分子标记及其检测用引物组、试剂盒和应用
CN113736890A (zh) 一种与健仔数和活仔率相关的snp分子标记及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210611

RJ01 Rejection of invention patent application after publication