CN115725745B - 一种与绵羊多胸椎数相关的snp分子标记及扩增引物组和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记及扩增引物组和应用。本发明所述绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记含有位于绵羊第7号染色体上第82504715处(Oar_V4.0)多态性为T/A的核苷酸序列。用于检测绵羊ABCD4基因型的试剂盒，包括用于扩增所述的SNP分子标记引物对。SNP分子标记、引物对、试剂盒在检测绵羊ABCD4基因型或绵羊分子标记辅助育种中的应用。对ABCD4基因的SNP位点检测，将具有多胸椎数性状的TA基因型个体和AA基因型个体选留下来，从而提高绵羊的生产力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记及扩增引物组和应用。
背景技术
多胸椎数性状是绵羊最重要的经济性状之一，因性状复杂性和家系群体的限制，难以用常规育种方法来快速改良，而分子技术能有效快速地提高其遗传进展，因此鉴定与多胸椎数相关的主效基因或分子遗传标记是现代分子育种的关键。
ABCD4基因位于绵羊7号染色体上，包含18个外显子，编码区总长1712bp，编码蛋白含570个氨基酸。ABCD4基因为ATP结合盒式(ABC)D亚家族4，是ABC转运蛋白D亚家族的成员，人的ABC转运蛋白D亚家族包含ABCD1到ABCD4共4个基因。其中ABCD4在内质网和溶酶体中表达，参与维生素B12的代谢，血液中维生素B12的浓度与同型半胱氨酸的浓度负相关，当维生素B12浓度低时，同型半胱氨酸浓度升高，可能导致骨质疏松。缺乏维生素B12可能导致脊椎病，例如胸脊椎的后柱及侧柱异常。发育期间维生素B12的浓度较低与人的神经管缺陷相关。目前关于ABCD4基因对绵羊胸椎数目的具体影响机制还不是很清楚。所以，通过分子生物学手段，找出影响绵羊胸椎数的突变位点并深入研究位点影响胸椎数目的机制，对于绵羊分子育种工作来说是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记及扩增引物组和应用，所述SNP分子标记与绵羊多胸椎数具有显著的相关性，可以早期筛选具有多胸椎数性状的绵羊，快速提高绵羊的生产力。
本发明提供了基于绵羊ABCD4基因设计与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记中的应用。
优选的，基于绵羊第7号染色体上第82504715处的多态性设计所述SNP分子标记，所述多态性为T/A。
本发明还提供了一种与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记的扩增引物组，包括上游引物F、下游引物R和延伸引物S1，所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，延伸引物S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种鉴定绵羊ABCD4基因型的方法，包括以下步骤，以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物组中的上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；
对PCR扩增产物进行消化后，以消化后的PCR扩增产物为模板，利用上述扩增引物组中的延伸引物S1进行延伸反应；
根据延伸产物进行基因型判定。
优选的，所述PCR扩增反应的程序，包括：94℃预变性5min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃再延伸5min。
优选的，利用SAP酶对PCR扩增产物进行消化。
优选的，所述延伸反应的程序，包括：94℃预变性30s；94℃变性5s，52℃退火5s，80℃延伸5s，5个循环，40个循环；72℃再延伸3min。
本发明还提供了一种检测绵羊多胸椎数的试剂盒，包括上述扩增引物组。
本发明还提供了上述扩增引物组或上述方法或上述试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
有益效果：本发明提供了基于绵羊ABCD4基因设计与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记中的应用，并具体公开了该SNP分子标记的扩增引物组、试剂盒和检测方法，所述SNP分子标记与绵羊多胸椎数具有显著的相关性，同时基于所述SNP分子标记，可以将具有多胸椎数性状的ABCD4基因型TA杂合个体和AA纯合个体选留下来，提高绵羊的生产力，从而实现对绵羊大规模分子育种中应用。
本发明所述扩增引物组和试剂盒建立在Sequenom SNP技术的基础上：首先使用引物扩增目标SNPs所在片段，在扩增产物中加入SAP酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后对待检位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的dNTPs，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。根据测序结果判定绵羊ABCD4基因为TT、TA或AA；其中，单核苷酸型检测是针对绵羊第7号染色体上第82504715bp位点的核苷酸。
本发明提供的利用SequenomSNP技术检测绵羊ABCD4基因型的方法，该技术更灵敏，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。利用本方法可对ABCD4基因的SNP位点实现自动化检测，可以将具有多胸椎数性状的TA杂合个体和AA纯合个体选留下来，从而提高绵羊的产肉能力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中利用SequenomSNP技术对ABCD4基因的三种基因型，即TT、TA和AA的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了基于绵羊ABCD4基因设计与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记中的应用。
本发明优选基于绵羊第7号染色体上第82504715处的多态性设计所述SNP分子标记，所述多态性为T/A。本发明所述染色体和基因组信息优选为绵羊基因组版本Oar_V4.0，且在该位点以A为优势基因。本发明所述SNP分子标记优选位于SEQ ID NO.4所示序列的350bp：AACCAAGTGATTCCTAGACATGGCAAGAGCATGACTTAGTCTCAAGTGTGATTTCCTAAGTATGTCTTTGTTACTCCGAAAATAAAACGTCAGGAGACAGTTTCTGAAAAATTAATAAGGCAACCAAAGTATCAAGGCAAACAACCTCAACCTACTAGGAAAACCCCTGTTTACAGCTCTCGTCGCCTTTCACCCTCAAAAGTATTCTGGTTTGGTGTTTGTCCCAGGGCCCCTTAACACTGTTTATTACTTTAAACTTTACAGAATGCTCTAAACATCACAGCATTCATTAATATTTCTATTTATATTTCAAAATTATCTTTTAAGTAATTTCCAGCACTTTAAATTCTAGTAGGGTAGTGGAAACCTAATGAAACAACAAAATTGAAACAAATAATTTTTTAATATCAGATACCTCTGTTAAAATTTCCCATTGTAACTGTGACATTTCCTTTTTTTTTTTTTACTGTTTTTTTTTTTAATAAAGACCCAAATAAGGTCCACACATTGTCGTCAATC。
本发明还提供了一种与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记的扩增引物组，包括上游引物F、下游引物R和延伸引物S1，所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，延伸引物S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所述扩增引物组，优选基于用Sequenom SNP技术设计得到，且核苷酸序列如下：
上游引物F：5’-ACGTTGGATGCTTTTAAGTAATTTCCAGCAC-3’；
下游引物R：5’-ACGTTGGATGGTTGTTTCATTAGGTTTCCAC-3’；
延伸引物S1：5’-gcGGTTTCCACTACCCTACT-3’。
本发明还提供了一种鉴定绵羊ABCD4基因型的方法，包括以下步骤，以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物组中的上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；
对PCR扩增产物进行消化后，以消化后的PCR扩增产物为模板，利用上述扩增引物组中的延伸引物S1进行延伸反应；
根据延伸产物进行基因型判定。
本发明对基因组DNA的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规DNA提取方法进行提取即可。本发明利用提取得到的基因组DNA为模板构建PCR扩增体系，所述扩增体系以5μL计，优选包括：20～50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/LMgCl20.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCR Primer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL和余量的去离子水。本发明所述体系中，上游引物F和下游引物R构成PCR Primermix，其中上游引物F和下游引物R的终浓度均为100μmol/L。本发明所述PCR扩增反应的程序，优选包括：94℃预变性5min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸60s，45个循环；72℃再延伸5min。
本发明在得到所述PCR扩增产物后，用SAP酶对PCR扩增产物进行消化，所述SAPmix体系以2μL计，优选包括：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL。将SAP mix加入PCR反应板，反应总体积应为7μL，其中PCR产物5μL，SAP mix 2μL。本发明所述消化的程序优选包括：37℃40min，85℃15min，25℃∞。
本发明以消化后的PCR扩增产物为模板，利用延伸引物S1进行延伸反应，且延伸引物S1的终浓度优选为500μmol/L。本发明所述延伸反应的体系以2μL计，优选包括：iplexBuffer 0.2μL，Terminatormix 0.2μL，Extendprimer mix(S1)0.94μL，iplex Enzyme0.041μL，去离子水补齐至2μL。将延伸反应mix对应加入上述384孔反应板，对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包括：延伸反应mix 2μL，SAP mix+PCR产物7μL，共计9μL。本发明所述延伸反应的程序，优选包括表1所示的流程。
表1延伸反应PCR程序
本发明优选对延伸反应得到的延伸产物进行基因型判定，实施例中优选包括质谱检测法分析延伸产物，具体包括将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。
本发明还提供了一种检测绵羊多胸椎数的试剂盒，包括上述扩增引物组。
本发明所述试剂盒中优选还包括进行PCR扩增的其他试剂，更优选包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液和SAP酶。本发明所述试剂盒中优选还包括标准阳性模板。
本发明还提供了上述扩增引物组或上述方法或上述试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供的利用SequenomSNP技术检测绵羊ABCD4基因型的方法，该技术更灵敏，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。利用本方法可对ABCD4基因的SNP位点实现自动化检测，可以将具有多胸椎数性状的TA杂合个体和AA纯合个体选留下来，从而提高绵羊的产肉能力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记及扩增引物组和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、实验材料
选取246只呼伦贝尔绵羊为检测对象。
2、试剂及仪器
试剂：Complete Genotyping Reagent Kit forCompact 384；
基因扩增：ABI9700 384 Dual；
质谱点样：MassARRAY NanodispenserRS1000；
质谱分析：MassARRAY Compact System；
所有试剂和仪器均购自北京君诺德生物技术有限公司(Beijing GenenodeBiotech Co.,Ltd)。
3、基因组DNA的提取
绵羊颈静脉采血1mL，用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。
4、SequenomSNP技术进行基因分型
针对绵羊第7号染色体上第82504715bp位点(NC_019463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0)设计引物组合(上游引物F、下游引物R和延伸引物S1，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3)，并委托北京亿诺众达生物技术有限公司进行引物合成。
检测流程如下：
1、提取待测绵羊的基因组DNA；
2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，对引物F，R和S1进行稀释，F和R终浓度为100μmol/L，S1终浓度为500μmol/L。
3、利用F和R构建PCR反应体系：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl20.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCR Primer mix 1μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至10μL；进行PCR扩增反应：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。
4、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL，与5μL的PCR扩增产物混合；反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃∞。
5、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用延伸引物S1进行延伸反应；延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL，Terminator mix 0.2μL，Extend primer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；与SAP mix+PCR产物7μL，共计9μL；
延伸反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s，40个循环；72℃3min。
6、分析延伸产物，从而对绵羊HIRA基因型进行判定。
将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。
经质谱分析得到PCR扩增产物大小为81bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。
统计结果：
共统计得到239只绵羊的信息，待测绵羊第7号染色体上第82504715bp位点不同基因型分析统计结果见表2。
表2待测绵羊第7号染色体上第82504715bp位点不同基因型分析统计
统计239只呼伦贝尔羊绵羊的胸椎数表型数据。结果见表3。
表3 246只呼伦贝尔羊绵羊的胸椎数表型结果
利用logistic regression回归方法，对待测绵羊第7号染色体上第82504715bp位点不同基因型与呼伦贝尔羊胸椎数进行关联分析，统计结果表明，该位点基因型和胸椎数的关联显著性检验p值为0.00139，该位点基因型极显著影响绵羊胸椎数表型。进一步将不同基因型进行表型值估计，看不同基因型相对于野生型对表型值影响的变化倍数(TT为野生型，TA为杂合型，AA为突变纯合型)表4基因型与羊胸椎数的关联分析
AA基因型与TA基因型与野生型相比，会显著影响个体的胸椎数，这表明该位点与呼伦贝尔羊胸椎数之间有极显著的关联，可以做为一个胸椎数分子标记进行辅助育种。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (1)
1.一种与绵羊多胸椎数相关的SNP分子标记的扩增引物组在筛选具有多胸椎数性状的绵羊中的应用，其特征在于，所述扩增引物组包括上游引物F、下游引物R和延伸引物S1，所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，延伸引物S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述SNP分子标记位于绵羊基因组版本Oar_v4.0第7号染色体上第82504715处，其多态性为T/A，且A为优势基因。
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