CN106191240B - 用于鉴定桃果实表皮毛性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于鉴定桃果实表皮毛性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用。所述的单核苷酸多态性标记位点是桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸，该核苷酸为A或G。本发明筛选得到桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸多态性标记位点，能够用于鉴定或辅助鉴定桃果实表皮毛性状，在鉴定桃果实表皮毛性状时具有较高的准确率。本发明对15个杂交群体共221份待测桃单株进行SNPs准确率的验证，结果表明，本发明对桃果实表皮有毛性状的检测准确率可达96％以上，对桃果实无毛性状的检测准确率可达80％以上，具有较高的准确率。这说明，利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。

Description

用于鉴定桃果实表皮毛性状的单核苷酸多态性标记位点、引 物、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及用于鉴定桃果实表皮毛性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用，属于生物技术领域。
背景技术
选择是育种中最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型，来进行后续的培育。但在传统育种中，由于很难获知后代的基因型，因此选择的依据通常是表现型而非基因型，这种选择方法对质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说，因为其表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系，因而效率不高。此外，对于以果实性状为目标的果树来说，这些性状都有其特定的表现时期，通常需要度过3-5年甚至更长时间的童期，因而选择的时间较晚。这对于那些植株高大、占地多、生长季长的作物，特别是果树之类的园艺作物，显然是非常不利的。
近20年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术，即“分子标记辅助选择”(marker-assisted selection，缩写为MAS)给育种提供了崭新的途径。它通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的。Dirlewanger(2006)利用181个包括SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列)和AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)的分子标记，对207个后代的杂交群体扩增，将果皮毛有/无性状定位在第5连锁群的81.4cM，最连锁的SSR标记CPSCT030与其连锁距离为5.4cM。由于进行分子标记辅助选择有两个重要的前提，首先是必须得到与目标性状紧密连锁的标记，即建立目标基因与分子标记的连锁关系。其次是检测的自动化，由于分子标记辅助选择要求对育种群体进行大规模检测，因而要求检测的方法要简单、快速、成本低、比较准确，以实现检测过程(包括DNA的提取、分子标记的检测、数据分析等)的自动化。但是，可以发现在过去很长一段时间内采用的分子标记，如RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP和SSR等通常需要酶切或PCR后用电泳检测分型结果，很难实现这一点。
SNPs标记(single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它在基因组上分布广泛，数量众多，因此很容易检测到相对于RFLP、RAPD、AFLP、SSR标记更连锁的标记，且在检测时具有高通量、简单、快速、高灵敏度的优点，是进行分子标记辅助育种中最具潜力的标记。目前，Vendramin等人利用12个SNP标记对桃果皮毛基因区段进行加密，发现位于Chr5的15897836-15899002bp处的基因ppa026143m上的一个转座子插入导致了果皮毛性状的突变，由于转座子变异不能用芯片技术进行快速鉴定，因此，不适合开发相应的标记，而与之最连锁的SNP标记位于Chr5(第5染色体)的16488104bp处。之后，Micheletti等人利用数量不超过9000个SNPs的芯片对1580份桃种质进行关联分析，得到了与果皮毛性状关联的SNPs位于Chr5的16774236bp处。
然而，现有的与桃果实表皮毛性状连锁的SSR标记距离目标基因定位距离较远，在杂交后代的早期鉴定中准确率较低；而现有的与目标性状连锁的SNPs标记多来自芯片鉴定的结果，由于芯片位点较少(少于9000个)，因此不能保证鉴定出的SNPs是与目标性状最关联或连锁的位点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供用于鉴定桃果实表皮毛性状的单核苷酸多态性标记位点、引物、试剂盒及应用，该标记位点在鉴定桃果实表皮毛性状时具有较高的准确率。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
用于鉴定桃果实表皮毛性状的单核苷酸多态性标记位点，所述的单核苷酸多态性标记位点是桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸，该核苷酸为A或G。
用于鉴定桃果实表皮毛性状的PCR扩增引物对，所述引物对中的上游引物是根据桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸及其上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物是根据桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸的下游序列进行设计。
所述引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成。
用于鉴定桃果实表皮毛性状的单碱基延伸引物，所述单碱基延伸引物为如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
用于鉴定桃果实表皮毛性状的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的PCR扩增引物对和所述的单碱基延伸引物。
桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定桃果实表皮是有毛性状还是无毛性状中的应用。
一种单核苷酸多态性标记位点在桃果实表皮毛性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
所述的单核苷酸多态性标记位点在鉴定或辅助鉴定桃果实表皮是有毛性状还是无毛性状中的应用。
一种试剂盒在桃果实表皮毛性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
一种利用单核苷酸多态性标记位点鉴定桃果实表皮毛性状的方法，包括以下步骤：
(1)PCR扩增：以待测桃的基因组DNA为模板，用PCR扩增引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(2)SAP反应：配制SAP反应体系，加入步骤(1)PCR扩增反应后的反应体系中，除去PCR扩增反应中未反应的dNTP；
(3)单碱基延伸反应：配制单碱基延伸反应体系，加入步骤(2)SAP反应后的反应体系中；
(4)基因分型：将完成单碱基延伸反应的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片扫描仪扫描，检测分析，根据不同产物的分子量大小进行基因分型。
本发明筛选得到桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸多态性标记位点，能够用于鉴定或辅助鉴定桃果实表皮毛性状，在鉴定桃果实表皮毛性状时具有较高的准确率。
本发明针对桃基因组第5染色体的第17576893位核苷酸多态性的特性，设计了特定的PCR引物扩增对和单碱基延伸引物，将完成单碱基延伸反应的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片扫描仪扫描，进行MALDI-TOF质谱检测，Typer4.0软件分析实验数据，根据不同产物的分子量大小获得其基因分型结果。
本发明对15个杂交群体共221份待测桃单株进行SNPs准确率的验证，结果表明，本发明对桃果实表皮有毛性状的检测准确率可达96％以上，对桃无毛性状的检测准确率可达80％以上，具有较高的准确率。这说明，利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1 SNPs标记位点的获得
本发明以从中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃随机获得的129份桃种质为样品，采用常规CTAB法提取样品DNA，并通过Illumina HiSeq 2000测序仪对129份桃种质进行重测序，得到121Gb数据，平均覆盖桃基因组89.28％，平均测序深度为4.21×左右。根据测序得到的50-150bp的reads，与桃参考基因组v.1.0(http://www.rosaceae.org/ node/355)进行比对，鉴定出4063377个SNPs，利用这些SNPs对129份种质的表型性状进行全基因组关联分析，鉴定出与桃果皮毛有显著关联的SNPs位于第5染色体的17576893bp处。
实施例2 利用SNP标记鉴定表型性状的方法
1、DNA提取
采用常规CTAB法提取待测桃样品组织的DNA，去除RNA，DNA样品总体积不低于15μl。用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量和OD260/280的比值。DNA样品纯度OD260/280值应在1.8-2.0之间，浓度稀释至10ng/μl。
2、设计引物
根据桃基因组第5染色体的第17576893位处左右各200bp序列(具体的核苷酸序列见表1)，设计引物。
表1 SNPs旁侧序列信息
其中，R表示A或G。
引物由生物技术公司合成后，稀释PCR扩增上下游引物至终浓度均为0.5μM。稀释单碱基延伸引物至延伸引物1、2、3终浓度分别为8μM、10μM、15μM，备用。引物序列见表2。
表2 引物序列
3、PCR反应体系及Mass ARRAY分析
按照SEQUENOM-iPLEX标准操作流程进行PCR、SAP、单碱基延伸反应，主要步骤如下：
(1)PCR扩增反应
首先，配制PCR扩增体系，具体见表3。
表3 Sequenom MassArray系统基因分型扩增PCR反应组分
其中，Primer Mix为PCR扩增上游引物和下游引物各加入0.5μl。
将上述试剂转移到PCR管或板中，
PCR扩增程序如下：94℃15min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，共45个循环；72℃3min；4℃保存。
配置1％琼脂糖凝胶，对PCR反应后的产物进行电泳，如果条带明亮且单一，则进行后续试验。
(2)SAP(虾碱性磷酸酶)反应
利用该反应除去未用尽的dNTP，首先配制反应体系，见表4：
表4 SAP酶促反应相关试剂配制组分
将配好的上述溶液2μl加入到完成PCR反应的PCR管或板中。按如下程序进行SAP反应。
SAP反应程序：37℃40min；85℃5min；4℃保存。
(3)单碱基延伸反应
首先配制单碱基延伸反应体系，见表5：
表5 延伸反应相关试剂组分
其中，iPLEX Extend Primer Mix为单碱基延伸引物1、2、3的混合引物，引物1、2、3的加入浓度分别为8μM、10μM、15μM，单碱基延伸引物1、2、3的加入量相同，共0.94μl。
然后将配好的溶液2μl加入到SAP反应后的PCR管或板中，进行延伸反应，程序如下：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，共40个循环；72℃3min；4℃保存。
将完成延伸反应的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片扫描仪扫描，进行MALDI-TOF质谱检测，Typer4.0软件分析实验数据，根据不同产物的分子量大小获得其基因分型结果。当完成延伸反应的产物分子量为5352.5左右时，Chr5：17,576,893bp处为纯合位点，分型为G/G，对应种质的表型为果皮无毛。分子量为5432.4左右时，Chr5：17,576,893bp处为纯合位点，分型为A/A；分子量约为5392.5时，Chr5：17,576,893bp处为杂合位点，分型为A/G；A/A和A/G这两种分型对应的种质表型为果皮有毛。
实施例3 15个杂交群体利用果皮毛关联SNP标记进行表型性状的盲测验证
1、实验材料的选择
以郑州果树研究所资源圃中种植的常规桃品种为实验材料，从中选取调查过表型性状的15个杂交群体共221份单株，具体见表6。
表6 供试杂交群体的名称及群体大小信息
2、利用果皮毛关联SNP标记的鉴定方法
以本发明桃基因组第5染色体的第17576893位作为核苷酸多态性标记位点，对15个杂交群体共221份桃单株果皮毛进行盲测鉴定，具体的鉴定方法参照实施例2的方法。同时，以现有的国外报道的桃基因SNPs位点作为对照，与本发明的SNPs位点进行比较分析。
3、杂交群体中分型结果对表型的预测能力比较
从鉴定结果可以看出，与目前国外报道的利用约9千个SNPs进行关联分析(Chr5：16774236bp)或约3千个SNPs进行连锁分析(Chr5：16488104bp)得到的最连锁SNPs相比，本发明SNPs位点的卡方测验P值最低，即显著性最高(表7)。
表7 不同果皮毛关联或连锁SNPs在15个杂交群体的分型结果及卡方测验
综合比较，其准确率如表8所示，可以看出本发明在进行杂交群体的表型性状预测时，准确率有明显提升，果皮毛SNPs较最近报道的其他研究平均准确率从58.37％提升至90.95％。
表8 本发明涉及的SNPs在对15个杂交群体鉴定后的表型预测能力(准确率)比较
综上所述，本发明的SNPs位点能够帮助实现利用桃幼苗DNA早期预测桃成龄后果皮毛性状的目的，该方法是利用重测序得到的400万以上SNPs中全基因组关联分析得到最关联的位点从而实现的，由于原始SNPs数量庞大，从而保证了得到的关联标记关联性高。

Claims (6)

1.用于鉴定桃果实表皮毛性状的SNP分子标记，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示，其中R为A或G。
2.基于权利要求1所述SNP分子标记制备的用于鉴定桃果实表皮毛性状的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括PCR扩增引物对和单碱基延伸引物；
所述PCR扩增引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成；
所述单碱基延伸引物为如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述SNP分子标记在鉴定或辅助鉴定桃果实表皮毛性状中的应用。
4.权利要求1所述SNP分子标记在桃果实表皮毛性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
5.一种权利要求2所述的试剂盒在桃果实表皮毛性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
6.一种利用权利要求1所述SNP分子标记鉴定桃果实表皮毛性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）PCR扩增：以待测桃的基因组DNA为模板，用PCR扩增引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（2）SAP反应：配制SAP反应体系，加入步骤（1）PCR扩增反应后的反应体系中；
（3）单碱基延伸反应：利用单碱基延伸引物，配制单碱基延伸反应体系，加入步骤（2）SAP反应后的反应体系中；
（4）基因分型：将完成单碱基延伸反应的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片扫描仪扫描，检测分析，根据不同产物的分子量大小进行基因分型；
所述PCR扩增引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成；
所述单碱基延伸引物为如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
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