CN112481392B - 一种与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用，属于绵羊SNP分子标记技术领域。所述SNP为第21号染色体上第41895346bp位点(XM_004019650.3，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，2012年12月)，通过对该位点进行分型选择该位点优势等位基因，提高绵羊经产母羊窝平均产羔数。本发明进一步利用Sequenom

技术对该位点进行单核苷酸型检测，判定绵羊BAD基因型，选择具有高产羔数性状的TC杂合个体和CC纯合个体留下来用作配种，实现大规模、自动化检测，对绵羊大规模分子育种具有潜在应用价值。

Description

一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记检测技术，具体涉及一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

绵羊(Ovis aries)是常见的饲养动物，世界各地均有饲养，可以为人类提供肉和毛皮等产品。产羔数性状是绵羊最重要的经济性状之一，因其受微效多基因控制且遗传力低，难以用常规育种方法来快速改良，而分子技术能有效快速地提高其遗传进展，因此，鉴定与产羔数相关的主效基因或分子遗传标记是现代分子育种的关键。

BAD蛋白是B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族成员之一。Bcl-2相关细胞凋亡促进因子(Bcl-2-associated agonist of cell death,BAD)属于Bcl-2家族，是仅含BH3结构域的促凋亡蛋白，能够与Bcl-2、Bcl-xL结合成为异源二聚体。通过竞争结合中和Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W，抑制其功能，从而释放凋亡效应蛋白Bax和Bak，促进凋亡。而发生这一系列生物学过程的场所卵巢则通过凋亡调控不同发育阶段卵泡数目、大小和质量，来准确控制繁殖的时间和质量。

狄冉等通过高通量测序研究显示不同季节的BAD基因表达有显著差异，McNatty等也报道卵巢颗粒细胞在季节性繁殖期间显示出功能变化。曹晓涵等研究发现在小尾寒羊卵泡颗粒细胞中，BAD基因过表达后细胞凋亡显著增加，Mok等研究表明BAD基因的过表达可促进细胞周期进程，以上研究结果提示BAD基因在促进细胞凋亡和调节细胞周期中起重要作用。

王龙涛等研究了在小尾寒羊卵泡期卵巢膜细胞、输卵管和子宫三个组织BAD基因的表达规律，结果表明BAD基因在这三个组织都有不同程度的表达，在输卵管表达量最高，卵巢膜细胞表达量次之，子宫表达量最低，曹晓涵等研究也显示BAD基因在这三个组织中的表达量呈现输卵管>卵巢>子宫体的趋势。

然而，目前关于BAD基因在绵羊繁殖过程中的具体作用并无报道，传统的基因型检测方法大多采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism)和PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformationpolymorphism)检测方法，这些方法通量较低，程序繁多，较难实现高通量自动化测定。因此，探究BAD基因与绵羊产羔数相关的分子标记，开发一种BAD基因型的SNP位点高通量、自动化检测方法成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用，通过对绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1的第21号染色体上第41895346bp位点进行检测、分型，选择该位点优势等位基因，提高绵羊经产母羊窝平均产羔数。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1的第21号染色体上第41895346bp位点，该位点存在T/C碱基突变。

本发明的目的还在于提供了上述SNP分子标记的引物组合，包括扩增引物对和延伸引物。所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述延伸引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明的目的还在于提供了上述引物组合在绵羊多羔育种中的应用。

本发明的目的还在于提供了一种用于检测绵羊多羔性能的试剂盒，包括上述引物组合。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液和SAP酶。

优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明的目的还在于提供了上述试剂盒在绵羊多羔育种中的应用。

本发明的目的还在于提供了一种绵羊多羔育种方法，所述方法包括：检测权利要求1所述SNP分子标记位点的基因型，选择第41895346bp位点的TC和/或CC型个体作为种羊。

优选的，所述基因型采用Sequenom

SNP技术进行检测。

优选的，所述基因型的检测包括以下步骤：

(1)提取待测羊的基因组DNA；

(2)采用上述扩增引物对，将所述待测羊的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行消化；

(4)以消化后的PCR扩增产物为模板，利用上述延伸引物进行延伸反应；

(5)分析延伸产物，判定上述SNP分子标记位点的基因型。

与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：

本发明研究并确定与绵羊多羔相关的SNP分子标记，验证其对绵羊经产母羊窝平均产羔数的影响，表明该SNP分子标记与绵羊的多羔性状显著相关，最终建立高效准确的基因组选择育种技术，将其用于绵羊多羔育种的遗传改良中，从而提高绵羊的繁殖力，增加养殖企业市场竞争力。

本发明的引物组和试剂盒具有使用方便、成本低廉等优点。

本发明提供的利用Sequenom

SNP技术检测绵羊BAD基因型的方法，技术更灵敏，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。利用本方法可对BAD基因的SNP位点实现自动化检测，可以将具有高产羔数性状的TC杂合个体和CC纯合个体选留下来，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为采用Sequenom

SNP技术对BAD基因的三种基因型(TT、TC和CC)的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，该分子标记位点位于绵羊第21号染色体上第41895346bp位点(XM_004019650.3，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，2012年12月)，该位点的碱基存在T/C突变。本发明发现该位点突变后与绵羊多羔具有显著的相关性。

本发明通过对该位点进行分子标记，判定绵羊的BAD基因型，并通过选择该位点的优势等位基因，逐代增加优势等位基因频率，从而提高绵羊经产母羊窝平均产羔数。本发明所述绵羊第21号染色体上第41895346bp位点为绵羊BAD基因型位点。

本发明还提供了一组用于检测绵羊上述SNP分子标记的引物组合：包括PCR扩增引物和延伸引物，PCR扩增引物包括上游引物F和下游引物R。上游引物F的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，延伸引物S的核苷酸序列如SEQID NO：3所示：

F：5’-ACGTTGGATGTAACGGCACACAGATCTCAC-3’；

R：5’-ACGTTGGATGTGACAGTTTCCGTTACCCAG-3’；

S：5’-CAGACCGATAACGAGGCCCC-3’。

本发明还提供了检测上述SNP分子标记的试剂盒，包括上述引物组合。优选的，本发明所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液和SAP酶。更优选的，本发明所述试剂盒还包括标准阳性模板。在本发明中，所述标准阳性模板DNA的基因型为TT，所述标准阳性模板DNA作为阳性对照，增加所述SNP位点检测的准确性。本发明所述试剂盒可以准确用于检测绵羊第21号染色体上第41895346bp位点的核苷酸，判定BAD基因型，用于绵羊多羔育种。

本发明还提供了一种绵羊多羔育种方法。本发明对绵羊第21号染色体上第41895346bp位点的核苷酸进行单核苷酸型检测，并根据检测结果判定绵羊BAD基因为TT、TC或CC，选择基因型为TC和/或CC型的个体作为种羊。优选的，本发明利用Sequenom

SNP技术实现单核苷酸型检测。

本发明提取待测绵羊基因组DNA。作为一种可选的实施方式，本发明通过采集绵羊颈静脉血提取基因组DNA。本发明对绵羊基因组DNA的具体提取方法不作限定。

本发明采用上述扩增引物对，对待测羊的基因组DNA进行PCR扩增。作为一种可选的实施方式，所述PCR扩增反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂0.4μL，25μmol/LdNTPs 0.1μL，PCRPrimermix 1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。

本发明对PCR扩增产物进行消化。作为一种可选的实施方式，本发明使用SAP酶进行消化，所述消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL；所述消化反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。

本发明以消化后的PCR扩增产物为模板，采用上述延伸引物进行延伸反应。作为一种可选的实施方式，所述延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL，Terminator mix0.2μL，Extend primer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；所述延伸反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s 5个循环，40个循环；72℃3min。

本发明对延伸产物进行分析，确定各突变位点的具体基因型。作为一种可选的实施方式，本发明使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，根据检测结果判定绵羊BAD基因为TT、TC或CC。

Sequenom

SNP技术的基本原理为：首先使用引物扩增目标SNPs所在片段，在扩增产物中加入SAP酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后对待检位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在本实施例中，所有试剂和仪器均购自北京君诺德生物技术有限公司(BeijingGenenode Biotech Co.,Ltd)，其中试剂和仪器的具体选择如表1所示：

表1实验试剂及仪器

1、实验动物

本发明所使用的实验羊为来自山东省郓城县的健康小尾寒羊，共选取379只。

2、待测绵羊基因组DNA的提取

收集上述绵羊群体所有个体颈静脉血1ml，用EDTA抗凝处理。采用红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，再采用细胞核裂解液裂解细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

3、Sequenom

SNP技术进行基因分型

(1)针对绵羊第21号染色体上第41895346bp位点(XM_004019650.3，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，2012年12月)设计引物组合，所述引物由君诺德公司合成。

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-ACGTTGGATGTAACGGCACACAGATCTCAC-3’

下游引物R：5’-ACGTTGGATGTGACAGTTTCCGTTACCCAG-3’

延伸引物序列及延伸产物如表2所示。

表2延伸引物序列及延伸产物

(2)检测流程如下：

以待测绵羊基因组DNA为模板，利上述引物F和R进行PCR扩增反应，PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/LMgCl₂0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCRPrimer mix 1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。

用SAP酶对PCR扩增产物进行消化，主要是用SAP酶去除反应产物中的剩余引物和dNTP。使用的SAP酶消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL；消化反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。

以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物S进行延伸反应，延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL，Terminatormix 0.2μL，Extend primermix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；延伸反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s 5个循环，40个循环；72℃3min。

分析延伸产物，从而对绵羊BAD基因型进行判定。将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

经质谱分析得到PCR扩增产物大小为136bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。

统计结果：待测绵羊第21号染色体上第41895346bp位点不同基因型分析统计结果见表3。

表3不同基因型分析统计

由表3可知，对379只绵羊血液DNA样品采用Sequenom

SNP技术分型发现，绵羊第21号染色体上第41895346bp位点在小尾寒羊中存在三种基因型，分别为野生纯合型TT、杂合型CT、突变纯合型CC，基因型为TT的频率为0.966，基因型为TC的频率为0.016，基因型为CC的频率为0.018。

待测绵羊第21号染色体上第41895346bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析统计结果见表4。

表4不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析

注：上标不同的小写字母代表差异显著。

由表4可知，小尾寒羊第一胎产羔数的统计数据显示，绵羊第21号染色体上第41895346bp位点与小尾寒羊第1、2、3胎的产羔数均密切关联，该位点TC型母羊的产羔数显著高于TT型母羊产羔数(P≤0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg taacggcaca cagatctcac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg tgacagtttc cgttacccag 30

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagaccgata acgaggcccc 20

Claims (5)

1.一种检测SNP分子标记的引物组或试剂盒在绵羊多羔育种中的应用，其特征在于，所述引物组包括序列为SEQ ID NO：1的上游引物，序列为SEQ ID NO：2的下游引物，序列为SEQID NO：3的延伸引物；

所述试剂盒包括所述的引物组；

所述SNP分子标记位于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1的第21号染色体上第41895346bp位点，该位点存在T/C碱基突变；

检测所述SNP分子标记位点的基因型，选择第41895346bp位点的TC和/或CC型个体作为种羊。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液和SAP酶。

3.根据权利要求1~2任意一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因型采用Sequenom MassARRAY®SNP技术进行检测。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因型的检测包括以下步骤：

(1)提取待测羊的基因组DNA；

(2)采用权利要求1所述引物对，将所述待测羊的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行消化；

(4)以消化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述延伸引物进行延伸反应；

(5)分析延伸产物，判定权利要求1所述SNP分子标记位点的基因型。

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