CN109371146A

CN109371146A - 绵羊多胸椎数性状的snp分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109371146A
Application number: CN201811582431.8A
Authority: CN
Inventors: 储明星; 孙庆; 刘秋月; 王翔宇; 狄冉; 胡文萍
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-12-24
Also published as: CN109371146B

Abstract

本发明提供了绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用，属于分子标记检测领域。所述绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记含有位于绵羊第7号染色体上第82533661处多态性为C/A的核苷酸序列。用于检测绵羊VRTN基因型的试剂盒，包括用于扩增所述的SNP分子标记引物对。SNP分子标记、引物对、试剂盒在检测绵羊VRTN基因型或绵羊分子标记辅助育种中的应用。对VRTN基因的SNP位点检测，将具有多胸椎数性状的CA基因型个体和AA基因型个体选留下来，从而提高绵羊的生产力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

Description

绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子标记检测领域，具体涉及绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用。

背景技术

多胸椎数性状是绵羊最重要的经济性状之一，因性状复杂性和家系群体的限制，难以用常规育种方法来快速改良，而分子技术能有效快速地提高其遗传进展，因此鉴定与多胸椎数相关的主效基因或分子遗传标记是现代分子育种的关键。

VRTN基因位于绵羊7号染色体上，包含1个外显子，编码区总长2040bp，编码蛋白含686个氨基酸。2003年Sato等构建梅山母猪与杜洛克公猪的F2资源群体，通过180个微卫星标记，采用全基因组扫描的方法，将影响猪脊椎数变异的QTL区间定位到猪染色体1号和7号染色体(Sus scrofa chromosome,SSC1and SSC7)上。他们于2011年对7号染色体上的QTL进行精细定位，通过单倍型分析将区间缩小至41kb，该区域包含一个未知蛋白，被命名为vertnin(VRTN)基因，此基因是一个蛋白质编码基因，在多个研究中被证明与脊椎数发育有关，且在脊椎形成过程中是一个关键的转录因子；基因中9个SNPs与已知QTL基因型的祖代个体相吻合并完全连锁，该区域与西方猪种中脊椎数性状强烈相关。

VRTN基因已经被证明是一个与猪的胸腰椎变异有关联的基因，而绵羊VRTN基因的一个SNP位点(rs426367238)也证明对中国哈萨克羊的胸椎数目及胸腰椎数目有影响。虽然研究者通过一系列实验证明了VRTN是哺乳动物胸椎形成过程中不可或缺的转录因子，但是目前关于VRTN基因对绵羊胸椎数目的具体影响机制还不是很清楚。所以，通过分子生物学手段，找出影响绵羊胸椎数的突变位点并深入研究位点影响胸椎数目的机制，对于绵羊分子育种工作来说是非常有必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用，所述SNP分子标记与绵羊多胸椎数具有显著的相关性，同时基于所述SNP分子标记，可以将具有多胸椎数性状的VRTN基因型CA杂合个体和AA纯合个体选留下来，提高绵羊的生产力，从而实现对绵羊大规模分子育种中应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记，含有位于绵羊第7号染色体上第82533661处多态性为C/A的核苷酸序列。

优选的，含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的第309位多态性为C/A。

本发明提供了用于扩增所述的SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明提供了一种用于检测绵羊VRTN基因型的试剂盒，包括所述的引物对。

优选的，所述试剂盒还包括TaqPCR MasterMix。

本发明提供了所述的SNP分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在检测绵羊VRTN基因型中的应用。

优选的，所述检测绵羊VRTN基因型的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

3)对所述PCR扩增产物测序，拼接，得到VRTN基因序列片段；

4)对所述VRTN基因序列片段的基因型判定：

所述VRTN基因序列片段第309位碱基在正链和反链上同时为A时，判断为AA基因型；

所述VRTN基因序列片段第309位碱基在正链和反链上同时为C时，判断为CC基因型；

所述VRTN基因序列片段第309位碱基在正链和反链上分别为C和A时，判断为CA基因型。

优选的，所述PCR扩增反应的程序为95℃5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。

优选的，所述PCR扩增反应的体系以50μL计为：20～50ng/μL基因组DNA2μL、TaqPCRMasterMix 25μL、上游引物1μL、下游引物1μL，去离子水补齐至50μL。

本发明提供了所述的SNP分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记，含有位于绵羊第7号染色体上第82533661处多态性为C/A的核苷酸序列。实验研究表明，将46只苏尼特羊绵羊进行PCR扩增，扩增产物序列分析，统计AA、CC和AC基因型频率以及46只苏尼特羊绵羊的胸椎数性状的表型数据，将不同基因型与苏尼特羊胸椎数表型数据进行关联分析，结果发现本发明提供的SNP分子标记与绵羊多胸椎数具有显著的相关性，能够作为准确鉴定绵羊多胸椎数性状的分子标记。

本发明提供的SNP分子标记、所述的引物对或所述的试剂盒在检测绵羊VRTN基因型中的应用。本发明提供的该应用具有检测灵敏，准确性高，性价比好的优点，能同时对数百至数千份样本中SNP位点进行检测。利用所述应用中的检测方法可对VRTN基因的SNP位点实现自动化检测，将具有多胸椎数性状的CA基因型个体和AA基因型个体选留下来，从而提高绵羊的生产力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

具体实施方式

本发明提供了绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记，含有位于绵羊第7号染色体上第82533661处多态性为C/A的核苷酸序列。所述绵羊第7号染色体的核苷酸序列在NCBI中登录号NC_019464.2，绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0。在本发明中，所述SNP分子标记位于绵羊VRTN基因中，所述绵羊VRTN基因中的SNP分子标记如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的第309位多态性为C/A。

SEQ ID No.1所示的核苷酸序列如下：

accgccactactacctccagggcatgatcgactccaaggtgatgctgcaggcggtgcgctactccctgcgctccgaggagtccccggagatgaccagcctgccgtccgccacgctcgaggccatcttcgacgcggacgtcaaggccacctgctttcccagcagcttctccaacgtgtggcacttgtacgccctcgcctcggtggtccagcgcaacatctattccatctacccgctgcgcaacctcaagatccggccgtactttaaccgtgtcatccgcccgcgccgctgcgaccacacgcccgccacgctgcacatcatgtgggccggccagccgctcagtggccacctcttccgccaccagtattttgcgcccgtggtggggctggaggaggtggaggccgagagcgcccaccccggcccggctccgctgcccccgcccgccaagaccttggagctgctcaaccgcgagcccggcctcagctactcgcacctgggagagcgctccagcgtcaccaagagcaccttctaccgctggcggcggcagtcccaggagcaccggcagaaggtggccactcgcttctcggccaagcacttcctgcaggacagcttccaccgcgggggcgtcgtgccgctgcagcagttcctgcagaggttccccgagatctcccggtccacctattacgcctggaagcacgagctcgtgggttctggcgcctgccaggccctgacccccacagaggagctggccaagctgccggagcggcaggttaccgaggggctgggatgctcctcgacggccgcgtccagccctggcatggtcttcatgcagcgggccaaattgtacctgg。

本发明提供了用于扩增所述的SNP分子标记的引物对，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。本发明对所述引物对来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物对的来源即可。在本发明实施例中，所述引物对委托天一辉远生物科技有限公司(北京)公司合成。

本发明提供了一种用于检测绵羊VRTN基因型的试剂盒，包括所述的引物对。所述引物对中正向引物和反向引物单独包装。本发明对所述正向引物或反向引物的浓度不做限制，配制成工作浓度100～500倍液即可。

在本发明中，所述试剂盒还优选包括Taq PCR MasterMix。所述Taq PCRMasterMix的组分包括扩增用DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液和Mg²⁺离子。本发明对所述TaqPCRMasterMix的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的TaqPCRMasterMix的来源即可。在本发明实施例中，所述Taq PCR MasterMix液购自北京蕾创生物科技有限公司。

在本发明中，所述检测绵羊VRTN基因型的方法，优选包括以下步骤：

1)提取待检测绵羊的基因组DNA；

3)对所述PCR扩增产物测序，拼接，得到VRTN基因序列片段；

4)对所述VRTN基因序列片段的基因型判定：

本发明提取待检测绵羊的基因组DNA。本发明对提取基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取基因组DNA的方法即可，例如采用试剂盒法提取基因组DNA。本发明对所述试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的动物基因组DNA提取试剂盒即可。得到基因组DNA后，本发明将所述基因组DNA采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，凝胶电泳图中具有明亮且清晰条带，说明提取的基因组DNA的质量合格可以用于后续实验。

得到基因组DNA后，本发明以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。

PCR扩增用引物对的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-accgccactattacctccag-3’(SEQ ID No.2)；

下游引物R：5’-ccaggtacaatttggcccg-3’(SEQ ID No.3)。

在本发明中，所述PCR扩增反应的程序优选为95℃5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。所述PCR扩增反应的体系优选以50μL计为：20～50ng/μL基因组DNA2μL、Taq PCR MasterMix 25μL、上游引物1μL、下游引物1μL，去离子水补齐至50μL。所述PCR扩增产物的长度为849bp。

得到PCR扩增产物后，优选进行切胶回收，富集PCR扩增产物。在本发明中，所述切胶回收的方法优选采用切胶回收试剂盒即可。

切胶回收后，本发明对所述PCR扩增产物测序，拼接，得到VRTN基因序列片段。

在本发明中，所述测序用测序机器为ABI3730测序仪。所述测序优选进行正反向测序，得到的正链序列片段和反向序列片段。本发明对所述拼接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的拼接软件即可，例如MEGA5.0、DNAMAN等软件。

得到VRTN基因序列片段后，本发明对所述VRTN基因序列片段的基因型判定：

所述VRTN基因序列片段第309位碱基在正链和反链上同时为A时，判断为AA基因型；所述VRTN基因序列片段第309位碱基在正链和反链上同时为C时，判断为CC基因型；所述VRTN基因序列片段第309位碱基在正链和反链上分别为C和A时，判断为CA基因型。

在本发明中，根据上述方法得到三种基因型，将具有多胸椎数性状的CA基因型个体和AA基因型个体选留下来用于后续绵羊育种。

下面结合实施例对本发明提供的绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种利用PCR技术检测绵羊VRTN基因型并判断绵羊胸椎数目的方法

1、实验材料

选取46只苏尼特羊绵羊为检测对象。

2、试剂及仪器

试剂：TaqPCR MasterMix；

基因扩增：ABI9700384Dual；

DNA测序：ABI3730测序仪

试剂购自拓英坊科技有限公司(北京)，仪器购自华大公司(北京)。

3、基因组DNA的提取

使用试剂盒提取样品肌肉组织DNA，并通过1％琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测。

4、设计扩增引物

针对绵羊第7号染色体上第82533661bp位点(NC_019464.2(82533315-82535355)，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)设计引物组合。

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-accgccactattacctccag-3’(SEQ ID No.2)；

下游引物R：5’-ccaggtacaatttggcccg-3’(SEQ ID No.3)；

上述引物由天一辉远生物科技有限公司(北京)公司合成。

5、检测流程如下：

以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求所述引物F和R进行PCR扩增反应。

利用双脱氧核糖核酸末端终止法的原理对PCR扩增产物进行测序，使用的测序机器为ABI3730测序仪；其中，PCR扩增反应使用的反应体系以50μL计为：50ng/μL基因组DNA2μL，TaqPCRMasterMix 25μL，上下游引物各1μL，去离子水补齐至50μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。

对测序结果进行分析，使用DNAMAN、Chromas等软件对绵羊VRTN基因型进行判定；

利用Sanger测序原理对PCR扩增产物进行测序，利用DNAMAN、Chromas等软件对绵羊VRTN基因型进行判定。

经质谱分析得到PCR扩增产物大小为849bp。

6、统计结果：

待测绵羊第7号染色体上第82533661bp位点不同基因型分析统计结果见表1。

表1待测绵羊第7号染色体上第82533661bp位点不同基因型分析统计

实施例2

统计46只苏尼特羊绵羊的胸椎数表型数据。结果见表2。

表246只苏尼特羊绵羊的胸椎数表型结果

待测绵羊第7号染色体上第82533661bp位点不同基因型与苏尼特羊胸椎数关联分析统计结果见表3。

表3不同基因型与苏尼特羊胸椎数关联分析

根据表3可知，AA基因型与CC基因型个体的胸椎数之间呈显著差异，这表明该位点与苏尼特羊胸椎数之间有极显著的关联。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记、引物对、检测试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> Ovis aries

<400> 1

accgccacta ctacctccag ggcatgatcg actccaaggt gatgctgcag gcggtgcgct 60

actccctgcg ctccgaggag tccccggaga tgaccagcct gccgtccgcc acgctcgagg 120

ccatcttcga cgcggacgtc aaggccacct gctttcccag cagcttctcc aacgtgtggc 180

acttgtacgc cctcgcctcg gtggtccagc gcaacatcta ttccatctac ccgctgcgca 240

acctcaagat ccggccgtac tttaaccgtg tcatccgccc gcgccgctgc gaccacacgc 300

ccgccacgct gcacatcatg tgggccggcc agccgctcag tggccacctc ttccgccacc 360

agtattttgc gcccgtggtg gggctggagg aggtggaggc cgagagcgcc caccccggcc 420

cggctccgct gcccccgccc gccaagacct tggagctgct caaccgcgag cccggcctca 480

gctactcgca cctgggagag cgctccagcg tcaccaagag caccttctac cgctggcggc 540

ggcagtccca ggagcaccgg cagaaggtgg ccactcgctt ctcggccaag cacttcctgc 600

aggacagctt ccaccgcggg ggcgtcgtgc cgctgcagca gttcctgcag aggttccccg 660

agatctcccg gtccacctat tacgcctgga agcacgagct cgtgggttct ggcgcctgcc 720

aggccctgac ccccacagag gagctggcca agctgccgga gcggcaggtt accgaggggc 780

tgggatgctc ctcgacggcc gcgtccagcc ctggcatggt cttcatgcag cgggccaaat 840

tgtacctgg 849

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Ovis aries

<400> 2

accgccacta ttacctccag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Ovis aries

<400> 3

ccaggtacaa tttggcccg 19

Claims

1.绵羊多胸椎数性状的SNP分子标记，其特征在于，含有位于绵羊第7号染色体上第82533661处多态性为C/A的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的第309位多态性为C/A。

3.一种用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种用于检测绵羊VRTN基因型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq PCR MasterMix。

6.权利要求1或2所述的SNP分子标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4或5所述的试剂盒在检测绵羊VRTN基因型中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测绵羊VRTN基因型的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

3)对所述PCR扩增产物测序，拼接，得到VRTN基因序列片段；

4)对所述VRTN基因序列片段的基因型判定：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序为95℃5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应的体系以50μL计为：20～50ng/μL基因组DNA 2μL、Taq PCR Master Mix 25μL、10μmol/L上游引物1μL、10μmol/L下游引物1μL，去离子水补齐至50μL。

10.权利要求1或2所述的SNP分子标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4或5所述的试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。