CN110004236B - 与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测esr1基因分型引物组、试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状相关的SNP分子标记及其检测绵羊ESR1基因型引物组、试剂盒和应用，属于绵羊SNP分子标记技术领域。基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位为绵羊第8号染色体上第75378892bp位点上的A/T碱基突变，与绵羊多羔性状具有显著的相关性。通过对绵羊ESR1基因型进行分型即可确定待测绵羊产羔性能。本发明提供的利用检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，灵敏度、准确性、性价比更高，可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可将AA型个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力。

Description

与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测ESR1基因分型 引物组、试剂盒和应用

技术领域

本发明属于分子标记与遗传育种技术领域，具体涉及与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测ESR1基因分型引物组、试剂盒和应用。

背景技术

绵羊产羔数是一个复杂的数量性状，受遗传、环境和激素水平等因素的调控。绵羊是我国优良的畜种之一。但其产单羔和季节性发情极大的制约了绵羊产业的发展。因此，提高每胎的产羔数是提升生产经济效益的重要措施。应用基因组学方法的研究能在整个基因组的水平去筛选出与绵羊繁殖性状相关的候选基因和分子标记，使学者们能够更深入的理解绵羊多羔性状的遗传机理，可对我国绵羊业的可持续发展将带来巨大的经济效益。

雌激素受体α(ERα)也称为NR3A1，是雌激素受体的两种主要类型之一。绵羊ERα由基因ESR1(雌激素受体1)编码，具有调控转录蛋白质的功能，通过与靶基因上的特异性效应元件相结合，从而调节靶基因的表达(PATERNI I,GRANCHI C,KATZENELLENBOGEN J A,MINUTOLO F.Estrogen receptors alpha(ERα)and beta(ERβ):subtype-selectiveligands and clinicalpotential[J].Steroids,2014,90:13-29.)[2]。ESRα与雌激素结合后，对胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生长发育都发挥着重要作用(

R J,MIRANDA L A.Effects of estradiol andethinylestradiol on sperm quality,fertilization,and embryo–larval survival ofpejerrey fish(Odontesthes bonariensis)[J].Aquatic Toxicology,2015,167:191-199.)。毕晓丹等(毕晓丹等.小尾寒羊高繁殖力候选基因ESR的研究[J].遗传学报,2005,32(10):1060-1065.)对ESR基因Exon1研究结果表明，小尾寒羊ESR基因突变型(AB和BB)比野生型(AA)分别多产羔0.51只和0.70只(P<0.05)，推测ESR基因可能是控制小尾寒羊繁殖性能的一个主效基因。狄冉等(狄冉,贾立华,储明星,等.绵羊雌激素受体基因外显子4多态性分析[J].中国畜牧兽医,2008,35(12):89-92.)对六个绵羊品种的ESR基因Exon4进行PCR-SSCP检测，发现该部分序列比较保守，推测该区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。董文艳等(董文艳.湖羊ESR基因的检测及基因型与多胎性能的关系[D].杭州:浙江大学,2009)对湖羊ESR基因进行检测，结果发现ESR基因第一外显子363位发生C→G突变。产羔数统计发现突变杂合子和突变纯合子湖羊产羔数比野生型湖羊分别多0.98、1.47只(P<0.01)。因此，挖掘出更多与绵羊产羔数相关的分子标记对绵羊育种提供有效工具。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与绵羊单胎多羔性状相关的SNP分子标记及其检测绵羊ESR1基因型引物组、试剂盒和应用，所述SNP分子标记与绵羊多羔性状显著相关。

本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，在绵羊第8号染色体上第75378892bp位点上存在A/T碱基突变。

优选的，所述SNP分子标记为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列自5’端起第43位存在A/T碱基突变。

本发明提供了基于Sequenom

SNP技术检测绵羊ESR1基因型的引物组，所述引物组包括PCR扩增引物和延伸引物；所述PCR扩增引物包括如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物F和如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的下游引物R；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供了一种基于Sequenom

SNP技术检测绵羊ESR1基因型的试剂盒，包括所述的引物组。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。

本发明提供了所述SNP分子标记在培育单胎多羔绵羊品种的应用。

本发明提供了所述的引物组或所述试剂盒在检测绵羊ESR1基因型中的应用。

优选的，所述检测与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，用所述引物组中的PCR扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物；

3)用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；

4)以所述消化产物为模板，使用所述引物组中延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定绵羊ESR1基因型。

优选的，所述PCR反应的反应体系为5μL，包括10ng/μL基因组DNA1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/LMgCl₂0.4μL，25μmol/L dNTPs0.1μL，0.5μmol/L正向引物F和反向引物R共1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水1.8μL；

所述PCR反应的反应程序为：预变性94℃2min；94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持5min。

优选的，所述延伸反应的反应体系为2μL，包括10×iplex Buffer Plus0.2μL，iplex Terminator 0.2μL，0.6～1.3μmol/Lprimermix 0.94μL，iplex Enzyme0.041μL，去离子水0.619μL；

所述延伸反应的反应程序为：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。

本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，位于绵羊第8号染色体上第75378892bp位点上存在A/T碱基突变，其中A为突变前碱基，T为突变后碱基。本发明提供的SNP分子标记与绵羊多羔具有显著的相关性，当所述位点为A碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状；当所述位点为T碱基时，绵羊无单胎产多羔性状。实验证明，由小尾寒羊三胎产羔数的统计数据表明，绵羊第8号染色体上第75378892bp位点的野生纯合AA型和杂合AT型产羔数均显著高于突变纯合TT型(P<0.05)，这说明该位点的突变在一定程度上减少了小尾寒羊产羔能力。因此，后续通过对所述SNP位点进行基因分型选择AA基因型即可筛选出携带多羔性状的绵羊品种，为绵羊单胎多羔品种的选育提供可靠的工具。

本发明提供的所述的引物组或所述试剂盒在检测与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记中的应用。基于Sequenom

SNP技术检测绵羊所述SNP位点分子标记的基因型，具有灵敏度高、准确性号、性价比高的特点，可同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测，操作更加便捷，检测结果真实可靠。

本发明中所述应用可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可将AA纯合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中延伸产物的质谱检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，在绵羊第8号染色体上第75378892bp位点上存在A/T碱基突变。所述SNP分子标记位于ESR1基因中。携带所述SNP分子标记的绵羊个体存在AA、AT和TT三种基因型，其中突变纯合TT基因型的个体产羔数显著低于杂合AT和野生纯合AA基因型。为了很好说明所述SNP分子标记的检测方法，以核苷酸序列为SEQ ID No.1的SNP分子标记(acgttggatgccccttttcttgctttgctgtcaacaggtcagattggcaagttgggtgaccaactgt cctggtttccagcaaggtgagactcatccaacgt)为例加以说明，其中所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列自5’端起第43位碱基存在A/G突变。所述绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1的提交时间为2012年08月。

本发明提供了基于Sequenom

SNP技术检测所述SNP分子标记的引物组，所述引物组包括PCR扩增引物和延伸引物；所述PCR扩增引物包括如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物F(5’-acgttggatgccccttttcttgctttgctg-3’)和如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的下游引物R(5’-acgttggatgagtctcaccttgctggaaac-3’)；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(5’-cacccaacttgccaa-3’)。本发明对所述引物组的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物组的来源即可。在本发明实施例中，所述引物组中3条引物委托北京康普森生物技术有限公司合成。

本发明提供了一种基于Sequenom

SNP技术检测绵羊ESR1基因型的试剂盒，包括所述的引物组。所述引物组中3条引物优选单独分装。所述引物组中3条引物的浓度优选为工作浓度的100倍。所述引物组中上游引物F或下游引物R的工作浓度优选为0.45～0.55μmol/L，更优选为0.50μmol/L；所述引物组中的延伸引物的浓度优选为0.6～1.3μmol/L，更优选为0.8～1.0μmol/L。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。其中，所述SNP分子标记标准阳性模板包括突变纯合GG基因型的DNA片段，作为阳性对照，增加所述SNP位点检测的准确性。所述dNTPs的工作浓度优选为20～30μmol/L，更优选为25μmol/L。所述Taq DNA聚合酶的工作浓度优选为4～6U/μL，更优选为5U/μL。所述MgCl₂溶液的工作浓度优选为20～30mmol/L，更优选为25mmol/L。所述PCR反应缓冲液优选为10×PCR反应缓冲液；所述SAP酶的酶活优选为1.7U/μL。所述试剂盒优选的还包括10×SAP Buffer。本发明对上述试剂的来源没有特殊限制，采用本领域常见的商品购买渠道购买即可。

本发明提供了所述SNP分子标记在培育单胎多羔绵羊品种的应用。在绵羊育种过程中，筛选所述SNP位点为A碱基的绵羊进行后续育种，优选的筛选SNP位点为AA基因型的绵羊进行后续育种。在本发明中，所述SNP位点的筛选优选采用Sequenom

SNP技术进行。所述应用可以将基因型AA纯合选择保留，提高绵羊产羔性能，同时提高绵羊的发情配种率，对绵羊大规模分子育种具有非常大的应用价值。

本发明提供了所述的引物组或所述试剂盒在检测绵羊ESR1基因型中的应用。

在本发明中，所述检测绵羊ESR1基因型的方法，优选包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，用所述引物组中的PCR扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物；

3)用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；

4)以所述消化产物为模板，使用所述引物组中延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；

5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析所述延伸产物，确定绵羊ESR1基因型。

本发明对待测绵羊的种类没有特殊限制，本发明适用于各种绵羊品种。在本发明实施例中，所述待测绵羊为小尾寒羊。本发明提取待测绵羊的基因组DNA。本发明对所述提取基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因组DNA提取方法即可。在本发明实施例中，采用血液基因组DNA提取系统(目录号：DP349)进行提取。

得到基因组DNA后，本发明以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，用所述引物组中的PCR扩增引物进行PCR反应，获得PCR产物。

在本发明中，所述PCR反应的反应体系优选为5μL，包括10ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/LMgCl₂0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，0.5μmol/L正向引物F和反向引物R共1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，去离子水1.8μL。所述PCR反应的反应程序为：预变性94℃2min；94℃20s，退火56℃30s，延伸72℃60s，45个循环；72℃保持5min。所述PCR反应所用PCR仪的型号没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR仪即可。

得到PCR产物后，本发明用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物。

在本发明中，所述用SAP酶消化所述PCR产物时，消化体系优选为2μL，包括10×SAPBuffer 0.17μL，1.7U/μL SAP酶0.3μL，去离子水1.53μL。在所述消化的反应程序：37℃，40min；85℃，5min。所述消化产物优选的保存于4℃。所述消化的作用为消化掉PCR扩增反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs。

得到消化产物后，本发明以所述消化产物为模板，使用所述引物组中延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物。

在本发明中，所述延伸反应的反应体系优选为2μL，包括10×iplex Buffer Plus0.2μL，iplex Terminator 0.2μL，0.6～1.3μmol/Lprimer mix 0.94μL，iplex Enzyme0.041μL，去离子水0.619μL。所述10×iplex Buffer Plus、iplex Terminator、0.6-1.3μmol/Lprimer mix和iplex酶来源于

Gold Reagent Set试剂盒。所述延伸反应的反应程序为：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。在延伸反应过程中，对延伸体系中的待检SNP位点进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的dNTPs，形成分子量差异。本发明在获得所述延伸产物后，优选的将所述延伸产物经过树脂纯化，本发明对所述树脂纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的树脂纯化即可。

得到延伸产物后，本发明利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析所述延伸产物，确定绵羊ESR1基因型。

在本发明中，所述Sequenom

SNP技术的基本原理为：首先使用上游扩增引物F和下游扩增引物R扩增目标SNPs所在DNA片段，在扩增产物中加入SAP酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后利用延伸引物对待检SNP位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸产物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。

在本发明中，所述利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析的过程委托北京康普森生物技术有限公司处理。将所述延伸产物点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。本发明中，所述质谱点样有关的使用MassARRAY NanodispenserRS1000进行；所述质谱分析优选的使用MassARRAYCompact System进行；本发明在所述质谱分析后，优选的利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

下面结合实施例对本发明提供的与绵羊单胎多羔性状相关的SNP分子标记及其检测绵羊ESR1基因型引物组、试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种利用Sequenom

SNP技术检测绵羊绵羊ESR1基因型并预测经产母羊每胎平均产羔数的方法

1、实验材料

选取380只小尾寒羊绵羊为检测对象。

2、试剂及仪器

试剂：Complete Genotyping ReagentKit for

Compact 384；

基因扩增：ABI

9700384Dual；

质谱点样：MassARRAYNanodispenserRS1000；

质谱分析：MassARRAYCompact System；

所有试剂和仪器均购自北京康普森生物技术有限公司(Beijing CompassBiotechnology Co,Ltd)。

3、基因组DNA的提取

采取绵羊颈静脉血液1ml，用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

4、利用Sequenom

SNP技术进行基因分型

针对绵羊第8号染色体上第75378892bp位点NC_019463.2(29295574..29461660)，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1(2012年08月)设计引物组合。

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

2nd-PCRP：acgttggatgaaaataccacagaccgtggg(SEQ ID No.2)；

1st-PCRP：acgttggatgccccttttcttgctttgctg(SEQ ID No.3)；

延伸引物序列及延伸产物如表1所示。

表1延伸引物序列及延伸产物

上述引物由北京康普森生物技术有限公司合成。

检测流程如下：

1、提取待测绵羊的基因组DNA；

2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述引物2nd-PCRP和1st-PCRP进行PCR扩增反应；

3、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；

4、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物S1进行延伸反应；

5、分析延伸产物，从而判定绵羊ESR1基因型。

其中，PCR扩增反应使用的反应体系为(5μL)：10ng/μL基因组DNA1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/LMgCl₂0.4μL，25μmol/L dNTPs0.1μL，0.5μmol/LPCRPrimermix 1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，去离子水1.8μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：94℃2min；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min；4℃保存。

对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系为(2μL)：10×SAP Buffer 0.17μL，1.7U/μL SAP Enzyme 0.3μL，去离子水1.53μL；

反应条件为：37℃40min，85℃5min，4℃保存。

延伸反应体系为(2μL)：10×iplex Buffer Plus 0.2μL，iplex Terminator0.2μL，0.6-1.3μmol/L primer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水0.619μL；

反应条件为：94℃30s；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环]；72℃3min；4℃保存。

将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

经质谱分析得到PCR扩增产物大小为101bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。

统计结果：

待测绵羊第8号染色体上第75378892bp位点不同基因型分析统计结果见表2。

表2待测绵羊第8号染色体上第75378892bp位点不同基因型分析统计

对380只小尾寒羊血液DNA样品采用Sequenom

SNP技术分型发现，绵羊第8号染色体上第75378892bp位点在小尾寒羊中存在三种基因型，分别为野生纯合型AA、杂合型AG、突变纯合型GG。三种基因型频率为0.67(AA)、0.30(AG)和0.03(GG)。

待测绵羊第8号染色体上第75378892bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析统计结果见表3。

表3待测绵羊第8号染色体上第75378892bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析

注：同一列肩标不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。

由此可见，本发明提供的位于绵羊第8号染色体上第75378892bp位点(NC_019465.2(75378967..75379053))的SNP位点，通过对所述SNP位点进行分型即可确定待测绵羊产羔性能；在绵羊育种过程中，可将AA纯合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

由以上实施例可知，本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用，并具体提供了一种利用Sequenom

SNP技术检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，该方法具有灵敏度，准确性更高的优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测ESR1基因分型引物组、试剂盒和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg ccccttttct tgctttgctg tcaacaggtc agattggcaa gttgggtgac 60

caactgtcct ggtttccagc aaggtgagac tcatccaacg t 101

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg ccccttttct tgctttgctg 30

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg agtctcacct tgctggaaa 29

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacccaactt gccaa 15

Claims (3)

1.一种检测SNP分子标记的试剂在培育单胎多羔绵羊品种的应用；所述SNP分子标记为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列,第59位存在A/G碱基突变。

2.一种引物组或试剂盒在培育单胎多羔绵羊品种的应用；

所述引物组包括PCR扩增引物和延伸引物；所述PCR扩增引物包括如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物F和如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的下游引物R；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述试剂盒包括所述引物组。

3.根据权利要求2所述应用，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。

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