CN114015796A - 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用 - Google Patents

一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114015796A
CN114015796A CN202111279717.0A CN202111279717A CN114015796A CN 114015796 A CN114015796 A CN 114015796A CN 202111279717 A CN202111279717 A CN 202111279717A CN 114015796 A CN114015796 A CN 114015796A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
sequence shown
nucleotide
molecular marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111279717.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114015796B (zh
Inventor
屈淑平
王云莉
罗玉松
徐文龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Agricultural University
Original Assignee
Northeast Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Agricultural University filed Critical Northeast Agricultural University
Priority to CN202111279717.0A priority Critical patent/CN114015796B/zh
Publication of CN114015796A publication Critical patent/CN114015796A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114015796B publication Critical patent/CN114015796B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用。属于生物技术领域。为了快速、高效鉴定美洲南瓜浅白色果皮和加速绿果皮南瓜选育进程。本发明公开了分子标记组合物：(a)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；(b)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，还有分别扩增(a)组和(b)组分子标记的引物对：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。本发明提供的分子标记具有较高稳定性，可在南瓜幼苗期简便、快速地用于浅白色果皮类型的筛选，回交转育的方法可快速培养出美洲南瓜浅白色果皮品种改良品系。

Description

一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物 及应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用。
背景技术
美洲南瓜(Cucurbita pepo L.)是葫芦科作物(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita)重要的栽培品种之一，其幼嫩果实可菜用，成熟种子可食用或加工成南瓜籽油，且具有适应性好、栽培容易、产量高等特点。南瓜果色的变化程度是衡量果实发育和成熟状态的重要观察指标，对果实品质判断具有重要指导意义，且对类胡萝卜素和叶绿素的积累和代谢也具有重要研究价值。美洲南瓜果皮颜色是南瓜重要的商品性状，直接影响消费者的购买能力。幼嫩果实的果皮大都为浅绿色或浅黄色，随着果实发育成熟逐渐显现为浅白色、浅黄色、明黄色、浅绿色、墨绿色等。除了遗传因素，环境因素也会影响果实颜色的转色，从而影响其果实品质及商品价值。开展美洲南瓜浅色和绿色性状的研究，并选育出符合消费者喜好的果色，具有广阔的研究应用价值和经济价值。
传统育种方法利用多年回交方法，根据植株成熟果实的颜色性状进行选育，存在选育周期长、消耗大量人力物力、需要有多年育种经验者等问题。分子标记多态性丰富，辨识度高，检测手段简单、快速，检测结果精确。与目的性状紧密连锁的分子标记可用于标记辅助选择育种，加速育种进程。因此，开发美洲南瓜绿色果皮性状紧密连锁的分子标记，对于提高美洲南瓜果实外观品质，揭示类胡萝卜素和叶绿素的积累和代谢分子机制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了在美洲南瓜的苗期快速、高效鉴定美洲南瓜浅白果皮性状，加速南瓜选育进程。
本发明提供了一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记，所述分子标记为以下(a)或(b)或为(a)和(b)的组合：
(a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜深绿茎性状基因W连锁；SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜浅绿茎性状基因w连锁；
(b)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜深绿茎性状基因W连锁；SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜浅绿茎性状基因w连锁。
进一步地限定，扩增所述(a)组核苷酸序列的引物为：SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
进一步地限定，扩增所述(b)组核苷酸序列的引物为：SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种鉴定美洲南瓜浅白色果皮的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的分子标记组合物。
进一步地限定，所述试剂盒还包括：10×Buffer、dNTP、DNA模板、Taq酶和ddH2O。
本发明提供了一种鉴定美洲南瓜浅白色果皮性状的方法，所述方法的具体步骤为：
(1)提取待检测样品的DNA；
(2)以步骤(1)所述的DNA为模板，利用SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列进行PCR反应，再利用SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列进行PCR反应，如果扩增的条带为255nt和291nt，则待检测植株为浅白果皮纯合株，如果扩增的片段大小为291nt和323nt，或255nt和232nt，则待检测植株为绿果皮杂合株。
本发明提供了一种育种浅白色果皮美洲南瓜的方法，所述方法的具体步骤为：
1)以美洲南瓜浅白果皮品系‘113’为母本，以绿果皮品系为父本，将所述母本与父本进行杂交，所得F1代与所述父本进行回交，得到后代BC1F1，分别利用SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列扫描BC1F1群体，选择经SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列扫描后具有323nt和291nt核苷酸片段且经SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到后代BC2F1；
2)分别利用权利要求1所述的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描BC2F1群体，选择经SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扫描后具有323nt和291nt核苷酸片段且经SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，再与所述父本进行回交得到回交三代BC3F1；
3)利用权利SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描BC3F1群体，选择经分子标记SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扫描后具有323nt和291nt核苷酸片段且经SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，进行自交，后代记为BC3F2；
4)利用SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描BC3F2，选择经SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扫描后具有291nt核苷酸片段且经SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt核苷酸片段的植株，即为即为改良浅白果皮自交系。
上述的分子标记或上述的试剂盒在鉴定纯合美洲南瓜的浅白色果皮性状中的应用。
上述的分子标记或上述的试剂盒在育种浅白色果皮或绿果皮性状的美洲南瓜中的应用。
有益效果：本发明利用美洲南瓜浅白果皮‘113’与绿果皮‘19’杂交获得F1植株，F1植株自交获得1572株F2分离群体，通过对F2群体的果色表型分析，确定了美洲南瓜浅白果皮属于单基因控制的显性性状，绿果皮属于隐性性状。分别取F2分离群体单株叶片提取DNA，利用BSA-seq和分子标记的方法筛选出与浅白果皮性状基因W紧密连锁的分子标记。利用高密度图谱的分子标记，最终提供的两个与印度南瓜红果皮紧密连锁的分子标记，分别坐落在控制目标性状基因的两侧，两标记遗传距离为0.7cM，便于浅白果皮分子标记辅助育种体系的建立。本发明的InDel紧密连锁分子标记区分果色准确率为99％以上，简单易操作、重复性好、低成本、有效缩短育种周期，可应用于美洲南瓜育种中。
本发明还提供了利用上述分子标记快速培育浅白果皮美洲南瓜的应用。利用连续回交结合分子标记的方法，浅白果皮‘113’为非轮回亲本，绿果皮‘19’为轮回亲本，利用本发明的两个GP-01引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和GP-02引物(SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8)扫描回交群体，根据PCR扩增产物的电泳条带，快速准确的改良绿果皮‘19’的果色性状。利用多态性好的InDel分子标记将有助于建立美洲南瓜浅白果皮性状的分子标记辅助育种体系。
附图说明
图1为InDel分子标记GP-01和GP-02和控制美洲南瓜浅白果皮基因W紧密连锁，每一个叉号代表1个单交换事件；
图2为InDel标记GP-01P1，P2，F1，F2群体PCR产物的电泳条带，其中M为D2000Marker，条带长度由高到低分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，P1代表浅白果皮品系‘113’，P2代表绿果皮品系‘19’，F1为P1和P2的杂交第一代，F2为F1代自交后代，F2浅白果皮群体和F2绿果皮群体分别表示在F2群体中随机挑选的10株浅白果皮和10株绿果皮植株；
图3为InDel标记GP-02P1，P2，F1，F2群体PCR产物的电泳条带，其中M为D2000Marker，条带长度由高到低分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，P1代表浅白果皮品系‘113’，P2代表绿果皮品系‘19’，F1为P1和P2的杂交第一代，F2为F1代自交后代，F2浅白皮群体和F2绿果皮群体分别表示在F2群体中随机挑选的10株浅白果皮和10株绿果皮植株。
具体实施例
下面结合具体实施方法，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
浅白果皮的标准：植株果实表皮叶绿素含量大于45mg/L范围内；
绿果皮的标准：植株果实表皮叶绿素含量小于10mg/L范围内；
本发明提及的果实是指美洲南瓜授粉后40天后果实。
分子标记GP-01(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和GP-02(SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4)。
实施例1.与控制美洲南瓜浅白果皮性状紧密连锁的分子标记的筛选。
1.F2群体的构建
本实例选取美洲南瓜高代自交品系浅白果皮‘113’和绿果皮‘19’为杂交亲本，构建分离群体。F1代表现为浅白果皮，F1代自交产生F2代分离群体，在田间鉴定1572个F2代个体中的浅白：绿果皮表型，用卡方分析进行验证符合3：1比率，因此美洲南瓜浅白果皮性状为单基因控制的显性性状，绿果皮性状为隐性性状，将浅白果皮基因命名为White(W)，绿果皮基因命名为w。
2.浅白果皮紧密连锁标记的筛选
①南瓜基因组DNA的提取
用CTAB法提取亲本及F2分离群体的叶片总DNA。方法为：取两片真叶展开时的叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于2.0ml的离心管中；加入预热的800μl CTAB提取缓冲液，65℃水浴2h；取出后冷却至室温，12000r/min 4℃离心15min，吸取600μl上清液至新2.0ml的离心管中；加入等体积氯仿异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后12000r/min 4℃离心15min；吸取400μl上清液至新2.0ml的离心管中；继续加入等体积氯仿异戊醇，混匀后12000r/min 4℃离心15min；取250μl上清液至新1.5ml的离心管中，加等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃冰箱存放1h；12000r/min 4℃离心10min；倒去上清液，用体积分数为70％的乙醇吹打洗涤沉淀两次，干燥后，加入35μl ddH2O溶解后，加入10μg/ml的RNA酶去除RNA，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λDNA为标准，估计所得DNA的浓度，存于-20℃备用。
②分子标记的获得
根据F2代群体田间调查结果随机选取30株浅白果皮与绿果皮单株，构建浅白果皮基因池和绿果皮基因池。两基因池与亲本‘113’和‘19’进行BSA-seq分析。以美洲南瓜已发表基因组为参照基因组，利用重测序和InDel-index标记关联分析，将W基因定位到一个第15号染色体关联区域。
分析美洲南瓜基因组重测序得到的InDel结果并设计InDel标记引物。以‘113’、‘19’和F1 DNA为模板，分别以SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物(扩增分子标记GP-01)；SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物(扩增分子标记GP-02)进行PCR扩增。上述引物由华大基因合成。PCR扩增体系如表1所示和程序如下：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003328377210000051
PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸5min；35cycles；72℃终延伸5min；最后4℃保存。PCR产物使用0.8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，银染法显色。分子标记GP-01和GP-02在‘113’、‘19’和F1之间有多态性且条带清晰的标记。
③InDel分子标记扫描F2分离群体
以上述F2群体的单株DNA为模板，利用上述开发的两个InDel引物(分子标记GP-01的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；分子标记GP-02的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，均由北京华大合成。)进行PCR扩增，统计电泳和银染显色结果，寻找标记的基因型与果皮性状表现型有差别的单株，获得与目标基因有交换事件的单株。
所述PCR体系、PCR程序同本实施例步骤②所述。
分子标记GP-01部分扫描结果见图2，浅白果皮植株均呈现出291nt或291nt和323nt的条带，绿果皮植株呈现出323nt的条带。分子标记GP-02部分扫描结果见图3，浅白果皮植株均呈现出255nt或255nt和232nt的条带，绿果皮植株呈现出232nt的条带。
以上2个分子标记经过1572株F2分离群体进行验证，结果表明2个分子标记，GP-01和GP-02可以较好地区分浅白和绿果皮单株，均与W基因紧密连锁，且分别坐落于W基因两侧，两标记遗传距离为0.7cM(图1)。其中，分子标记GP-01中SEQ ID NO.1所示的序列为291nt核苷酸片段，与浅白果皮基因W连锁；SEQ ID NO.2所示的序列为323nt核苷酸片段，与绿皮基因w连锁；分子标记GP-02中SEQ ID NO.3所示序列为255nt核苷酸片段，与与浅白果皮基因W连锁；SEQ ID NO.4所示序列232nt核苷酸片段，与绿果皮基因w连锁。
标记GP-1、标记GP-2与W基因各存在9个和1个单交换事件，均与目标基因紧密连锁。分子标记具有高稳定特征，利用这些分子标记构建高密度遗传图谱和物理图谱，将有助于建立印度南瓜红果皮颜色目标基因筛选的分子标记辅助育种系。
3.多态性片段测序
以浅白果皮亲本‘113’和绿果皮亲本‘19’基因组DNA为模板，分别以分子标记GP-01和GP-02进行PCR扩增。PCR反应总体系为20μl：10×Buffer 2μl，dNTP 2μl，DNA模板1.2μl，上下引物各0.8μl，高保真酶0.2μl，ddH2O 13μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35cycles；72℃终延伸5min；最后4℃保存。
20μl PCR扩增产物中加入BioTeke SYBR Green I核酸染料5μl，室温静置10分钟使染料与DNA结合，2％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目的片段，使用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit分别回收纯化DNA片段，具体步骤参照试剂盒说明书，产品编号9762。将纯化片段送由华大基因有限公司测序，测序结果通过DNAMAN软件分析。其中以浅白果皮‘113’为模板利用分子标记GP-01扩增的片段大小为291nt，扩增序列见SEQ ID NO.1。以绿果皮‘19’为模板利用分子标记GP-01扩增的片段大小为323nt，扩增序列见SEQ ID NO.2。以浅白果皮‘113’为模板利用分子标记GP-02扩增的片段大小为255nt，扩增序列见SEQ ID NO.3。以绿果皮‘19’为模板利用分子标记GP-02扩增的片段大小为232nt，扩增序列见SEQ ID NO.4。
4鉴定美洲南瓜果色性状的纯合度
提取待检测的美洲南瓜真叶的DNA进行PCR，在苗期鉴定出植株的果色位点是否纯合。
计算准确率的公式为：分离群体中，分子标记鉴定的基因型/植株表现型。
纯合的浅白果皮植株利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩增的片段大小为291nt，再利用SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物，扩增的片段大小为255nt，准确率为99.48％。
杂合的浅白果皮植株利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩增的片段大小为291nt和323nt，再利用SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ IDNO.8所示的下游引物，扩增的片段大小为255nt和232nt，准确率为99.5％。
纯合的绿果皮植株利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物扩增的片段大小为323nt，再利用SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物，扩增的片段大小为232nt，准确率为98.96％。
实施例2.浅白果皮南瓜的育种方法。
本实施例利用回交转育的方法，以浅白果皮‘113’作为非轮回亲本，绿果皮‘19’为轮回亲本，定向改良‘19’的果皮颜色性状，具体操作步骤如下：
(1)浅白果皮‘113’和绿果皮‘19’进行杂交，所得F1代与‘19’进行回交得到后代BC1F1，利用本发明的两个分子标记GP-01和GP-02扫描BC1F1群体，即以BC1F1群体中每个植株DNA为模板，分别利用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；以及SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系、PCR反应条件和酶切体系同实施例1中②所述。选择经分子标记GP-01PCR扩增具有323nt和291nt核苷酸片段且经分子标记GP-02PCR扩增后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到后代BC2F1。
(2)利用本发明的分子标记GP-01和GP-02扫描BC2F1群体，继续选择经标记GP-01PCR扩增具有323nt和291nt核苷酸片段且经分子标记GP-02PCR扩增后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到BC3F1。
(3)利用本发明的分子标记GP-01和GP-02扫描BC3F1，继续选择经分子标记GP-01PCR扩增具有323nt和291nt核苷酸片段且经分子标记GP-02PCR扩增后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，自交得到后代BC3F2。
(4)利用本发明的分子标记GP-01和GP-02扫描BC3F2群体，选择经分子标记GP-01扫描后具有291nt核苷酸片段且在标记GP-02具有255nt核苷酸片段的植株，即为改良浅白果皮自交系。定植该自交系并调查从授粉当天起到40d成熟时期果实的果皮颜色。成熟时期果皮总叶绿素含量为3.5mg/L，颜色为浅白色，并且其他农艺性状与‘19’相似。说明利用本发明的分子标记GP-01和GP-02可对美洲南瓜果皮进行快速准确的改良。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggggagtttg attgaaggtg gaaaagagtt tggttaagag agttttctct cagcttttta 60
tgaaaagaaa aggaaaggaa agtgggaaga atgaatatgt tgggagttat agaaagggat 120
gaagaaggaa aggtttaggg tttcgaattt agggtttagg gtttagaatt tagggtttag 180
ggtttagggt ttaacaaaaa caacaaccat ttctttcttt tacctttgct ttgtgctcta 240
aactttgctt ttttgaggtt tctctttcga catcactcat ttctgcctaa c 291
<210> 2
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggggagtttg attgaaggtg gaaaagagtt tggttaagag agttatgaga aatgggaaat 60
gaaaactttt gttctctcag ctttttatga aaaagaaaag ggagaaaagg aaaggaaagt 120
gggaagaatg aatatgttgg gagttataga aagggatgaa gaaggaaagg tttagggttt 180
cgaatttagg gtttagggtt tagaatttag ggtttagggt ttagggttta acaaaaacaa 240
caaccatttc tttcttttac ctttgtgctc taaactttgc ttttttgagg tttctctttc 300
gacatcactc atttctgcct aac 323
<210> 3
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aacgcaccaa actcaacttt tttgtctgat gtttgctctt cgtagatatt tcaatgagtc 60
gtttaaaaag tttggataga tacatttttt tttaaataaa aaaatgtata aaaaaatgtg 120
aatagtttaa attttttgaa tggtacctca aataaaaaat tgaaattaca taaattaatt 180
ttataatata acccaaacat atttatagta agaaggtcga gaggagtggg atcagggagg 240
attgaaggcg ttgat 255
<210> 4
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aacgcaccaa actcaacttt tttgtctgat gtttgctctt cgtagatatt tcaatgagtc 60
gtttaaaaag tttggataga tacatttttt tttaaagaat agtttaaatt ttttgaatgg 120
tacctcaaat aaaaaattga aattacataa attaatttta taatataacc caaacatatt 180
tatagtaaga aggtcgagag gagtgggatc agggaggatt gaaggcgttg at 232
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ggggagtttg attgaagg 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gttaggcaga aatgagtgat g 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
aacgcaccaa actcaact 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atcaacgcct tcaatcct 18

Claims (9)

1.一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为以下(a)或(b)或为(a)和(b)的组合：
(a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜深绿茎性状基因W连锁；SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜浅绿茎性状基因w连锁；
(b)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜深绿茎性状基因W连锁；SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列，该序列与美洲南瓜浅绿茎性状基因w连锁。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，扩增所述(a)组核苷酸序列的引物为：SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，扩增所述(b)组核苷酸序列的引物为：SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
4.一种鉴定美洲南瓜浅白色果皮的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的分子标记组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：10×Buffer、dNTP、DNA模板、Taq酶和ddH2O。
6.一种鉴定美洲南瓜浅白色果皮性状的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
(1)提取待检测样品的DNA；
(2)以步骤(1)所述的DNA为模板，利用SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列进行PCR反应，再利用SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列进行PCR反应，如果扩增的条带为255nt和291nt，则待检测植株为浅白果皮纯合株，如果扩增的片段大小为291nt和323nt，或255nt和232nt，则待检测植株为绿果皮杂合株。
7.一种育种浅白色果皮美洲南瓜的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
1)以美洲南瓜浅白果皮品系‘113’为母本，以绿果皮品系为父本，将所述母本与父本进行杂交，所得F1代与所述父本进行回交，得到后代BC1F1，分别利用SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描BC1F1群体，选择经SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扫描后具有323nt和291nt核苷酸片段且经SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，与所述父本进行回交，得到后代BC2F1；
2)分别利用权利要求1所述的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描BC2F1群体，选择经SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扫描后具有323nt和291nt核苷酸片段且经SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，再与所述父本进行回交得到回交三代BC3F1；
3)利用权利SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描BC3F1群体，选择经分子标记SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扫描后具有323nt和291nt核苷酸片段且经SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt和232nt核苷酸片段的植株，进行自交，后代记为BC3F2；
4)利用SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列与SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描BC3F2，选择经SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列扫描后具有291nt核苷酸片段且经SEQID NO:7所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列扫描后具有255nt核苷酸片段的植株，即为即为改良浅白果皮自交系。
8.权利要求1-3任意一项所述的分子标记或权利要求4或5所述的试剂盒在鉴定纯合美洲南瓜的浅白色果皮性状中的应用。
9.权利要求1-3任意一项所述的分子标记或权利要求4或5所述的试剂盒在育种浅白色果皮或绿果皮性状的美洲南瓜中的应用。
CN202111279717.0A 2021-10-29 2021-10-29 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用 Active CN114015796B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111279717.0A CN114015796B (zh) 2021-10-29 2021-10-29 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111279717.0A CN114015796B (zh) 2021-10-29 2021-10-29 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114015796A true CN114015796A (zh) 2022-02-08
CN114015796B CN114015796B (zh) 2023-09-26

Family

ID=80059274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111279717.0A Active CN114015796B (zh) 2021-10-29 2021-10-29 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114015796B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116497152A (zh) * 2023-06-19 2023-07-28 东北农业大学 一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用
CN117487958A (zh) * 2024-01-02 2024-02-02 东北农业大学 一种与控制美洲南瓜无壳基因相关的分子标记及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636393A (zh) * 2016-12-19 2017-05-10 广东省农业科学院蔬菜研究所 与南瓜皮色基因连锁的snp分子标记及其应用
CN107912295A (zh) * 2017-11-17 2018-04-17 衢州市农业科学研究院 一种优质、高产南瓜新品种的育种方法
CN110205396A (zh) * 2019-04-18 2019-09-06 南京农业大学 一种与黄瓜果实不规则条纹性状紧密连锁的snp标记及其应用
CN110527740A (zh) * 2019-09-11 2019-12-03 东北农业大学 一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用
CN110607391A (zh) * 2019-11-05 2019-12-24 东北农业大学 一种与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记、引物及应用
US20210329873A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Hm.Clause, S.A.S. Hybrid squash plant named hmx588615

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636393A (zh) * 2016-12-19 2017-05-10 广东省农业科学院蔬菜研究所 与南瓜皮色基因连锁的snp分子标记及其应用
CN107912295A (zh) * 2017-11-17 2018-04-17 衢州市农业科学研究院 一种优质、高产南瓜新品种的育种方法
CN110205396A (zh) * 2019-04-18 2019-09-06 南京农业大学 一种与黄瓜果实不规则条纹性状紧密连锁的snp标记及其应用
CN110527740A (zh) * 2019-09-11 2019-12-03 东北农业大学 一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用
CN110607391A (zh) * 2019-11-05 2019-12-24 东北农业大学 一种与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记、引物及应用
US20210329873A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Hm.Clause, S.A.S. Hybrid squash plant named hmx588615

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGJUAN LIN等: "Classification of inheritance of trichomes in different organs in zucchini (Cucurbita pepo L.)", CROP SCIENCE, vol. 63, pages 712 *
SHU-PING QU等: "QTL analysis of early flowering of female flowers in zucchini (Cucurbita pepo L.)", JOURNAL OF INTEGRATIVE AGRICULTURE, pages 1 - 14 *
段颖等: "南瓜果皮颜色性状遗传与调控机制研究进展", 园艺学报, vol. 43, no. 9, pages 1743 - 1751 *
马海龙等: "南瓜属黄色果皮性状的种间转育及遗传分析", 植物遗传资源学报, vol. 21, no. 4, pages 930 - 937 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116497152A (zh) * 2023-06-19 2023-07-28 东北农业大学 一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用
CN116497152B (zh) * 2023-06-19 2023-09-29 东北农业大学 一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用
CN117487958A (zh) * 2024-01-02 2024-02-02 东北农业大学 一种与控制美洲南瓜无壳基因相关的分子标记及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114015796B (zh) 2023-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110117673B (zh) 甘蓝型油菜矮杆性状位点的分子标记及其应用
CN110295248B (zh) 用于检测大白菜蜡粉性状的kasp分子标记及其应用
CN109251995B (zh) 一种鉴定西瓜果皮底色的caps分子标记及其应用
CN114015796B (zh) 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用
CN114410818B (zh) 一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物及其应用
CN113881801B (zh) 一种美洲南瓜深绿茎性状紧密连锁的分子标记组合物及应用
CN111850157A (zh) 一种与大白菜花色相关的分子标记及其应用
CN107937397B (zh) 与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp分子标记及其获得方法和应用
CN110205396B (zh) 一种与黄瓜果实不规则条纹性状紧密连锁的snp标记及其应用
CN115852032A (zh) 与豇豆豆荚颜色相关的基因、kasp标记及其应用
CN111926098A (zh) 与茄子果色的上位性基因Y紧密连锁的InDel分子标记与应用
CN109609687B (zh) 用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用
CN112029886B (zh) 一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法
CN110607391A (zh) 一种与控制印度南瓜红果皮性状紧密连锁的分子标记、引物及应用
CN116103428B (zh) 一种与西瓜种子大小相关的dCAPS分子标记及其应用
CN116949204A (zh) 用于检测西瓜耐盐性状的snp位点、基于该位点的分子标记及应用
CN114480709B (zh) 检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用
CN111172317B (zh) 一种与芝麻开花期主效qtl位点紧密连锁的分子标记hsrc3911及其应用
CN112575101B (zh) 与西葫芦prsv-w病毒病抗性相关的分子标记及其应用
CN110527740B (zh) 一种与印度南瓜强雌基因紧密连锁的分子标记、引物及应用
CN111218445A (zh) 一种直立穗型粳稻品质改良的方法和分子标记
CN116904638B (zh) 与藜麦早雌性状连锁的kasp标记及应用
CN114622033B (zh) 黄瓜成熟果皮颜色性状连锁的一个snp标记及其应用
CN112342309B (zh) 棉花花基斑性状相关snp分子标记及其应用
CN111808981B (zh) 一种提高玉米单倍体雌穗育性恢复力的方法及其专用引物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant