CN112029886B - 一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法 - Google Patents
一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法。该方法对待鉴定wxha类低直链淀粉水稻品种后代群体移栽15～40天挂牌标记单株，提取标记单株叶片总DNA，用自主设计的wxha基因特异性引物wx‑JD进行PCR反应；用3％琼脂糖凝胶、GelStain染胶液、1×TAE buffer、160V～180v电泳60分钟，Bio‑Rad GeoDoc XR+凝胶成像系统拍照，依据电泳结果鉴定材料基因型，PCR产物分子量为101bp的是wxha类低直链淀粉水稻材料。本发明能快速、有效鉴别wxha类低直链淀粉水稻及其杂交组合后代的直链淀粉合成基因。
Description
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法。
背景技术
由于低直链淀粉优质软米的米饭质地柔软、富弹性、冷不回生，具有良好的食用价值和很高的经济价值，越来越受消费者和稻农喜爱，所以优质软米的选育已然受到世界各稻米生产国科研人员的高度重视。云南被称为“稻之王国”，具有丰富的软米种质，但主要是籼型软米，种植面积有限，而面积更广的粳稻区缺乏低直链淀粉的优质粳型软米。近二十年来，经过育种人员的不懈努力，育成了一系列的粳型低直链淀粉软米，包括银光、声农4号、楚粳39号、云粳37号、云粳46号、楚粳48号等品种或品系，填补了云南粳型软米的空白，深受省内外人民的喜爱，常年种植面积保持在五十多万亩。尤其是云粳37号，虽然还未通过审定，由于米质优异，目前在云南省内已有50余家种业和米业企业从事其生产和销售，其中不少份额销往北、上、广等大城市，部分零售价高达40元/公斤，促进了云南高原特色优质米产业的发展。然而传统育种方式费工费时，定向选育的准确性差，为加快云南优质粳型软米的更新换代，保障云南优质软米产业的持续发展，迫切需要开发上述软米的低直链淀粉分子标记，开展分子标记辅助选育(MAS)育种，加速定向选育优质粳型软米。另外，上述一些软米由于长期种植而又没有开展提纯复壮工作，其种性已严重退化，并出现严重混杂，开展提纯复壮和改良工作已迫在眉睫。我们研究发现银光、声农4号、楚粳39号、云粳37号、云粳46号、楚粳48号的低直链淀粉性状主要受第6号染色体上的单基因Wx控制,对该基因进行克隆分析找到了等位变异位点wxha，并根据其碱基差异设计了一个特异引物鉴定该低直链淀粉基因。
大量研究表明水稻直链淀粉含量的遗传机制较为复杂，除受主效基因控制外，还易受微效基因和环境因素的影响，因此对直链淀粉含量性状改良采用常规育种手段受限较大、耗时长、成本高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种性能可靠的水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法，结合了分子生物学手段从基因水平上对软米品种银光、声农4号、楚粳39号、云粳37号、云粳46号、楚粳48号的低直链淀粉基因wxha进行准确、快速、高效的鉴定。
本发明的技术方案是这样实现的：一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法，包括以下步骤：
S1、在待鉴定的水稻品种云粳37号后代群体材料移栽15～40天挂牌标记单株，提取标记单株叶片总DNA；
S2、用低直链淀粉基因wxha的特异性引物wx-JD进行PCR扩增反应，所述低直链淀粉基因wxha特异性引物wx-JD由上游引物wx-JD-F和下游引物wx-JD-R组成，所述上游引物wx-JD-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物wx-JD-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
S3、PCR扩增反应产物加入6×DNA Loading Bffer后上样5μl，用3％的琼脂糖凝胶，加入GelStain染胶液，1×TAE buffer，160V～180V电泳50分钟；
S4、Bio-Rad GeoDoc XR+凝胶成像系统拍照，检测PCR扩增产物及电泳结果；用步骤S2所述wxha基因特异性引物wx-JD经PCR扩增后，基因型为wxha/wxha的PCR产物分子量为101bp；基因型为Wxb/Wxb的PCR产物分子量为112bp；基因型为Wxmq/Wxmq的PCR产物分子量为112bp；基因型为wx/wx(糯米)的PCR产物分子量为135bp；杂合体基因型为wxha/wx的PCR产物分子量为101bp和135bp；杂合体基因型为Wxb/wxha的PCR产物分子量为101bp和112bp；杂合体基因型为Wxmq/wxha的PCR产物分子量为101bp和112bp；
S5、PCR扩增产物分子量为101bp的水稻材料为wxha类低直链淀粉水稻材料。
根据技术方案1所述的一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法，步骤S2所述用低直链淀粉基因wxha特异性引物wx-JD进行PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序为：
反应液组成：反应总体积为10μl，其中10×EasyTaq Buffer 1μl，2.5mM dNTPs0.6μl，上游引物wx-JD-F 0.2μl，50μmol下游引物wx-JD-R 0.2μl，EasyTaq DNAPolymerase 0.15μl，100ng/μl模板DNA 0.6μl，ddH2O 7.25μl；
扩增程序：94℃预变性5min；从94℃变性30s，58℃退火30s至72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。
本发明解决了背景技术中存在的缺陷,与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明利用了分子遗传学及分子生物学技术，结合低直链淀粉基因wxha与其它直链淀粉合成等位基因的序列差异，设计特异性引物wx-JD，能快速准确鉴定低直链淀粉基因wxha及其它直链淀粉合成的等位基因,为直链淀粉含量性状的选择提供了有力的工具。具体表现为：
1、用低直链淀粉基因wxha特异性引物wx-JD鉴别，检测的是直链淀粉合成基因自身的序列差异，鉴别准确率为100％，苗期可开始筛选，用时不超过3天，加速wxha类软米的复壮和改良，缩短育种年限，是一种快速有效选择鉴定的方法。
2、分析过程只需提取DNA、PCR反应和电泳即可，鉴别方法简单易行，不受季节及材料数量的限制，而且鉴别方法经济，鉴定一个材料或个体仅需人民币约1.0元。
3、本发明方法能快速、有效鉴定wxha类软米及其后代，以及wxha类软米杂交组合材料的直链淀粉合成基因型，且能区分各种纯和、杂合植株的基因型。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是低直链淀粉基因wxha特异性引物wx-JD的上游引物wx-JD-F的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是低直链淀粉基因wxha特异性引物wx-JD的下游引物wx-JD-R的碱基序列。
说明书附图
图1是低直链淀粉含量调控基因wxha的特异性引物wx-JD对水稻材料叶片提取的总DNA经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳所得到的电泳图谱；
其中M表示DNA ladder marker；泳道1为中籼3037(直链淀粉合成基因型为Wxa)，泳道2为日本晴(直链淀粉合成基因型为Wxb)，泳道9为粳型软米南粳5055(直链淀粉合成基因型为Wxmq),三者PCR产物分子量均为112bp；泳道3—8分别为银光、声农4号、楚粳39号、云粳37号、云粳46号、楚粳48号(直链淀粉合成基因型为wxha)，其PCR产物分子量为101bp；泳道10为大白糯(直链淀粉合成基因型为wx)，其PCR产物分子量为135bp。泳道11-24为云粳37号与日本晴杂交的部分F2代材料，其中泳道12、16、19、21为wxha类低直链淀粉纯合材料，其PCR产物分子量为101bp；泳道14、17、24为非wxha类低直链淀粉纯合材料，其PCR产物分子量为112bp；泳道11、13、15、18、20、22、23为云粳37号/日本晴杂交后代杂合型材料的PCR扩增产物带型，其PCR产物分子量为101bp和112bp。泳道25-36为云粳37号与南粳5055杂交的部分F2代材料，其中泳道28、30、35为wxha类低直链淀粉纯合材料，其PCR产物分子量为101bp；泳道25、31、33为非wxha类低直链淀粉纯合材料，其PCR产物分子量为112bp；泳道26、27、29、32、34、36为云粳37号/南粳5055杂交后代杂合型材料的PCR扩增产物带型，其PCR产物分子量为101bp和112bp。泳道37-48为云粳37号与大白糯杂交的部分F2代材料，其中泳道39、40、45为wxha类低直链淀粉纯合材料，其PCR产物分子量为101bp；泳道41、42、48为非wxha类低直链淀粉纯合材料，其PCR产物分子量为135bp；泳道37、38、43、44、46、47为云粳37号/大白糯杂交后代杂合型材料的PCR扩增产物带型，其PCR产物分子量为101bp和135bp。
具体实施方式
具体实施方式是跟踪分析wxha类低直链淀粉品种云粳37号分别与普通粳稻日本晴、粳型软米南粳5055、糯米大白糯的3个杂交后代群体，对每个群体单株分别用糙米胚乳观察法及本发明分子鉴定法鉴定水稻材料的直链淀粉合成基因型，比较两种方法鉴别结果，考察本发明分子鉴别法的快速、经济和准确性。
实验水稻材料：日本晴、中籼3037、银光、声农4号、楚粳39号、云粳37号、云粳46号、楚粳48号、南粳5055和大白糯均为市售。以下各实施例无特殊说明的为常规方法。
实施例1
利用自主设计开发的低直链淀粉基因wxha特异引物对待鉴定的水稻材料：日本晴、中籼3037、银光、声农4号、楚粳39号、云粳37号、云粳46号、楚粳48号、南粳5055和大白糯十个亲本材料进行直链淀粉合成基因鉴定。上述十个待鉴定的水稻亲本材料的鉴定均按如下步骤进行：
(S1)在待鉴定的水稻材料移栽15天挂牌标记单株，用CTAB法提取标记单株叶片总DNA；
(S2)用低直链淀粉基因wxha特异性引物wx-JD进行PCR扩增反应，所述低直链淀粉基因wxha特异性引物wx-JD由上游引物wx-JD-F和下游引物wx-JD-R组成，所述上游引物wx-JD-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物wx-JD-R的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述PCR扩增反应的反应液组成及扩增程序为：
反应液组成：反应总体积为10μl，其中10×EasyTaq Buffer 1μl，2.5mM dNTPs0.6μl，上游引物wx-JD-F 0.2μl，50μmol下游引物wx-JD-R 0.2μl，EasyTaq DNAPolymerase 0.15μl，100ng/μl模板DNA 0.6μl，ddH2O 7.25μl；
扩增程序：94℃预变性5min；从94℃变性30s，58℃退火30s至72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。
(S3)PCR扩增反应产物加入6×DNA Loading Bffer后上样5μl，用3％的琼脂糖凝胶，加入GelStain染胶液，1×TAE buffer，160V～180V电泳50分钟；
(S4)Bio-Rad GeoDoc XR+凝胶成像系统拍照，检测PCR扩增产物及电泳结果；依据电泳结果鉴定材料基因型，电泳结果详见图1。根据电泳结果可知，日本晴、中籼3037和南粳5055的PCR产物为112bp，为非wxha类低直链淀粉材料；大白糯的PCR产物为135bp，亦为非wxha类低直链淀粉材料；银光，声农4号、楚粳39号、云粳37号、云粳46号、楚粳48号的PCR产物分子量为101bp，其基因型为纯和wxha类的低直链淀粉材料，即PCR扩增产物分子量为101bp的水稻基因型(-/-)材料为wxha类的低直链淀粉材料。实验表明：本发明方法能快速、有效鉴别wxha类低直链淀粉材料及其后代的直链淀粉合成基因。
实施例2
水稻材料来源于杂交组合“云粳37号/日本晴(胚乳透明，直链淀粉合成基因型为Wxb/Wxb)”的F2代群体，共计180个单株，分别用传统的糙米胚乳观察法和本发明特异引物wx-JD分子鉴定法，鉴定180个单株是否携带低直链淀粉控制基因wxha，比较两种方法鉴别结果，考察本发明分子鉴别法的可靠性。
糙米胚乳观察法：在水稻成熟期，分单株收获，充分晒干(水分在13％左右)，各取出十粒，将稻壳拨除，观察糙米胚乳的色泽及透明度，评定各单株是否携带低直链淀粉控制基因wxha，胚乳乳白不透明的材料为wxha类低直链淀粉单株。每次检测都设置双亲本的糙米为参照，采用三人分别评定。
本发明分子鉴定方法：除所用待鉴定材料为杂交组合“云粳37号/日本晴”的F2代群体，共计180个单株外，其余操作步骤与实施例1相同。
实验结果见表1和图1：PCR产物分子量为101bp的F2后代为wxha类的低直链淀粉材料，直链淀粉合成基因型为(wxha/wxha)；PCR产物分子量为112bp的F2后代为非wxha类的低直链淀粉材料，直链淀粉合成基因型为(Wxb/wxha)；PCR产物分子量同时出现101bp和112bp两条带型的F2后代为杂合型材料，直链淀粉合成基因型为(Wxb/wxha)。
由表1可看出，在组合“云粳37号/日本晴”的180个F2代单株中，糙米胚乳观察法检测发现其中43个单株为wxha类低直链淀粉材料，137株为非wxha类低直链淀粉材料；本发明分子鉴别发现44个单株为wxha类低直链淀粉材料，直链淀粉合成基因型为(wxha/wxha)；93株分子鉴别直链淀粉合成基因型为(Wxb/wxha)；43个单株为非wxha类低直链淀粉材料，其分子鉴别的直链淀粉合成基因型为(Wxb/Wxb))；糙米胚乳观察法无法区分出杂合类型材料。结果表明本发明分子鉴定与糙米胚乳观察法鉴定结果不完全一致，本发明分子鉴定准确率为100％，说明本发明分子鉴定与糙米胚乳观察法鉴定结果存在2.27％的误差率，实验表明：本发明方法能快速、有效鉴别wxha类低直链淀粉材料与普通粳稻(直链淀粉合成基因型为Wxb/Wxb))杂交组合后代的直链淀粉合成基因型，且本发明分子鉴别能区分显性纯和、隐性纯合、显性杂合三种植株的基因型。
表1供试组合“云粳37号/日本晴”的180个F2代单株直链淀粉状分析结果
注：误差率为糙米胚乳观察法的wxha类低直链淀粉植株数与分子标记鉴定的wxha类低直链淀粉植株数之差，除以分子标记鉴定的wxha类低直链淀粉植株数，再乘以100％。
实施例3
来源于杂交组合“云粳37号/南粳5055(胚乳浑浊，直链淀粉合成基因型为Wxmq/Wxmq)”杂交F2代群体，共220个单株，对220单株用传统的糙米胚乳观察法及本发明分子鉴定法鉴定材料的基因型，比较两种方法鉴别结果，考察本发明分子鉴别法的可靠性。
糙米胚乳观察法：除所用待鉴定材料为杂交组合“云粳37号/南粳5055”杂交F2代群体，共220个单株外，其余操作方法与实施例2中所述的糙米胚乳观察法相同。
本发明分子鉴定方法：除所用待鉴定材料为杂交组合“云粳37号/南粳5055”杂交F2代群体，共220个单株外，其余操作步骤与实施例1相同。
实验结果见表2和图1：PCR产物分子量为101bp的F2后代为wxha类的低直链淀粉材料，直链淀粉合成基因型为(wxha/wxha)；PCR产物分子量为112bp的F2后代为非wxha类的低直链淀粉材料，直链淀粉合成基因型为(Wxmq/Wxmq)；PCR产物分子量同时出现101bp和112bp两条带型的F2后代为杂合型材料，直链淀粉合成基因型为(Wxmq/wxha)。
由表2可看出，来源于“云粳37号/南粳5055”杂交F2群体的220个单株中，糙米胚乳观察法观察发现wxha类的低直链淀粉材料数为68份，152株为非wxha类低直链淀粉材料。分子鉴别发现wxha类低直链淀粉材料植株数为54，直链淀粉合成基因型为(wxha/wxha)，杂合型植株数为113，直链淀粉合成基因型为(Wxmq/wxha)，非wxha类低直链淀粉材料植株数为53，直链淀粉合成基因型为(Wxmq/Wxmq)。分子鉴定准确率为100％，表明分子鉴定与糙米胚乳观察法鉴定结果存在25.93％的误差率，且分子鉴别能区分显性纯和、隐性纯合、显性杂合三种植株的直链淀粉合成基因型，是较为准确的鉴定方法。本发明能快速、有效鉴wxha类低直链淀粉材料与Wxmq类粳型软米杂交组合后代的直链淀粉合成基因型。
表2供试组合“云粳37号/南粳5055”杂交F2代单株胚乳性状分析结果
注：误差率为糙米胚乳观察法的wxha类低直链淀粉植株数与分子标记鉴定的wxha类低直链淀粉植株数之差，除以分子标记鉴定的wxha类低直链淀粉植株数，再乘以100％。
实施例4
水稻材料来源于杂交组合“云粳37号/大白糯(胚乳乳白，直链淀粉合成基因型为wx/wx)”的F2代群体，共计260个单株，对260份F2代材料，用传统的糙米胚乳观察法及本发明分子鉴定法鉴定材料的基因型，比较两种方法鉴别结果，考察本发明分子鉴别法的可靠性。
糙米胚乳观察法：除所用待鉴定材料为杂交组合“云粳37号/大白糯”杂交F2代群体，共260个单株外，其余操作方法与实施例2中所述的糙米胚乳观察法相同。
本发明分子鉴定方法：除所用待鉴定材料为杂交组合“云粳37号/大白糯”的F2代群体，共计260个单株外，其余操作步骤与实施例1相同。
实验结果见表3和图1：PCR产物分子量为101bp的F2后代为wxha类的低直链淀粉材料，直链淀粉合成基因型为(wxha/wxha)；PCR产物分子量为135bp的F2后代为非wxha类的低直链淀粉材料，直链淀粉合成基因型为(wx/wx)；PCR产物分子量同时出现101bp和135bp两条带型的F2后代为杂合型材料，直链淀粉合成基因型为(wxha/wx)。
由表3可看出，对“云粳37号/大白糯”260份F2材料进行糙米胚乳观察，发现wxha类的低直链淀粉材料数为112份，148株为非wxha类低直链淀粉材料。分子鉴别发现wxha类低直链淀粉材料植株数为66，直链淀粉合成基因型为(wxha/wxha)，杂合型植株数为129，直链淀粉合成基因型为(wxha/wx)，非wxha类低直链淀粉材料植株数为65，直链淀粉合成基因型为(wx/wx)。本发明分子鉴定准确率为100％，表明：本发明分子鉴定与糙米胚乳观察法鉴定wxha类低直链淀粉材料的结果存在69.70％的误差率，本发明方法能快速、有效鉴别wxha类低直链淀粉材料与糯米杂交组合后代的直链淀粉合成基因型，且本发明分子鉴别能区分显性纯和、隐性纯合、显性杂合三种植株的基因型。
表3供试组合“云粳37号/大白糯”杂交F2单株的胚乳性状分析结果
注：误差率为糙米胚乳观察法的wxha类低直链淀粉植株数与分子标记鉴定的wxha类低直链淀粉植株数之差，除以分子标记鉴定的wxha类低直链淀粉植株数，再乘以100％。
表4实施例2-4不同鉴定方法的比较
由表1～表4可看出，用本发明wx-JD-F和wx-JD-R为引物鉴定wxha类低直链淀粉材料及其与普通粳稻、粳型软米、糯米杂交后代的直链淀粉合成基因型时，出现大小为101bp带型的材料是wxha类低直链淀粉材料；出现大小为112bp带型的材料是普通粳稻或粳型软米，为非wxha类低直链淀粉材料；出现135bp带型的材料是糯米；同时出现101bp带型和112bp带型的材料是杂合型(+/-)，不表现wxha类低直链淀粉性状；同时出现101bp带型和135bp带型的材料也是杂合型(+/-)，表现出wxha类低直链淀粉性状，其鉴定准确率为100％。
本发明方法能快速、有效鉴别wxha类低直链淀粉材料及其后代品种、wxha类低直链淀粉材料杂交组合材料的直链淀粉基因型，且本发明分子鉴定方法成本低，所需时间短，可明显缩短育种进程。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南省农业科学院粮食作物研究所
<120> 一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza Sativa L .)
<400> 1
tcgctgctcc gccacgggtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza Sativa L .)
<400> 2
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Claims (3)
1.一种水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、在待鉴定的wxha类低直链淀粉水稻品种后代群体移栽15～40天挂牌标记单株，提取标记单株叶片总DNA；
S2、用低直链淀粉含量调控基因wxha特异性引物wx-JD进行PCR扩增反应，所述低直链淀粉含量调控基因wxha特异性引物wx-JD由上游引物wx-JD-F和下游引物wx-JD-R组成，所述上游引物wx-JD-F的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物wx-JD-R的碱基序列如SEQ IDNO：2所示；
S3、PCR扩增反应产物加入6×DNA Loading Buffer后上样5μl，用3％的琼脂糖凝胶，加入GelStain染胶液，1×TAE buffer，160V～180V电泳60分钟；
S4、Bio-Rad GeoDoc XR+凝胶成像系统拍照，检测PCR扩增产物及电泳结果；
S5、PCR扩增产物分子量为101bp的材料为wxha类低直链淀粉水稻材料。
2.根据权利要求1所述的水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法，其特征在于，所述步骤S2中，PCR扩增反应的反应液组成为：
反应液组成：反应总体积为10μl，其中10×EasyTaq Buffer 1μl，2.5mM dNTPs 0.6μl，上游引物wx-JD-F 0.2μl，50μmol下游引物wx-JD-R 0.2μl，EasyTaq DNA Polymerase 0.15μl，100ng/μl模板DNA 0.6μl，ddH2O 7.25μl。
3.根据权利要求1所述的水稻低直链淀粉含量调控基因的单引物分子鉴定方法，其特征在于，所述步骤S2中，PCR扩增反应的扩增程序为：
扩增程序：94℃预变性5min；从94℃变性30s，58℃退火30s至72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。
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