CN112746129B - 一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记、引物、应用和方法 - Google Patents

一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记、引物、应用和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鉴定杏果皮毛性状的I nde l标记、引物、应用和方法，杏基因组第5染色体的第15454598位核苷酸，该核苷酸为T或纯合缺失。I nde l标记的序列如SEQ I D NO.1所示，其中R为T或纯合缺失。本发明在幼苗初期即能预判杏有无果皮毛,可以用于无果皮毛杏资源的早期筛选，在杂交育种初期就能筛选后代的杏的果皮毛表型，达到科研、新品种选育等要求，同时鉴于杏的童期长、杂交育种年限长等特点，本发明将会在很大程度上提高杏育种的筛选效率，缩短育种年限。

Description

一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记、引物、应用和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说是一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记、引物、应用和方法。
背景技术
杏深受人们的喜爱，不仅风味独特、色泽艳丽，而且营养丰富。杏果实表皮大多被短绒毛，但在中国西部的新疆栽培杏呈现为果实表面光滑无毛。新疆栽培杏在杏产业中起着关键作用，无绒毛性状可直接影响杏的外观，对消费者的接受程度有影响。
杏因其遗传背景复杂、童期长、自交不亲和等特点严重制约了杏遗传育种及新品种的选育。因此通过开发与表型性状相关的标记,应用分子标记辅助育种,弥补常规杂交育种的缺陷,有利于定向选择育种,缩短育种年限,为杏育种的早期选择做铺垫。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于无果皮毛杏资源的早期筛选的鉴定杏果皮毛性状的Indel标记、引物、应用和方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记，杏基因组第5染色体的第15454598位核苷酸，该核苷酸为T或纯合缺失。
上述一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记，Indel标记的序列如SEQ ID NO.1所示，其中R为T或纯合缺失。
上述一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记，由于引物两端不稳定，Indel标记序列的SEQ ID NO.1的中间稳定序列如SEQ ID NO.4所示，其中R为T或纯合缺失。
用于鉴定上述杏果皮毛性状的Indel标记的引物，所述上游引物的序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。
鉴定杏果皮毛性状的Indel标记的应用，Indel标记看用于鉴定杏果皮毛性状，Indel标记的序列SEQ ID NO.1中，如果R为T，则为有果皮毛杏，如果R为纯合缺失，则为无果皮毛杏。
鉴定杏果皮毛性状的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测杏基因组DNA；
(2)以待测杏基因组DNA为模板，利用上述引物对进行扩增，得到PCR扩增产物；
(3)对扩增产物进行Sanger测序；
(4)鉴定果皮毛性状。
上述鉴定杏果皮毛性状的方法，在步骤(2)中：扩增体系为：基因组DNA模板3μL，上游引物和下游引物各0.75μL、浓度均为10μmol/L，Premix Taq15μL，无菌水10.5μL，供给30μL。
上述鉴定杏果皮毛性状的方法，在步骤(2)中：扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30S,55℃退火30S，72℃延伸30S，共33个循环，最后72℃延伸7min，于16℃保存。
上述鉴定杏果皮毛性状的方法，在步骤(2)中：待测杏样品的扩增产物取5μL，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的片段。
上述鉴定杏果皮毛性状的方法，在步骤(4)中：在PCR扩增的稳定序列SEQ ID NO.4中的R位置出现缺失，即第106bp的位置出现缺失，则为无果皮毛杏；若在PCR的稳定序列SEQID NO.4中的R位置为T，即第106bp的位置为T，则为有果皮毛杏。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
本发明通过重测序以及GWAS分析获得与杏果皮毛性状相关的1bp的缺失多态,可作为分子标记。进一步的,在多个无果皮毛和有果皮毛的杏种质资源中进行了验证，证实该分子标记可用于杏果皮毛性状的分子辅助育种。
本发明仅通过扩增及Sanger测序就能鉴定杏各种质的基因型并通过基因型预判将来杏的果皮毛性状,简单快速方便，经济有效。
本发明在幼苗初期即能预判杏有无果皮毛,可以用于无果皮毛杏资源的早期筛选，在杂交育种初期就能筛选后代的杏的果皮毛表型，达到科研、新品种选育等要求，同时鉴于杏的童期长、杂交育种年限长等特点，本发明将会在很大程度上提高杏育种的筛选效率，缩短育种年限。
附图说明
图1 10份待测杏样品PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2 10份杏样品Sanger测序比对结果
图3 65份未知杏果皮毛性状的杏样品PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4a 65份未知杏果皮毛性状的杏样品Sanger测序比对结果(上半部分)；
图4b 65份未知杏果皮毛性状的杏样品Sanger测序比对结果(下半部分)；。
具体实施方式
实施例1、鉴定杏果皮毛性状的Indel标记
以西伯利亚杏‘F106’为参考基因组，对有果皮毛杏和无果皮毛杏共285份资源进行重测序和GWAS分析，在Chr5染色体上，发现与杏果皮毛性状显著关联区域中有一个MYB转录因子，该基因与在油桃中报道的无绒毛性状形成有关的ppa023143m基因高度同源。
表1 285份有表皮毛杏和无表皮毛杏资源概况
编号 资源类型 原产地 资源数量 表型
1 新疆栽培杏 新疆轮台 21 无/有
2 华北栽培杏 河南、河北等地 45 有
3 华北野生杏 内蒙古呼和浩特市 20 有
4 新疆野生杏 新疆伊犁等地 138 有
5 仁用杏 新疆伊犁等地 18 有
6 西伯利亚杏 内蒙古呼和浩特市 43 有
对该MYB转录因子序列分析发现，在该基因第3个外显子内有一个1bp的Indel(Chr5:15454598:T)与杏果皮毛性状显著关联，即无果皮毛中表现为该1bp纯合缺失，而有果皮毛杏中则具有该1bp或杂合基因型。将具有该1bp核酸的单倍体定义为‘T’,将缺失该核酸的单倍体定义为‘-’。杏为二倍体,基于该缺失多态,果皮毛性状在该位点形成三种基因型为T/T基因型、T/-基因型或-/-基因型。
表2缺失多态性位点基本信息
Indel 单倍体基因型
Chr5:15454598 T/-
实施例2、
鉴定杏果皮毛性状的InDel标记的引物
基于1bp缺失多态，以‘F106’基因组序列为参考,利用Primer3(version4.1.0,http://bioinfo.ut.ee/primer3/)在线软件设计一对PCR引物如下：
引物对:
F:5’-TTCACCATCAGTTTCCACCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
R:5’-CGATGTTGGACCCTCAAAAT-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
上述引物所得无表皮毛样品的PCR产物的理论计算长度为：220bp；
上述引物所得有表皮毛样品的PCR产物的理论计算长度为：221bp。
采用引物对扩增的序列作为InDel标记，其序列如SEQ ID NO.1所示：
Figure GDA0003732461240000051
其中R为T时，杏的性状为有果皮毛杏；R为纯合缺失时，杏的性状为无果皮毛杏。
实施例3、鉴别和验证
(1)提取已知基因型的杏样品基因组DNA；
本实施例以已知果皮毛性状的5份无果皮毛杏(11L27、11Z17A、11Z17B、9803A、安江胡安娜)和5份有果皮毛杏样品(06-35、11D02、11N01、11N02、11Z02)为待测样品，提取其基因组DNA。
(2)以待测5份有果皮毛杏和5份无果皮毛杏基因组DNA为模板，利用实施例2的引物对进行扩增，得到PCR扩增产物。
建立扩增的反应体系30μL(含有引物对的试剂),包括:基因组DNA模板3μL、引物各0.75μL(10μmol/L)、Premix Taq 15μL、无菌水10.5μL。
上述反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30S,55℃退火30S，72℃延伸30S，共33个循环，最后72℃延伸7min，于16℃保存。
上述反应在PCR扩增热循环仪上进行扩增。对所得10份待测杏样品的扩增产物取5μL，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的片段。所有材料均获得了的与目标片段长度大小相近的产物。如图1所示：Marker为第1泳道，引物对扩增得到的无果皮毛样品扩增产物为2-6泳道；引物对2扩增得到有果皮毛扩增产物为7-11泳道。
(3)Sanger测序
选择引物扩增正常、扩增产物复合预测大小的扩增产物进行切胶回收并测序，无表皮毛杏扩增产物和有表皮毛杏扩增产物的测序序列。
如图2所示，由于引物两端测序不稳定，因此在实际鉴别中，需要选取SEQ ID NO.1序列中稳定的保守序列进行比对鉴别，其序列如SEQ ID NO.4所示：
Figure GDA0003732461240000061
其中R为T时(即第106个位点)，杏的性状为有果皮毛杏；R为纯合缺失时，杏的性状为无果皮毛杏。
与预测序列进行比对，得到在以下PCR扩增序列106bp的位置出现T的缺失，则为无果皮毛杏；若在PCR扩增序列106bp的位置不缺失，则为有果皮毛杏，如图2。
上述鉴定结果基因型与已知基因型一致，如表3。
表3 10份测序杏样品缺失多态性位点(T/-)检测信息
实验编号 材料名称 果皮毛性状 基因型
1 11L27 无 -
2 11Z17A 无 -
3 11Z17B 无 -
4 9803A 无 -
5 安江胡安娜 无 -
6 06-35 有 T
7 11D02 有 T
8 11N01 有 T
9 11N02 有 T
10 11Z02 有 T
实施例4、实际应用鉴定。
为了验证Indel分子标记的可靠性，利用实施例2中特异性引物对鉴别65份未知杏果皮毛性状的杏的Chr5:15454598基因型，如图3所示(Marker依次为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；样品编号见图中标注)。
最终得到61份Sanger测序结果,如图4a和图4b所示(图4a和图4b中编号24、46、50、57因技术原因测序未成功)。
在稳定序列(SEQ ID NO.4)中的R位置，即第106个位点的位置出现缺失，则为无果皮毛杏；R位置，即在第106bp的位置不缺失，为T，则为有果皮毛杏。
在2020年对此61份材料杏果实外观进行观察，获得杏果皮毛性状，与采用本申请特异性引物对鉴别率为96.7％，如表4所示：
表4 61份杏样品缺失多态性位点(T/-)检测信息
Figure GDA0003732461240000071
Figure GDA0003732461240000081
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
序列表
<110> 国家林业和草原局泡桐研究开发中心
<120> 一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记、引物、应用和方法
<140> 2021101846629
<141> 2021-02-10
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 221
<212> DNA
<213> apricot
<400> 1
ttcaccatca gtttccacca ctcgttccac aatgccttga cattctaagg gcatcagctt 60
gggaaagcct gatatcaatg tcgacaaagt catcaagctc agatgcagat gcaccaacca 120
atcacatcaa cggcggccaa aatcacgttt ctttrggtta tcatcatgat gttcatgagc 180
atggcgttaa tatcataagt aattttgagg gtccaacatc g 221
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttcaccatca gtttccacca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgatgttgga ccctcaaaat 20
<210> 4
<211> 173
<212> DNA
<213> apricot
<400> 4
gggcatcagc ttgggaagcc tgatatcaat gtcgacaaag tcatcaagct cagatgcaga 60
tgcaccaacc aatcacatca acggcggcca aaatcacgtt tctttrggtt atcatcatga 120
tgttcatgag catggcgtta atatcataag taattttgag ggtccaacat cga 173

Claims (9)

1.一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记，其特征在于，杏基因组第5染色体的第15454598位核苷酸，该核苷酸为T或纯合缺失；Indel标记的序列如SEQ ID NO.1所示，其中R为T或纯合缺失。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定杏果皮毛性状的Indel标记，其特征在于，由于引物两端不稳定，Indel标记序列的SEQ ID NO.1的中间稳定序列如SEQ ID NO.4所示，其中R为T或纯合缺失。
3.用于鉴定权利要求1-2任一所述杏果皮毛性状的Indel标记的引物，其特征在于，上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.鉴定杏果皮毛性状的Indel标记的应用，其特征在于，Indel标记用于鉴定杏果皮毛性状，Indel标记的序列SEQ ID NO.1中，如果R为T，则为有果皮毛杏，如果R为纯合缺失，则为无果皮毛杏。
5.鉴定杏果皮毛性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测杏基因组DNA；
(2)以待测杏基因组DNA为模板，利用权利要求3所述引物对进行扩增，得到PCR扩增产物；
(3)对扩增产物进行Sanger测序；
(4)鉴定果皮毛性状。
6.根据权利要求5所述的鉴定杏果皮毛性状的方法，其特征在于，在步骤(2)中：扩增体系为：基因组DNA模板3μL，上游引物和下游引物各0.75μL、浓度均为10μmol/L，Premix Taq15μL，无菌水10.5μL，供给30μL。
7.根据权利要求5所述的鉴定杏果皮毛性状的方法，其特征在于，在步骤(2)中：扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30S,55℃退火30S，72℃延伸30S，共33个循环，最后72℃延伸7min，于16℃保存。
8.根据权利要求5所述的鉴定杏果皮毛性状的方法，其特征在于，在步骤(2)中：待测杏样品的扩增产物取5μL，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的片段。
9.根据权利要求5所述的鉴定杏果皮毛性状的方法，其特征在于，在步骤(4)中：在PCR扩增的稳定序列SEQ ID NO.4中的R位置出现缺失，即第106bp的位置出现缺失，则为无果皮毛杏；若在PCR的稳定序列SEQ ID NO.4中的R位置为T，即第106bp的位置为T，则为有果皮毛杏。
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与黄瓜有毛基因紧密连锁的SSR标记;王惠哲等;《华北农学报》;20131231;第28卷(第04期);第79-82页 *

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