KR101822995B1 - 쥬빌리계 수박 호피 무늬 형질 선발용 dna 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 쥬빌리계 수박 호피 무늬 형질 선발용 DNA 마커에 관한 것으로서, 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 AT14-900 DNA 마커 및 서열번호 2로 표시되는 wsbin6-11 DNA 마커 중 어느 하나 이상의 DNA 마커로 이루어진 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 마커를 제공한다. 또한, 상기 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별 키트 및 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별 방법을 제공한다. 이러한 DNA 마커를 이용하여 쥬빌리계 호피무늬 품종을 매우 신속하고 정확하게 육성함으로써 종자회사의 육종프로그램에 크게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

쥬빌리계 수박 호피 무늬 형질 선발용 DNA 마커{DNA marker for selecting Jubilee-type stripe pattern of watermelon}
본 발명은 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 마커에 대한 것이다.
수박[Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai]은 건생식물종 Citrullus Schrad. Ex Eckl. & Zeyh. (2n = 2x = 22)에 속하는데, 아프리카에 존재하고, 고대 세계 열대 지역에서 성장한다. 수박(C. lanatus var. lanatus)은 세계적으로 가장 인기있는 과일 중 하나로서, 수분, 당, 풍미와, 라이코펜(lycopene), 시트룰린(citrullin) 및 아르기닌(arginine)과 같은 많은 영양소를 함유하고 있다. 수박의 세계적인 순생산량은 1억 290만톤으로 추정되며, 아시아 대륙이 가장 많고(생산량의 89.36%), 다음으로 북미(5.89%), 유럽(5.49%), 아프리카(5.13%) 및 오세아니아(0.14%)의 순서이다(http://www.fao.org).
수박의 다양성은 과형, 과일 크기, 과피 무늬, 과육색, 종자 크기 및 종자 표면 색깔 등 다른 형태학적 특성들을 기초로 분류될 수 있다. 나라 및 지리학적 위치에 따라 다른 소비자들에 의해 다양한 수박 형질들이 선호되고 있다. 크림슨-타입(Crimson-type)의 씨 없는 품종은 USA 및 유럽에서 인기가 있고, 작은 크기의 아이스-박스-타입(ice-box-type) 과일은 동남아시아에서, 쥬빌리-타입(Jubilee-type)의 원형과는 중국에서, 쥬빌리-타입(Jubilee-type)의 장타원형 과일은 한국에서 인기가 있다. 최근 고함량의 시트룰린(citrullin), β-카로틴(β-carotene) 및 라이코펜(lycopene)을 가지고, 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 가진 품종의 수요가 증가하고 있다. 또한, 씨가 적고, 다양한 과육색을 띄며, 과육이 단단한 신선-절단(fresh-cut) 마켓 수박에 대한 수요가 증가하고 있다. 분자 마커들을 활용한 육종 프로그램이 상기 특성들의 효과적인 유전자이입을 촉진하여, 종자 시장 수요를 만족시킬 수 있는 우수한 수박 품종을 개발할 수 있다.
수박 품종 개량 프로그램에서 과피 무늬는 중요한 형질이다. 과피 타입은 과피 배경색(밝음에서 어두움) 및 전면 줄무늬 패턴(굵음에서 얇음)에 따라 분류된다. 전면 줄무늬 패턴들은 다양하고, 국제식물신품종보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants; UPOV, http://www.upov.int)에 잘 나타나있다. 과피 무늬는 패턴(단색, 나뭇결 무늬, 두 가지 색 또는 대리석 무늬), 두께(매우 좁음에서 매우 넓음), 뚜렷함(눈에 잘 띄지 않음에서 매우 뚜렷함) 및 가장자리(확산, 중간 또는 선명)에 따라 달라질 수 있다. Weetman에 의한 연구에서 'China 23'(어두운 녹색 줄무늬 및 중간 녹색 그물망 배경) 및 'Japan 6'(밝은 녹색 배경에 눈에 잘 띄지 않고 가는 줄무늬) 사이의 교배에서 유래한 유전적 개체군을 사용하였고, 그물망의 과피 및 어두운 줄무늬는 두 개의 독립적인 유전자에 의해 조절된다는 것을 확인하였다. 추가적인 연구에서는 다른 줄무늬 과피 특성도 유전에 의해 결정되는 것으로 나타났다. 더구나, 과피 줄무늬 타입과 강하게 연관된 DNA 마커들은 분자마커이용선발(marker-assisted selection; MAS)에 유용하게 사용될 수 있는데, 이는 표적화된 마커 유전자형을 기초로 과피 무늬를 가진 식물을 선택함으로써 품종 개량 공정을 강화시킬 수 있다. 집단분리분석법(Bulked segregant analysis; BSA)은 특히 유전적 맵핑을 쉽게 적용할 수 없는 상황 하에서 표적 형질과 연관된 마커들을 선별하기 위한 효과적인 접근법이다. 수박에 있어서 과피 줄무늬 패턴의 MAS를 위해 공개적으로 구할 수 있는 분자 마커들은 보고되지 않았다.
한국등록특허 제10-0823692호(2008.04.14 공개)
본 발명의 목적은 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 마커 및 이를 이용한 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 wsbin6-11 DNA 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 SCAR 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커를 이용하여 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커를 이용하여 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별방법을 제공한다.
본 발명은 쥬빌리계 수박 호피 무늬 형질 선발용 DNA 마커에 관한 것으로서, 수박의 신품종 육성에 요구되는 호피 무늬 형질을 선발해 낼 수 있는 DNA 마커를 BSA 방법으로 개발하였다. 이러한 DNA 마커를 이용하여 쥬빌리계 호피무늬 품종을 매우 신속하고 정확하게 육성함으로써 종자회사의 육종프로그램에 크게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 'Arka Manik'(AM)×'TS34'(TS)로부터 유래한 130개의 F2 식물의 표현형 분류에 사용된 과피 전면의 줄무늬 패턴 사진이다. 줄무늬 패턴은 다음의 9개 카테고리로 분류되었다: 1) 'AM'의 줄무늬 패턴(크림슨-타입, 넓은 너비의 밝은 녹색 줄무늬 및 확산된 가장자리); 2) F1의 줄무늬 패턴('AM' 및 'TS'의 줄무늬 패턴이 동시발현); 3) 'TS'의 줄무늬 패턴(쥬빌리-타입, 중간 너비의 어두운 녹색 및 뚜렷한 가장자리); 및 4) 내지 9) 'AM', 'TS' 또는 F1 어디에도 속하지 않는 다양한 줄무늬 패턴.
도 2는 줄무늬 패턴에 대한 임의증폭다형성 DNA-집단분리분석(random amplified polymorphic DNA-bulked segregant analysis; RAPD-BSA) 결과를 나타내는 아가로스 젤 전기영동 사진을 나타낸다. 크림슨-타입(Crimson-type; BK1) 및 쥬빌리-타입(Jubilee-type; BK2) 줄무늬 패턴 분석을 위해 증폭된 집단 DNA 샘플 간의 PCR 밴드 (AT14-900) 다형성 부위는 화살표로 표시하였다. BK1, 크림슨-타입 줄무늬 패턴(표현형 클래스 1)을 나타내는 6개 F2 식물의 모아진 DNA 샘플; BK2, 쥬빌리-타입 줄무늬 패턴(표현형 클래스 3)을 나타내는 10개 F2 식물의 모아진 DNA 샘플; M, 100 bp 사이즈 마커.
도 3은 19개의 분자 마커들로 구성된 유전체 6의 유전 연관 지도 및 AT14-900의 DNA 서열(점)에 대한 대략의 유전체 위치를 나타냈다. AT14-900의 유전체 위치 및 2 개의 측면 마커 wsbin6-10 및 wsbin6-11를 염기쌍(base pair; bp)로 나타냈다.
이에, 본 발명자들은 전형적인 크림슨(Crimson)- 또는 쥬빌리(Jubilee)-타입 수박 품종에 있어서, 다양한 줄무늬 패턴의 유전에 대해 연구하였다. BSA 방법을 이용하여, 줄무늬 패턴을 선별하기 위한 분자 마커들을 개발하였고, 수박 유전체(genome) 및 유전 연관 지도(genetic linkage map)를 이용하여 이들의 유전체 상 위치를 확인하였다.
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 wsbin6-11 DNA 마커를 제공한다.
삭제
상세하게는, 상기 서열번호 2로 표시되는 wsbin6-11 DNA 마커는 서열-특징화된 증폭 다형성(sequence-characterized amplified polymorphism; SCAR) 마커이다.
본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
본 발명에 있어서, "분자 마커" 또는 "DNA 마커"는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 분자 마커 또는 DNA 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로, 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite)나 유전자 염기 서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, 임의증폭다형성 DNA(random amplified polymorphic DNA; RAPD) 방법은 대개 9 내지 11 bp(base pair)의 짧은 임의의 프라이머 (random primer)를 이용하여 2개의 염기서열에 의해 맞추어지는 유전체 부위만을 증폭시키게 된다. 다양한 분석방법 중에 분석이 쉽고, 간편하기 때문에 가장 보편적으로 이용되고 있다. PCR 산물들을 아가로오스 젤에 전기영동하여 단편들의 형태를 분석하기 때문에 매우 간단하나, 이를 이용하여 품종 육종의 선발 표지로 바로 이용하는 것은 효율성과 정확성 측면에서 어려움이 있으므로 이러한 문제를 해결하기 위하여 RAPD 분석 결과에서 생성된 특이 DNA 밴드들을 클로닝(Cloning)과 서열분석(squencing) 과정을 거쳐 새로운 SCAR 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하는 방법을 이용한다.
본 발명에 있어서, 서열-특징화된 증폭 다형성(sequence-characterized amplified polymorphism; SCAR)은 RAPD 마커 밴드의 염기서열을 분석하여 제작한 것이며, ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 비해 증폭 환경에 비교적 둔감하고, 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종구별용 분자 마커로 인식되고 있다. 즉, 보다 정확하고 세밀한 프라이머로 사용이 가능하다.
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본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 SCAR 프라이머 세트를 제공한다. 서열번호 4 내지 서열번호 7의 프라이머는 표 1에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 SCAR 프라이머 세트를 포함하는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 키트를 제공한다.
상기의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2+와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
본 발명은 (1) 수박에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 SCAR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별 방법을 제공한다.
수박에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 젤 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서,모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 식물 재료
인도에서 크림슨-타입(Crimson-type; CT)을 상업화한 방임 수분(open pollinated; OP) 품종 'Arka Manik'(AM)과 한국에서 개발된 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 근친교배주 'TS34'(TS)를 유전 연구 및 과피 전면 줄무늬-타입에 대한 DNA 마커 개발에 사용하였다. 'AM' 및 'TS'의 과피 줄무늬 패턴은 도 1에 나타냈다. 모계 모체로서 'AM'과 꽃가루 기증자로서 'TS'를 교배함으로써 F1 식물을 만들었다. F1 식물은 자가-수분되었고, F2 자손을 만들었다. 모든 교배 및 자손 생산은 2008년에서 2009년 사이에 한국 안성에 있는 NH Seed Co.의 온실에서 수행하였다.
한국에 있는 2개의 종자회사에서 제공된 100개의 근친교배주를 사용하여 MAS를 위한 마커들의 적용가능성을 확인하였다. 각 근친교배주의 과피 타입 및 DNA 추출을 위한 잎 샘플에 대한 표현형 정보는 종자회사들로부터 제공받았다.
2. 표현형 분석
F2 식물은 2012년 태국 Konken에 위치한 육종포장(breeding field)에서 키웠고, 130개의 F2 식물로부터 수확된 수박의 과피 줄무늬 타입을 조사하였다. 줄무늬 패턴은 다음의 9개 카테고리로 분류되었다(도 1): 클래스 1) 'AM'의 줄무늬 패턴(크림슨-타입: 넓은 너비의 밝은 녹색 줄무늬 및 확산된 가장자리); 클래스 2) F1의 줄무늬 패턴('AM' 및 'TS'의 줄무늬 패턴이 동시발현); 클래스 3) 'TS'의 줄무늬 패턴(쥬빌리-타입: 중간 너비의 어두운 녹색 및 뚜렷한 가장자리); 및 클래스 4) 내지 9) 'AM', 'TS' 또는 F1 자손 어디에도 속하지 않는 다양한 줄무늬 패턴. 각각의 수박은 상기 분류를 기초로 하여 점수화되었다. 수박은 오랜 기간의 기록 및 실험을 위해 사진을 찍어두었다. BSA를 위해, 'AM'(1) 또는 'TS'(3) 둘 중 하나의 줄무늬 패턴을 나타내는 F2 식물만 고려하였고, 다른 클래스들의 혼합된 패턴을 나타내는 수박은 배제하였다.
3. 집단분리분석법( Bulked segregant analysis ; BSA )
줄무늬 패턴과 강하게 연관된 분자 마커를 개발하기 위해서, 임의증폭다형성 DNA을 이용한 BSA(BSA using random amplified polymorphic DNA; BSA-RAPD)가 사용되었다. 줄무늬 패턴에 대한 자손 시험 결과를 기초로 하여, 크림슨-타입의 밝은 녹색 줄무늬를 나타내는 6개의 F2 식물 유래 DNA 샘플(클래스 1)을 분리하였고, 동량을 서로 혼합하였다(DNA sample ID: BK1). 쥬빌리-타입의 어두운 녹색 줄무늬를 나타내는 10개의 F2 식물(클래스 3)에 대해서도 동일한 방법을 수행하였다(DNA sample ID: BK2). 식물 유전체 DNA 추출은 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다(Kor. J. Hort. Sci. Technol. 2010, 28, 618-626).
집단화된 DNA 샘플인 BK1 및 BK2 간의 다형성을 확인하기 위해서 RAPDs를 수행하였다. RAPD 방법으로는, 이전의 연구에서 수박 DNA에 대해 성공적인 PCR 증폭을 나타낸 60개의 10-mer Operon primers가 선택되었고(Hort. Environ. Biotechnol. 2013, 54, 134-140), 이전에 보고된 방법에 따라 실험하였다(Kor. J. Hort. Sci. Technol. 2009, 27, 448-455).
4. 마커 개발
PCR 증폭물의 클로닝 및 서열분석을 위해서, GeneAll Gel SV kit (GeneAll, Deajon, Korea)을 이용하여 DNA 단편들을 아가로스 젤로부터 용출하였고, pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA)로 클로닝하였으며, ABI3730 capillary DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 염료-종결 방법(dye-termination method)에 의해 서열분석하였다. 클로닝 및 서열분석 방법에 대한 자세한 설명은 이전의 보고에 기재되어 있다(Kor. J. Hort. Sci. Technol. 2010, 28, 618-626). PCR 프라이머 디자인 및 서열 정렬은 각각 Primer3 (v2.0) 및 Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) software를 이용하여 수행하였다. 상동 유전자 확인을 위해서, NCBI BLASTN (version 2.2.29+) software (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 Blastn 검색을 수행하였다. BSA 유래 서열-특징화된 증폭 다형성(sequence-characterized amplified polymorphism; SCAR) 마커(AT14-900)의 유전체 위치를 확인하기 위해, 수박 참조 유전체 서열 (Cucurbit Genome Database, http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome)이 사용되었다. 종내 유전 연관 지도는 이웃하는 SCAR 마커들(wsbin6-10 및 wsbin6-11)의 확인을 위해 사용되었다.
5. 마커 평가
SCAR 마커들(wsbin6-10 및 wsbin6-11)의 유전자형 분석은 전체 부피 20㎕[20 ng 유전체 DNA, 0.3μM의 각각 정방향 및 역방향 프라이머, ×1 PCR buffer, 0.2 mM dNTPS 및 0.6 U of Taq polymerase (SolGent, Daejeon, Korea)]에서 PCR 증폭하여 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분으로 1회, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초(2 내지 10회 동안 0.5℃/회 감소하는 단계), 72℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 10회 반응시킨 후, 95℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 35회 수행하였다. 젤 전기영동은 트리스-아세테이트 EDTA(Tris-acetate EDTA; TAE)가 포함된 2.5% 아가로스 젤을 이용하여 120V에서 2시간 동안 수행한 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색하여 자외선 빛 하에서 가시화되었다.
< 실시예 1> 표현형 분석
과피의 전면 줄무늬 패턴 표현형을 조사하였다. 'AM' 수박은 CT 수박의 전형적인 특징인 확산된 넓은 가장자리를 가진 녹색(단색) 줄무늬를 나타냈다. 반면, 'TS' 수박은 JT 수박의 전형적인 특징인 뚜렷한 가장자리 및 중간 너비를 가진 어두운-녹색 줄무늬(단색 및 대리석 무늬)를 나타냈다. 'AM' 및 'TS'의 과피 표현형에 대한 자세한 정보는 도 1에 나타냈다. 'AM'×'TS' 유래 F1 식물의 수박은 CT 및 JT의 혼합 형태를 나타냈는데, 이는 줄무늬 패턴을 대표하는 유전자좌(gene loci)의 공우성(codominance) 효과가 가능하다는 것을 나타낸다(도 1). 줄무늬 패턴은 실험에 사용된 130개의 F2 식물들 사이에 달라졌다. 이들 중, 6개의 F2 식물은 뚜렷한 'AM'(CT) 패턴을 나타냈고, 11개의 F2 식물은 'TS'(JT) 패턴을 나타냈으며, 19개의 F2 식물은 F1 패턴을 나타낸 반면, 나머지 다른 94개의 F2 식물은 다양한 패턴을 나타냈다(도 1).
줄무늬 및 진한 녹색 과피의 유전에 대해 연구되었고, Weetman (1937) 및 Pool (1944)에 의해 3가지 대립 형질(G, g s , g)의 단일 유전자좌(locus) 모델이 보고되었다. 상기 모델에서, 어두운 녹색 과피 색깔의 G 대립 형질(allele)은 밝은 녹색 과피인 g 에 대하여 우성인데, 줄무늬를 생산하는 g s 는 g 에 대하여 우성인 반면, G 에 대해서는 열성이다. 즉, 어두운 녹색 과피 및 줄무늬 패턴 조절을 위해, 2개의 유전자좌가 강하게 연관되어 있다는 가설 또한 타당하다. 줄무늬 패턴과 관련된 g s 대립 형질은 회색(황녹색) 과피에 대해서도 우성인 것으로 Shimotsuma (1963)에 의해서 재발견되었다. 하지만, 크림슨-타입 및 쥬빌리-타입 줄무늬에 대한 대립성(allelism) 및 유전자 상호작용은 아직까지 보고된 적이 없다. 본 발명자들은 F2 자손 사이의 다양성과 관련하여 과피 줄무늬 패턴은 양적 형질이고 여러 유전자좌에 의해 조절된다는 것을 밝혀냈다.
< 실시예 2> 집단분리분석( Bulked segregant analysis ; BSA )
6개 및 11개 F2 식물의 각각 뚜렷한 CT 및 JT 줄무늬 패턴은 상기 형질과 관련된 마커를 개발하는 데 있어 BSA가 여전히 장점을 가진 가능성 있는 접근법이라는 것을 나타낸다. 줄무늬 패턴(CT vs. JT)을 나타내는 유전체 부위를 확인하기 위해서, RAPD를 이용한 BSA를 수행하였다. BSA를 위해, CT 줄무늬를 가진 6개의 F2 식물로부터 얻은 유전체 DNA 샘플을 모았다(BK1). JT 줄무늬를 가진 10개의 F2 식물에 대해서도 동일한 방법을 수행하였다(BK2). 모아진 DNA 샘플들은 60개의 RAPD 프라이머를 이용하여 유전자형을 분석하였고, RAPD 프라이머 AT14(5'-GTGCCGCCAC-3'; 서열번호 3)에 의해 증폭된 약 900 bp 밴드(AT14-900)가 상기 2개의 모아진 DNA 샘플 간의 확실한 다형성 부위라는 것을 확인하였다(도 2). AT14-900 다형성 RAPD 밴드는 CT (BK1)의 집단 DNA 샘플에서는 나타났으나, JT (BK2)의 집단 DNA 샘플에서는 보이지 않았다. BSA에 사용된 각각 개별적인 식물을 포함하는 130개의 F2 식물에 대해서 AT14 프라이머를 시험하였다. AT14-900은 클래스 1 ('AM') 또는 클래스 2 (F1)로 분류된 25개의 F2 식물 중 24개에서 나타났지만, 클래스 3 ('TS')으로 분류된 11개의 F2 식물 모두에 대해서는 나타나지 않았다. 클래스 4 내지 9의 F2 식물에 대해서는 19개의 F2 식물에서 AT14-900이 나타나지 않았고, 75개의 F2 식물에서 AT14-900이 나타났다. 클래스 7(좀 더 밝은 녹색을 제외하고는 'TS'[JT]의 줄무늬 패턴과 유사)로 분류된 13개의 F2 식물 중에서 11개가 'TS' 마커 타입인 AT14-900를 나타내지 않았다. 과피 배경색에 대한 관찰 결과, 클래스 7의 밝은 녹색 줄무늬 특성은 'TS'와 비교시 좀 더 밝은 과피 배경색으로 인한 것으로 밝혀졌다. 또한, 클래스 7 수박은 마커 타입 및 줄무늬 패턴이 71.0% 일치하여 JT에 속하는 것으로 추정된다.
< 실시예 3> 마커 개발
AT14-900 마커는 클로닝되었고 서열분석되었다. 925 bp 부위가 Cucumis melo (XM008466282.1) 및 Cucumis sativus (XM004170202.1)의 류신(leucine)이 다수 반복되는 단백질의 mRNA 서열과 상당히 일치하는 것으로 나타났다. 상기 서열은 수박 (97103)의 참고 유전체와 비교하였고, AT14-900 마커의 925 bp와 97.8% 서열 상동성을 나타내는 유전체 부위는 염색체 6 상의 26246077 내지 26246993 bp의 위치인 것으로 확인되었다(도 3). 공우성(codominant) SCAR 마커를 개발하기 위해서, AT14 10-mer 프라이머 서열로부터 확장된 프라이머 세트를 디자인하였고, 'TS34'의 PCR 증폭을 위해 사용하였다(표 1). PCR 증폭물은 클로닝되었고 서열분석되었다. 하지만 AT14-900으로 서열 비교한 결과, 다형성 SCAR 마커를 개발하기 위한 서열 변이는 불충분한 것으로 나타났다.
Marker
　		 Primer sequence (5'-3')
　
　		 Tm
(℃)		 Product size (bp)a
AM TS
AT14-900
(서열번호 1)
 For: GTGCCGCACTCCTTC (서열번호 4) 55 925 925
Rev: GTGCCGCACTTAGGT (서열번호 5)
wsbin6-10
 For: GCTCACCTTCACCTTTCATCA (서열번호 8) 58 263 257
Rev: ATGCCGAGAAGAGACCAAGA (서열번호 9)
wsbin6-11
(서열번호 2)		 For: GGTGAAAACTGGGATGGAGA (서열번호 6) 58 440 452
Rev: CATTTTGAGGGTGCATTGTG (서열번호 7)
aAM, 'Arka Manik'; TS, 'TS34'
더 신속한 마커 개발을 위해서, 본 발명자들은 'AM'×'TS'의 F2 개체군 유래 유전 연관 지도를 사용하였다. 이러한 종내 유전자 지도는 해당 염색체 번호가 부여된 15개의 연관군으로 구성된다. 상기 지도 내 대부분의 마커들은 수박 참고 유전체 서열을 기반으로 물리적 위치가 밝혀진 수박 ESTs 유래 CAPS 및 SCAR이었고, AT14-900 부위와 가깝게 연관된 마커들을 쉽게 확인할 수 있었다. 수박 참고 유전체 서열의 wsbin6-10 및 wsbin6-11 사이에 AT14-900가 위치하였는데, 상기 2개의 SCARs로부터 각각 221 kb 및 71 kb의 거리에 위치하였다. wsbin6-10 및 wsbin6-11 사이의 유전적 거리는 35.7 cM이다(도 3). wsbin6-10 및 wsbin6-11의 공우성 SCARs(표 1)은 'AM' 및 'TS'에서 모두 다형성을 나타냈고, 모든 F2 식물에서 성공적으로 유전자형이 분석되었다(표 3). F2 에서 마커 유전자형의 빈도는 표 2에 나타냈다. 특히, wsbin6-11에 있어서는 클래스 3 및 7로 분류된 24개의 F2 식물['TS'(JT) 줄무늬 패턴]에서 마커 유전자형 A('TS' 대립 형질과 동형 접합성)를 나타냈고, 클래스 2의 19개 F2 식물(F1 줄무늬 패턴) 모두는 마커 유전자형 H(이형접합성)를 나타냈다(표 3). 하지만, 마커 유전자형 및 'AM' (CT)의 줄무늬 패턴 사이의 유의적 차이는 없는 것으로 관찰되었다. F2 개체군 유전자형은 wsbin6-11이 'TS'의 쥬빌리-타입(JT) 줄무늬 패턴과 강하게 연관되어 있다는 것을 명백하게 나타냈고, 상기 형질을 선택하기 위한 공우성 마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
Marker Genotypea No. of F2
Phenotypic classb(no.of F2) Total no. of F2
1(6) 2(19) 3(11) 4(9) 5(19) 6(21) 7(13) 8(26) 9(6) 130
wsbin6-10 A 3 2 0 7 9 3 0 9 2 35
T 0 3 10 1 1 6 6 3 2 32
H 3 14 1 1 9 12 7 14 2 63
wsbin6-11 A 2 0 0 8 15 1 0 0 0 26
T 0 0 11 0 1 0 13 0 0 25
H 4 19 0 1 3 20 0 26 6 79
aA, 'AM' 동형접합성; T, 'TS' 동형접합성; H, 이형접합성
b1, 'AM' 줄무늬 패턴; 2, F1 줄무늬 패턴; 3, 'TS' 줄무늬 패턴; 4~9, 부모 및 F1 어디에도 속하지 않는 줄무늬패턴. 각 표현형 클래스에 대한 이미지는 도 1 참조.
표 내의 굵은 글씨체는 'TS34'의 쥬빌리-타입 줄무늬 패턴 및 SCARs과의 연관성을 나타내는 F2 식물을 표시한 것이다.
EN Line Phenotype classa Marker genotypeb
AT14-900 wsbin6-10 wsbin6-11
1 Arka Manik 1 1 A A
2 TS34 3 0 T T
3 F1 2 1 H H
4 F2-1 5 1 A A
5 F2-3 6 0 T H
6 F2-4 4 1 A A
7 F2-11 4 1 H A
8 F2-13 4 0 T A
9 F2-15 6 0 H H
10 F2-16 5 1 A T
11 F2-17 3 0 T T
12 F2-18 8 1 H H
13 F2-19 5 1 A A
14 F2-22 8 1 H H
15 F2-23 8 1 T H
16 F2-24 6 1 H H
17 F2-25 9 1 T H
18 F2-26 5 1 T A
19 F2-27 6 0 A H
20 F2-28 7 1 H T
21 F2-29 9 0 A H
22 F2-30 7 0 H T
23 F2-31 2 1 H H
24 F2-32 2 1 H H
25 F2-34 2 1 H H
26 F2-37 8 1 A H
27 F2-38 6 0 H H
28 F2-41 8 1 H H
29 F2-42 6 1 A A
30 F2-45 5 1 H H
31 F2-46 6 1 T H
32 F2-53 5 1 H A
33 F2-54 8 1 A H
34 F2-56 1 1 A H
35 F2-58 2 1 T H
36 F2-60 8 1 A H
37 F2-61 2 1 H H
38 F2-62 1 1 H A
39 F2-64 7 0 H T
40 F2-67 2 1 H H
41 F2-68 7 0 T T
42 F2-72 3 0 T T
43 F2-77 2 1 H H
44 F2-80 6 1 H H
45 F2-81 4 1 A H
46 F2-84 7 1 H H
47 F2-85 8 1 H H
48 F2-86 4 1 A A
49 F2-87 8 1 A H
50 F2-89 9 1 H H
51 F2-90 5 1 H A
52 F2-91 9 1 H H
53 F2-93 3 0 T T
54 F2-94 8 1 A H
55 F2-95 4 1 A A
56 F2-96 7 0 H T
57 F2-97 6 1 A H
58 F2-98 9 1 A H
59 F2-100 1 1 H H
60 F2-101 6 1 H H
61 F2-102 4 1 A A
62 F2-104 5 1 H A
63 F2-106 5 1 A A
64 F2-107 5 1 H A
65 F2-108 5 1 A A
66 F2-110 8 1 T H
67 F2-111 8 1 H H
68 F2-113 8 1 H H
69 F2-114 5 1 A A
70 F2-115 5 1 A A
71 F2-116 2 1 H H
72 F2-118 7 0 H T
73 F2-120 2 1 H H
74 F2-121 6 1 H H
75 F2-122 3 0 T T
76 F2-123 1 1 A A
77 F2-125 7 0 T T
78 F2-126 8 1 T H
79 F2-128 8 1 A H
80 F2-129 5 1 A A
81 F2-130 6 1 H H
82 F2-131 2 1 A H
83 F2-132 6 1 T H
84 F2-133 6 1 T H
85 F2-135 9 1 T H
86 F2-137 8 1 H H
87 F2-139 7 0 T T
88 F2-142 5 1 H H
89 F2-143 8 1 H H
90 F2-144 6 1 H H
91 F2-145 5 1 H A
92 F2-146 8 1 A H
93 F2-147 8 0 A H
94 F2-148 6 1 H H
95 F2-149 3 0 T T
96 F2-150 3 0 T T
97 F2-151 2 0 H H
98 F2-152 6 0 T H
99 F2-153 3 0 T T
100 F2-154 7 0 T T
101 F2-155 6 1 A H
102 F2-156 7 0 T T
103 F2-158 3 0 T T
104 F2-159 7 0 T T
105 F2-160 7 0 H T
106 F2-161 2 1 H H
107 F2-163 6 1 T H
108 F2-164 2 1 T H
109 F2-165 2 1 H H
110 F2-169 8 1 H H
111 F2-171 2 1 H H
112 F2-172 8 1 A H
113 F2-173 2 1 H H
114 F2-174 1 1 H H
115 F2-175 2 1 H H
116 F2-176 4 1 A A
117 F2-177 6 1 H H
118 F2-178 2 1 A H
119 F2-179 4 1 A A
120 F2-181 6 1 H H
121 F2-183 8 1 H H
122 F2-184 8 1 H H
123 F2-185 2 1 T H
124 F2-186 1 1 A H
125 F2-187 8 1 H H
126 F2-188 5 1 A A
127 F2-189 5 1 H H
128 F2-190 3 0 T T
129 F2-191 8 1 H H
130 F2-192 8 1 H H
131 F2-195 3 0 H T
132 F2-197 5 1 H A
133 F2-199 3 0 T T
a줄무늬 패턴은 9개 클래스로 분류하였다: 1) 'AM' 줄무늬 패턴(크림슨-타입, 넓은 너비 및 확산된 가장자리를 가진 밝은 녹색 줄무늬); 2) F1의 줄무늬 패턴('AM' 및 'TS'의 줄무늬 패턴 동시발현); 3) 'TS' 줄무늬 패턴(쥬빌리-타입, 중간 너비 및 뚜렷한 가장자리를 가진 어두운 녹색); 및 4) 내지 9) 'AM', 'TS' 또는 F1 어디에도 속하지 않는 다양한 줄무늬 패턴.
bA, 'AM' 동형접합성; T, 'TS' 동형접합성; H, 이형접합성.
표 내의 굵은 글씨체는 쥬빌리-타입 줄무늬 패턴 및 'TS'의 wsbin6-11 마커 타입을 나타내는 F2 식물을 표시한 것이다.
< 실시예 4> 마커 유용성 평가
줄무늬 패턴의 MAS에 있어서 wsbin6-11의 효율성은 2개의 종자 회사(A 및 B)에 의해 제공된 전체 100개의 근친교배주를 사용하여 확인하였다. 상기 교배주는 둥글거나 타원형의 수박 모양을 가지고 있고, 어두운 녹색(dark green; DG) 또는 녹색(green; G) 표면을 가진 비-줄무늬(non-striped; NS), 크림슨-타입(Crimson-type; CT) 또는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 줄무늬 패턴과 같은 다양한 과피 패턴을 가지고 있다. A 회사로부터 받은 교배주에는 20개의 JT 줄무늬 패턴이 포함되었는데, 이 중 18개는 wsbin6-11 마커 유전자형 (TT)('TS' 동형접합성)을 나타냈다. B회사에 대해서는 JT 줄무늬 패턴 16개의 교배주가 모두 TT 유전자형을 나타냈다. 하지만, NS 및 CT와 같은 다른 표현형은 wsbin6-11에 의해 구별되지 않았는데, 이는 상기 마커가 다른 여러 과피 전면 무늬 및 배경 타입으로부터 JT 줄무늬 패턴을 선택하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
결론적으로, JT 및 CT 사이의 교배에서 유래한 유전적 분리집단에서 과피 줄무늬 패턴 차이는 여러 유전자좌에 의해 조절될 수 있다는 것을 나타낸다. 수박 염색체 6 상에 위치하고, JT 줄무늬 패턴과 강하게 연관되어 있는 wsbin6-11 SCAR 마커는 향후 수박 줄무늬와 관련된 유전자를 동정하는 데에도 사용될 수 있다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> DNA marker for selecting Jubilee-type stripe pattern of watermelon <130> ADP-2014-0604 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 925 <212> DNA <213> watermelon <400> 1 gtgccgccac tccttccgat ccttcctcat cctcctcccc gaatcgtcca tgatatgcct 60 catctctccg acccccaagg ttttggcttc tatgactacc gctatatctg atgttgctca 120 gacccgatcc gtcctcaaaa ccccttgggg agagaccaga ccatgaggct gttgatactg 180 ccaaggctaa gctcgctgag gtagaagtta atttgtctgc caagcttcag gaaatcgtgc 240 tttcgtctag gccggcggat gtcgagttgc ttgagtggag ggcgcatctt gctgagaaag 300 agaacgagtg ccgccaggcg gcggataaag agaagcaggg gtataaggca attgtgcaac 360 tggatgagat gcacgaggcg tatgagaaga tgttgaagga agcagaggag aggttggtga 420 agatttacga gtcggctgag agagggctgc aggaggaaga acacttggat ccagttagcg 480 aggaggtcaa tgaggaggtt gcgaggattc ttcaggacgc gaatgagaag gaaatggatc 540 gaattagtct ctccggccga cgcttgcggt tcttgcctga aggatttgga cgcattcggg 600 gattggttgt gcttgatatc tccagcaatc aactacaggt tccattacaa tcaatccctt 660 cttcgcatag gtagtggaat caaaattact ctgattatac tagtgacgga ttaggaattc 720 ttgcgctctt gaaatgaact gtttcattat gaaatcaagt aggatagaaa tcttctttag 780 ttttatgagt acaggggatt tttgtagctt atctggagat ttgaatcttt gttagagacg 840 cttgattggt taacttacgg ctcatcatca ttactctcga aggagtctta aatcatactc 900 atgttttatc acctaagtgc ggcac 925 <210> 2 <211> 452 <212> DNA <213> watermelon <400> 2 ggtgaaaact gggatggaga ttgtgcagtt tatgccttca actcaggttt gatttccact 60 tcacttgaat ccccttttcc ccatttctct ctgataacca agcactttaa gctgaagaag 120 tttcaactca tgtatgtagg atctctttct aagttgaaac gaaaagaaag tcttgaagtt 180 ggattgagaa ctttggagtg tgagatatat accattgctc caatcagggt cagtacagct 240 catatatata tatatatata tatatatcag attttagtaa gttatgaata tcatcacttc 300 aagactaata cttcatctaa attttacgta atcaggtttt cagcaacgac attcacttca 360 caccgatagg attgctcgat atgtataatt caggaggagc tattgaaact ctaagtcata 420 gtatggatct tacacaatgc accctcaaaa tg 452 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtgccgccac 10 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgccgcact ccttc 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtgccgcact taggt 15 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggtgaaaact gggatggaga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cattttgagg gtgcattgtg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctcaccttc acctttcatc a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgccgagaa gagaccaaga 20

Claims (8)

  1. 서열번호 2로 표시되는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 wsbin6-11 DNA 마커.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 wsbin6-11 DNA 마커는 서열-특징화된 증폭 다형성(sequence-characterized amplified polymorphism; SCAR) 마커인 것을 특징으로 하는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 wsbin6-11 DNA 마커.
  4. 삭제
  5. 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 SCAR 프라이머 세트.
  6. 제5항에 따른 SCAR 프라이머 세트를 포함하는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별용 키트.
  7. (1) 수박에서 DNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제5항에 따른 SCAR 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계는 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 쥬빌리-타입(Jubilee-type; JT) 호피무늬 수박 품종 판별 방법.


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