CN114672574B - 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents
与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114672574B CN114672574B CN202210384423.2A CN202210384423A CN114672574B CN 114672574 B CN114672574 B CN 114672574B CN 202210384423 A CN202210384423 A CN 202210384423A CN 114672574 B CN114672574 B CN 114672574B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sheep
- primer
- reaction
- embryo
- lambing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 108
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 15
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 108010000178 IGF-I-IGFBP-3 complex Proteins 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 13
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 101001139019 Homo sapiens Kin of IRRE-like protein 1 Proteins 0.000 abstract description 13
- 102100020687 Kin of IRRE-like protein 1 Human genes 0.000 abstract description 12
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 10
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用，属于分子标记与遗传育种技术领域。本发明所述与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第1号染色体上106992693bp位点处。本发明所述分子标记与绵羊单胎高产羔数性状显著相关，利用本发明所述分子标记对初生绵羊KIRREL1基因型进行快速分型即可确定待测绵羊产羔性能，便于种羊选留。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记与遗传育种技术领域，具体涉及与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用。
背景技术
据2021年国家统计局数据，2020年底我国活羊存栏量3亿多只，其中绵羊1.73亿只，在我国肉羊生产中占据了大半江山。随着人们生活水平的提高以及对美好生活的向往，羊肉的消费和需求量显著增加，提升肉羊生产水平是现阶段亟待解决的关键问题。绵羊产单羔极大的制约了肉羊产业的发展，而提高绵羊母羊的每胎产羔数是快速提升肉羊整体产肉量、提高生产经济效益的重要措施，也是培育具有单胎多羔性状新品种的重要方法。因此，应用基因组学方法能在整个基因组的水平去筛选出与绵羊产羔数性状相关的候选基因和分子标记，在肉羊群体中广泛推广应用，可对我国绵羊业的健康高质量发展带来巨大的经济效益。挖掘出其与绵羊产羔数相关的分子标记可为高繁殖力绵羊育种和羊肉产量提升提供有效工具。
发明内容
本发明的目的在于提供与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用。本发明所述分子标记与绵羊单胎高产羔数性状显著相关，通过对初生绵羊KIRREL1基因型进行快速分型即可确定待测绵羊产羔性能，便于种羊选留。
本发明提供了一种与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第1号染色体上106992693bp位点处。
优选的是，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记在SEQID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第101位存在C/T碱基突变。
本发明还提供了基于上述技术方案所述的分子标记的利用Sequenom技术检测绵羊单胎产羔数的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的延伸引物。
本发明还提供了一种利用Sequenom技术检测绵羊单胎产羔数的试剂盒，所述试剂盒包括检测上述技术方案所述分子标记的试剂或上述技术方案所述的引物组。
优选的是，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。
本发明还提供了基于上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒的检测绵羊单胎产羔数的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的正向引物和反向引物进行PCR反应，获得PCR产物，用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；
3)以所述消化产物为模板，使用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；
4)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定绵羊KIRREL1基因型。
优选的是，所述PCR反应的反应体系，每5μL包括：浓度为10ng/μL基因组DNA样品1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl2溶液0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL和去离子水1.8μL；
所述PCR反应的反应程序为：95℃2min；95℃20s，58℃30s，72℃60s，40个循环；72℃5min。
优选的是，所述延伸反应的反应体系，每2μL包括：10×iplex Buffer Plus 0.2μL，iplex Terminator 0.2μL，0.6～1.3μmol/L延伸引物0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水0.619μL；
所述延伸反应的反应程序为：95℃30s；95℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。
本发明还提供了检测上述技术方案所述SNP分子标记的试剂在单胎多羔绵羊新品种培育或绵羊群体繁殖力提升中应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在检测绵羊KIRREL1基因型中的应用。
本发明提供了与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记。本发明所述分子标记基于绵羊基因组序列信息(Oar_v3.1)，该SNP分子标记在绵羊第12号染色体上第106992693bp位点上存在C/T碱基突变，与绵羊单胎高产羔数性状显著相关。本发明通过对初生绵羊KIRREL1基因型进行快速分型即可确定待测绵羊产羔性能，便于种羊选留。本发明提供的检测所述绵羊SNP位点基因型的方法，灵敏度、准确性、稳定性好、性价比更高，可对所述SNP位点实现自动化检测。在绵羊生产过程中，可对TT和CT型个体进行选留，从而提高绵羊群体的繁殖力。
附图说明
图1为本发明提供的通过扩增和延伸后，产物的飞行质谱检测图。
具体实施方式
本发明提供了一种与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第1号染色体上106992693bp位点处。KIRREL是类IRRE蛋白1系属(Kin of IRRE-like protein 1，亦被称为NEPH1)，所述SNP分子标记位于KIRREL1基因内，存在C/T碱基突变。
在本发明中，所述分子标记的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：AGAGATGACTCCAGGGCTGGGCTTTCAGTCATCAGGGCACTGTTGGCCACATCCTGCACTGACTCTGCTCTGCTCTTCCCCACAGTCCCCCCAGAGGACAYCAGGATTGATGGCGGTCCTGTGATCCTGCTGCAGGCGGGCACCCCCCACAACCTCACATGCCGCGCCTT，Y＝C/T，所述分子标记在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第101位存在C/T碱基突变。
本发明还提供了基于上述技术方案所述的分子标记的利用Sequenom技术检测绵羊单胎产羔数的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物(F)：ACGTTGGATGCTGACTCTGCTCTGCTCTTC、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物(R)：ACGTTGGATGTGCAGCAGGATCACAGGAC和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的延伸引物(E)：TCCCCACAGTCCCCCCAGAGGACA。本发明所述引物组通过检测KIRREL1基因型实现绵羊单胎产羔数的判断。
本发明还提供了一种利用Sequenom技术检测绵羊单胎产羔数的试剂盒，所述试剂盒包括检测上述技术方案所述分子标记的试剂或上述技术方案所述的引物组。
在本发明中，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。本发明对所述阳性模板的制备方法没有特殊限定，采用已知基因型的DNA样品作为阳性模板即可。
本发明还提供了基于上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒的检测绵羊单胎产羔数的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的正向引物和反向引物进行PCR反应，获得PCR产物，用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；
3)以所述消化产物为模板，使用上述技术方案所述引物组或上述技术方案所述试剂盒中的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；
4)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定绵羊KIRREL1基因型。
本发明所述基因组DNA优选提取自绵羊血液。
在本发明中，所述PCR反应的反应体系，优选每5μL包括：浓度为10ng/μL基因组DNA样品1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl2溶液0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL和去离子水1.8μL；
所述PCR反应的反应程序优选为：95℃2min；95℃20s，58℃30s，72℃60s，40个循环；72℃5min。
在本发明中，所述延伸反应的反应体系，优选每2μL包括：10×iplex Buffer Plus0.2μL，iplex Terminator 0.2μL，0.6～1.3μmol/L延伸引物0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水0.619μL；
所述延伸反应的反应程序优选为：95℃30s；95℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环；72℃3min。
本发明还提供了检测上述技术方案所述SNP分子标记的试剂在单胎多羔绵羊新品种培育或绵羊群体繁殖力提升中应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组或上述技术方案所述的试剂盒在检测绵羊KIRREL1基因型中的应用。
基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记，位于绵羊第1号染色体上第106992693bp位点上存在C/T碱基突变，其中C为突变前碱基，T为突变后碱基。当所述位点为T碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状；当所述位点为C碱基时，绵羊无单胎产多羔性状。由小尾寒羊三胎产羔数(第一胎CC和CT产羔数除外)的统计数据表明，所述位点的突变纯合型TT和杂合型CT产羔数极显著高于野生纯合CC型(P<0.01)，这说明该位点的突变增加了小尾寒羊的产羔能力。因此，后续通过对所述SNP位点进行基因分型选择TT和CT基因型个体即可筛选出携带多羔性状的绵羊，为绵羊单胎多羔品种的选育以及提高群体的繁殖性能提供可靠的工具。
本发明所述的引物组或所述试剂盒能够检测与绵羊单胎多羔性状显著相关的SNP分子标记。基于Sequenom技术检测绵羊所述SNP位点分子标记的基因型，具有灵敏度高、准确性号、性价比高的特点，可同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测，操作更加便捷，检测结果真实可靠。
本发明中所述应用可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种和实践生产过程中，可将TT纯合个体和CT杂合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。
下面结合具体实施例对本发明所述的与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一种利用Sequenom技术检测绵羊KIRREL1基因型并预测母羊每胎平均产羔数的方法
1、实验材料
以380只有产羔记录的小尾寒羊绵羊为检测对象。
2、试剂及仪器
试剂：10×PCR反应缓冲液，25mmol/L MgCl2溶液，25μmol/L dNTPs，5U/μL TaqDNA聚合酶，扩增引物F和R，10×iplex Buffer Plus，iplex Terminator，1μmol/Lprimermix，iplex Enzyme，去离子水等；
基因扩增：ABI9700384 Dual；
质谱点样：MassARRAY NanodispenserRS1000；
质谱分析：MassARRAY Compact System；
所有试剂和仪器均购自北京康普森生物技术有限公司(Beijing CompassBiotechnology Co,Ltd)。
3、基因组DNA的提取
取EDTA-K2抗凝剂处理的绵羊血液1mL，采用红细胞裂解液裂解去除红细胞，然后用裂解液裂解其它细胞释放出基因组DNA，然后采用酚氯仿法提取基因组DNA。
4、利用Sequenom技术进行基因分型
针对绵羊第1号染色体上第106992693bp位点(KIRREL1,NC_019458.1:106,928,764-107,011,950)，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1(2012年08月)设计引物组合。
PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.2(F)：ACGTTGGATGCTGACTCTGCTCTGCTCTTC；
SEQ ID NO.3(R)：ACGTTGGATGTGCAGCAGGATCACAGGAC；
SEQ ID NO.4(E)：TCCCCACAGTCCCCCCAGAGGACA。
上述引物由北京康普森生物技术有限公司合成。
检测流程如下：
1、提取待测绵羊的基因组DNA；
2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述正向引物F和反向引物R进行PCR扩增反应；
3、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；
4、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物E进行延伸反应；
5、分析延伸产物，从而判定绵羊KIRREL1基因型。
其中，PCR扩增反应使用的反应体系为(5μL)：10ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl2 0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水1.8μL；
PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃20s，58℃30s，72℃60s，40个循环；72℃5min；4℃保存。
对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系为(2μL)：10×SAP Buffer 0.17μL，1.7U/μL SAP Enzyme 0.3μL，去离子水1.53μL；
反应条件为：37℃40min，85℃5min，4℃保存。
延伸反应体系为(2μL)：10×iplex Buffer Plus 0.2μL，iplex Terminator 0.2μL，0.6-1.3μmol/L延伸引物0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水0.619μL；
反应条件为：95℃30s；[95℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环]；72℃3min；4℃保存。
将树脂纯化后的延伸产物移至384孔Spectro CHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer 4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。
经质谱分析得到PCR扩增产物大小为96bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。
统计结果：
待测绵羊第1号染色体上第106992693bp位点不同基因型分析统计结果及不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析如表1所示。
表1绵羊第1号染色体上第106992693bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析
注：同一列肩标不同小写字母代表差异极显著(P＜0.01)。
由此可见，通过对本发明提供的位于绵羊第1号染色体上第106992693bp位点进行分型即可确定待测绵羊产羔性能；在实践过程中，可将TT纯合个体以及CT杂合型个体选留下来，可以显著提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种以及肉羊规模化生产具有潜在的应用价值。
由以上实施例可知，本发明提供了一种与绵羊单胎多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒应用，并具体提供了一种利用Sequenom技术检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，该方法具有灵敏度，准确性更高的优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研兖所
<120> 与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> allele
<222> (101)..(101)
<223> y=c/t
<400> 1
agagatgact ccagggctgg gctttcagtc atcagggcac tgttggccac atcctgcact 60
gactctgctc tgctcttccc cacagtcccc ccagaggaca ycaggattga tggcggtcct 120
gtgatcctgc tgcaggcggg caccccccac aacctcacat gccgcgcctt 170
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg ctgactctgc tctgctcttc 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg tgcagcagga tcacaggac 29
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccccacagt ccccccagag gaca 24
Claims (4)
1.基于利用Sequenom MassARRAY®SNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组或试剂盒的检测绵羊单胎产羔数的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测绵羊的基因组DNA；
2）以所述待测绵羊的基因组DNA为模板，使用利用Sequenom MassARRAY®SNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组或试剂盒中的正向引物和反向引物进行PCR反应，获得PCR产物，用SAP酶消化所述PCR产物，得到消化产物；
3）以所述消化产物为模板，使用利用Sequenom MassARRAY®SNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组或试剂盒中的延伸引物进行延伸反应，得到延伸产物；
4）利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定绵羊KIRREL1基因型；
利用Sequenom MassARRAY®SNP技术检测绵羊单胎产羔数的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的延伸引物；
所述试剂盒包括检测与绵羊单胎产羔数相关的SNP分子标记的试剂或所述的引物组；基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，所述SNP分子标记位于绵羊第1号染色体上106992693bp位点处；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述分子标记在SEQID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第101位存在C/T碱基突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、SAP酶和SNP分子标记标准阳性模板。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系，每5µL包括：浓度为10ng/μL基因组DNA样品1µL，10×PCR反应缓冲液0.5µL，25mmol/L MgCl2溶液0.4µL，25μmol/L dNTPs 0.1µL， 5U/μL Taq DNA聚合酶0.2µL，10pmol/L正向引物和反向引物各0.5μL和去离子水1.8µL；
所述PCR反应的反应程序为：95℃ 2min；95℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 60s，40个循环；72℃ 5min。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述延伸反应的反应体系，每2µL包括：10×iplex Buffer Plus 0.2µL，iplex Terminator 0.2µL，0.6~1.3μmol/L 延伸引物 0.94µL，iplex Enzyme 0.041µL，去离子水0.619µL；
所述延伸反应的反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，（52℃ 5s，80℃ 5s，5个循环），40个循环；72℃ 3min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210384423.2A CN114672574B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210384423.2A CN114672574B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114672574A CN114672574A (zh) | 2022-06-28 |
| CN114672574B true CN114672574B (zh) | 2023-11-07 |
Family
ID=82078286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210384423.2A Active CN114672574B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114672574B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115948567A (zh) * | 2022-08-18 | 2023-04-11 | 塔里木大学 | 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108315435A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-07-24 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及应用 |
| CN109295240A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-02-01 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及smad1基因分型检测试剂盒和应用 |
| CN110004236A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-07-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测esr1基因分型引物组、试剂盒和应用 |
| CN110029178A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-07-19 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用 |
| CN111269990A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-06-12 | 吉林省农业科学院 | 多胎绵羊的标志物、检测多胎绵羊的产品及检测方法 |
| CN113025723A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-06-25 | 华中农业大学 | 一种提高绵羊产羔数的snp标记、检测方法及其应用 |
-
2022
- 2022-04-13 CN CN202210384423.2A patent/CN114672574B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108315435A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-07-24 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及应用 |
| CN109295240A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-02-01 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及smad1基因分型检测试剂盒和应用 |
| CN110004236A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-07-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测esr1基因分型引物组、试剂盒和应用 |
| CN110029178A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-07-19 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用 |
| CN111269990A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-06-12 | 吉林省农业科学院 | 多胎绵羊的标志物、检测多胎绵羊的产品及检测方法 |
| CN113025723A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-06-25 | 华中农业大学 | 一种提高绵羊产羔数的snp标记、检测方法及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Integrated ovarian mRNA and miRNA transcriptome profiling characterizes the genetic basis of prolificacy traits in sheep (Ovis aries);Kisun Pokharel等;BMC Genomics;104 * |
| rs428258894;Ensembl genome browser;Ensembl genome browser;1 * |
| 三个绵羊品种BMPR-IB 基因CDS区1113 位点的多态性与产羔数的相关性分析;杜丽等;农业生物技术学报;1989-1997 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114672574A (zh) | 2022-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110029178B (zh) | 与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用 | |
| CN110004236B (zh) | 与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测esr1基因分型引物组、试剂盒和应用 | |
| CN114657261B (zh) | 一种与绵羊胸椎数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 | |
| CN109234442B (zh) | 一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用 | |
| CN112481392B (zh) | 一种与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN110241252B (zh) | 用于构建桃dna指纹图谱的snp分子标记组合及应用和方法 | |
| EP1056889A2 (en) | Methods and products related to genotyping and dna analysis | |
| CN114708910A (zh) | 一种利用单细胞测序数据计算池测序中细胞亚群富集分数的方法 | |
| CN114672574B (zh) | 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 | |
| CN110541041B (zh) | 与中国家马矮小性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN109207611B (zh) | 一种与绵羊发情性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用 | |
| CN114717330B (zh) | 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 | |
| CN114480704A (zh) | 一种用于茄子种资源鉴定的snp组合标记 | |
| CN108315435B (zh) | 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及应用 | |
| CN113789407B (zh) | 一种用于油莎豆基因分型的snp分子标记组合及其应用 | |
| CN109439773B (zh) | 一种绵羊多羔性状的snp分子标记及其检测用引物组、试剂盒和应用 | |
| CN110305974B (zh) | 基于检测五个snp位点区分常见小鼠近交系的pcr分析引物及其分析方法 | |
| CN111139306B (zh) | 与猪繁殖性状相关的分子标记及其组合应用 | |
| CN111139305A (zh) | 与猪总产仔数性状相关的分子标记及其组合应用 | |
| CN115725745B (zh) | 一种与绵羊多胸椎数相关的snp分子标记及扩增引物组和应用 | |
| CN118726613A (zh) | 一种与绵羊胸围性状相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN118621038A (zh) | 一种与绵羊体长性状相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN108060212A (zh) | Dna分型鉴定试剂盒 | |
| CN108866212B (zh) | 一种用于预测绵羊多羔性状的snp分子标记及其应用 | |
| CN116411127B (zh) | 一组快速鉴定桃果实成熟期性状的分子标记引物组合及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |