CN113684301B - 鉴定杏果皮毛性状的snp标记、引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鉴定杏果皮毛性状的SNP标记、引物及应用。本发明通过全基因组关联分析方法获得与杏果实表皮有毛/无毛性状相关的SNP标记，该多态性位点位于杏基因组7号染色体第15954845bp处，该位点为碱基G或C，并针对该位点设计检测引物。本发明利用1对引物，在幼苗期即可鉴定杏果实表皮是否有毛，实现有毛/无毛性状的早期筛选，缩短了育种年限。通过对244份杏资源进行验证，结果表明，该方法对杏果实表皮有毛/无毛性状的鉴定准确率达100％。本发明提供的鉴定果实表皮有毛/无毛杏的方法具有简单、快速、高效、成本低等优点，在鲜食杏育种中具有重要应用价值。

Description

鉴定杏果皮毛性状的SNP标记、引物及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种鉴定杏果皮毛性状的SNP标记、引物及应用。
背景技术
自上世纪70年代，我国开始杏实生选种和农家品种选种，80年代开始有目的的杂交育种，为生产上提供了大量适生良种。但传统果树育种一方面具有一定的盲目性，另一方面获得目标品种的周期长，在一些针对复杂性状的改良及多性状联合改良中显得无能为力，亟需借助现代分子生物学手段推动育种进程。
分子标记辅助育种是近年来迅速发展的技术，为育种工作提供了新的思路与途径。SNP是指不同品种基因组中相对于参考基因组在该位置存在1个核苷酸的变化。针对基因组中的SNP位点，开发与设计相关PCR引物，即为SNP标记。通过全基因组关联分析获得与特定性状紧密连锁的SNP标记，即可实现对相关性状的鉴定。通过开发与性状紧密连锁的分子标记，可有效提高育种效率，对促进我国杏育种产业持续、快速、高效发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定杏果皮毛性状的SNP标记、引物及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种鉴定杏果皮毛性状的SNP标记，所述SNP标记含有杏如SEQ ID NO:1所示序列第225bp处的多态性为G/C的核苷酸序列。
所述SNP标记包含的多态性位点的基因型为GG或GC，对应的杏果实表皮有毛，若基因型为CC，对应的杏果实表皮无毛。
用于鉴定杏果实表皮有毛/无毛性状的SNP位点位于杏基因组7号染色体的第15954845bp处，该位点为碱基G或C。所述杏基因组参考Jiang等公布的‘串枝红’基因组(版本号为V1.0)。
第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP标记的引物，包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。
第三方面，本发明提供含有SEQ ID NO:2-3所述引物的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供一种鉴定杏果实表皮有毛或无毛性状的方法，包括以下步骤：
1)提取待测杏叶片的总DNA；
2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO:2-3所示的引物进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物。
优选地，PCR反应体系(50μl)为：PCR反应缓冲液25μl，2mM dNTPs 10μl，10pmol/μl上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，1.0U/μl KOD FX 1μl，ddH2O补齐至总体积50μl。PCR反应程序为：94℃2min；98℃30s，50℃30s，68℃30ss，共33～37个循环；68℃7min。或者，
PCR反应体系(20μl)为：PCR Mix 10μl，10pmol/μl上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，ddH2O补齐至总体积20μl。PCR反应程序为：94℃2-5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共33～37个循环；72℃10min。
前述的方法，步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：若SNP标记对应的多态性位点的基因型为GG或GC，判定为果实表皮有毛的杏，若基因型为CC，则为果实表皮无毛的杏。
第五方面，本发明提供所述SNP标记、SEQ ID NO:2-3所示引物或含有该对引物的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)用于杏种质资源果实表皮有毛或无毛性状的鉴定及改良；
(2)用于果实表皮有毛或无毛杏的早期预测；
(3)用于果实表皮有毛或无毛杏的分子标记辅助育种。
本发明通过全基因组关联分析方法获得与杏果实表皮有毛/无毛性状相关的SNP标记，该多态性位点位于杏基因组7号染色体第15954845bp处，该位点为碱基G或C，并针对该位点设计检测引物。本发明利用1对引物在在幼苗期即可鉴定杏果实表皮是否有毛，实现了有毛/无毛性状的早期筛选，缩短了育种年限。
通过对46份李光杏实生后代进行验证，结果表明，该方法对杏果实表皮有毛/无毛性状的鉴定准确率达到100％，同时，对244份杏资源果实表皮有毛/无毛性状的鉴定准确率达到100％。本发明提供的鉴定果实表皮有毛/无毛杏的方法具有简单、快速、成本低等优点，有效提高了杏果实表皮有毛无毛性状的筛选效率，从而加速育种进程，在鲜食杏育种中具有重要应用价值。
附图说明
图1为本发明用于鉴定杏果皮毛性状的SNP标记位置图。
图2为本发明用于鉴定杏果皮毛性状三种基因型的测序峰图。
具体实施方式
本发明提供一种鉴定杏果实表皮有毛/无毛性状的SNP多态性标记位点、引物及使用方法。本发明采用如下技术方案：
通过全基因组关联分析方法获得与杏果实表皮有毛/无毛性状相关的SNP标记，SNP位点位于杏基因组7号染色体的第15954845bp处，该位点为碱基G或C。所述杏基因组参考Jiang等公布的‘串枝红’基因组(版本号为V1.0)。
用于鉴定杏果皮毛性状的SNP标记位置图见图1。
用于鉴定杏果实表皮有毛/无毛性状的SNP位点的引物，其中上游引物是根据杏基因组7号染色体第15954845bp上游序列设计的，下游引物是根据该位点的下游序列设计的。上游引物序列为5′-GCATGGCGTTAATATCATAAGT-3′，下游引物为5′-CTAGCTCGATCACATTTTCA-3′。基因型为GG或GC为果实表皮有毛的杏，而CC为果实表皮无毛的杏。
用于鉴定杏果皮毛性状三种基因型的测序峰图见图2。
本发明提供所述SNP位点在杏果实表皮有毛/无毛性状分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供一种鉴定杏果实表皮有毛/无毛性状的方法，包括以下步骤：
(1)杏叶片总DNA提取：采用CTAB法提取待测杏叶片总DNA，并鉴定DNA的纯度。
(2)引物合成(SEQ ID NO:2-3)：
F：5′-GCATGGCGTTAATATCATAAGT-3′
R：5′-CTAGCTCGATCACATTTTCA-3′
上述引物序列由生物技术公司合成。
(3)PCR反应：以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，利用引物F和R对基因组DNA进行PCR扩增。其中，PCR扩增的反应体系见表1：
表1
PCR扩增程序见表2：
表2
或者，采用如下PCR反应体系和反应程序：
PCR反应体系(20μl)为：KOD FX反应缓冲液10μl，10pmol/μl上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，ddH2O补齐至总体积20μl。
PCR反应程序为：94℃2-5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共33～37个循环；72℃10min。
(4)PCR产物回收及测序：PCR扩增产物(SEQ ID NO:1，第225位碱基n为g或c)经凝胶电泳后，当电泳显示有条带时，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂回收目的片段，并进行一代测序。
(5)一代测序结果比对：将PCR扩增产物测序得到的序列与预测序列进行比对，若SNP标记对应的多态性位点的基因型为GG或GC，判定为果实表皮有毛的杏，若基因型为CC，则为果实表皮无毛的杏。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1利用46份李光杏实生后代进行果实表皮有毛/无毛性状验证
实施时间：2020年；
实施地点：北京市林业果树科学研究院；
实施方案：
选用李光杏实生后代群体，该群体为半同胞家系，采用CTAB法提取46份李光杏实生后代叶片总DNA，并鉴定DNA的纯度。然后利用引物(SEQ ID NO:2-3)，并按上述步骤进行PCR反应，制得的PCR扩增产物经凝胶电泳后，使用普通琼脂糖凝胶DA回收试剂回收目标片段，并进行一代测序，检测PCR产物SNP标记对应的多态性位点的基因型，结果见表3。
表3 46份李光杏实生后代果实表皮有毛/无毛状性状的验证结果
实施例2选取244份杏种质资源对果实表皮有毛/无毛性状进行验证
实施时间：2020年；
实施地点：北京市林业果树科学研究院；
实施方案：
(1)采用CTAB法提取244份杏种质资源叶片总DNA，并鉴定DNA的纯度。
(2)合成引物(SEQ ID NO:2-3)，并按上述步骤进行PCR反应，得到PCR扩增产物经凝胶电泳后，使用普通琼脂糖凝胶DA回收试剂回收目标片段，并进行一代测序，然后检测PCR产物SNP标记对应的多态性位点的基因型。
(3)检测SNP分子标记与有毛无毛性状的相关性
利用上述引物分别对244份对SNP分子标记的可靠性进行验证，基因型为GG和GC为杏果实表皮有毛，CC为无毛，所有待测杏品种的果实表皮毛性状100％符合上述检测结果(表4)。
表4 244份杏资源果实表皮有毛/无毛状性状的验证结果
(4)利用重测序数据对标记的基因型与表型进行关联分析
利用重测序数据对Chr7的15954845bp处的基因型进行分析(表5)，并与表型数据(表4)关联分析，结果表明，所有待测杏品种的果实表皮毛性状100％符合。
表5 244份杏资源重测序分型结果
注：0表示G，1表示C。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市林业果树科学研究院
<120> 鉴定杏果皮毛性状的SNP标记、引物及应用
<130> KHP211115396.9
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 305
<212> DNA
<213> 杏(Prunus armeniaca Lam.)
<400> 1
gcatggcgtt aatatcataa gtaattttga gggtccaaca tcggatcatc agttctcaag 60
catgacggaa tatgatgatt cacgggccat gtcatcaatg acgactggat cgctgggttt 120
gaatgagctt ataggccaag attgtgggaa ggaatgcagt gaattattcg aggcactcca 180
gcaatatatg gggtatgaag ttgaggacgg ggatgcttgg actantttgg aacaattgtt 240
gtgatatata atgatgggca tcaaatcatg acaggcattt catgatgaaa atgtgatcga 300
gctag 305
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatggcgtt aatatcataa gt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagctcgat cacattttca 20

Claims (4)

1.一种鉴定杏果皮毛性状的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记序列如SEQ ID NO:1所示，其中该序列第225bp处的碱基为G或C；
所述SNP标记包含的多态性位点的基因型为GG或GC，对应的杏果实表皮有毛，若基因型为CC，对应的杏果实表皮无毛。
2.一种鉴定杏果实表皮有毛或无毛性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测杏叶片的总DNA；
2）以DNA为模板，利用SEQ ID NO:2-3所示的引物进行PCR扩增；
3）分析PCR扩增产物：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：若权利要求1所述的SNP标记包含的多态性位点的基因型为GG或GC，判定为果实表皮有毛的杏，若基因型为CC，则为果实表皮无毛的杏。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：KOD FX反应缓冲液25 µl，2mM dNTPs 10 µl，10 pmol/µl上、下游引物各1 µl，DNA模板1 µl，1.0 U/µl KOD FX 1 µl，ddH2O补齐至总体积50 µl；
PCR反应程序为：94℃ 2min；98℃ 30s，50℃ 30s，68℃ 30s，共33~37个循环；68℃ 7min；或者，
PCR反应体系为：KOD FX反应缓冲液10 µl，10 pmol/µl上、下游引物各1 µl，DNA模板1µl，ddH2O补齐至总体积20 µl；
PCR反应程序为：94℃ 2-5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，共33~37个循环；72℃10 min。
4.权利要求1所述SNP标记的以下任一应用：
（1）用于杏种质资源果实表皮有毛或无毛性状的鉴定及改良；
（2）用于杏果实表皮有毛或无毛杏的早期预测；
（3）用于杏果实表皮有毛或无毛杏的分子标记辅助育种。
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