KR100823692B1 - 국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ｄｎａ마커 - Google Patents

국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ｄｎａ마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 86으로 표시된 43개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 마커, 상기 마커를 이용하여 수박 품종을 식별하는 방법, 및 상기 마커를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 개발된 43개의 염기서열에 기초한 DNA 마커는 한국 수박품종의 분자 유전학적 연구에 유용하게 사용될 것이며, 특정 품종의 구별이나 여러 가지 품종이나 유전자형 사이의 유전적 다양성 분석과 유사성 분석 및 수박의 주요 형태적 특성 분석에도 사용될 수 있을 것이다.
프라이머 세트, 수박 품종, 키트, SSR, SCAR, CAPS, 마커

Description

국내 수박 품종의 유연관계 분석과 품종구별을 위한 ＤＮＡ 마커{Sequence-based DNA markers for evaluation of phylogenetic relationships and cultivar identification in Korean watermelon varieties}
본 발명은 국내 수박 품종의 유연관계 분석을 위한 DNA 마커에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1 내지 86으로 표시된 43개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 마커, 상기 마커를 이용하여 수박 품종을 식별하는 방법, 및 상기 마커를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 키트에 관한 것이다.
Citrullus속은 박과에 속하며 상업적으로 중요한 Citrullus lanatus 와 세 가지 재래종 C. colocynthis Schrad, C. ecirrhosus Cogn., C. rehmii De Winter가 이 속에 포한된다. 재배종인 Citrullus lanatus는 남아프리카의 사막지역에서 유래하였다 (Bates and Robinson, 1995, Cucumber, melons, and watermelons: Cucumis and Citrullus (Cucrbitaceae). In: Smart J. and Simmonds NW. eds, Evolution of Crop Plants. Ed 2. Longman, London, pp. 89-96). 수박은 현재 세계적으로 주요 채소작물로 재배되고 있으며 전 세계 총 생산량은 토마토의 1/3로 과실채소의 재배 에 있어서 토마토에 이어 2위를 차지하고 있다 (2004년). 한국 수박의 재배면적은 대략 34,000 ha에 이르며 메론, 오이, 호박이 속해있는 박과 작물 중 가장 넓은 지역에서 재배되고 있다. 수박은 한국 전체의 채소 재배면적의 10%에서 재배되고 있으며 이는 고추, 배추, 무에 이어 4위를 차지하고 있다 (2001년). 수박에 대한 소비가 계속적으로 증가되고 있기 때문에 병저항성과 환경 스트레스에 적응력이 높고 고품질의 새로운 수박품종 개발이 매우 중요하다.
새로운 최상품 수박품종의 육성은 계통발생학적 유연관계를 바탕으로 유전적 다양성을 증가시킴으로써 가능해질 것이다. 품종 간 유전적 다양성과 F1 종자의 순도검정, 특정 품종의 구분은 일반적으로 과실의 표현형적 특징에 의해 결정된다. 수박의 표현형적 변이가 크더라도 isozyme 마커를 이용해 계통발생학적 분석을 한다면 isozyme 마커의 대부분이 단일형의 밴드 패턴을 보이기 때문에 여러 수박 품종들의 유전적 다양성이 좁은 것으로 보고되고 있다. 반면 RAPD와 같은 PCR방법에 기초한 DNA 마커는 유전적 다양성 분석에서 다수의 다형성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 AFLP와 RFLP와 같은 DNA 마커기술은 매우 복잡한 실험 과정 때문에 수박의 유사성 분석에 적용하기는 많은 어려움이 있는 것으로 알려져 있다.
식물 세포내에 존재하는 엽록체와 미토콘드리아 유전자는 Citrullus lanatus의 다형성 탐색을 위해 분석되고 있다. Dane과 Bakhtiyarova는 citron 타입에서 유래한 수박품종을 구분하기 위해 엽록체의 DNA 염기서열을 이용하여 2개의 PCR-RFLP 마커를 개발하였다. Levi와 Thomas는 20개의 엽록체 RFLP 마커와 10개의 미토콘드 리아 RFLP 마커를 이용하여 5개의 수박품종 사이의 다형성을 탐색하였다. SSR 마커는 식물 게놈에서 변이가 매우 많고, 다수의 대립유전자를 가지며, 어디에나 존재하고, 간단한 PCR 과정을 통해 쉽게 탐색할 수 있기 때문에 일반적으로 선호된다. SSR 마커와 ISSR 마커는 수박이나 박과 작물의 연관지도 작성이나 유전형질을 평가하기 위해 개발되었다. 그러나 유용하고 확실한 DNA 마커의 수가 제한적이므로 수박에서 SSR 마커를 이용한 분자 유전학적 접근에 어려움이 있다. 반면 메론에서는 신뢰할 만한 DNA 마커와 기능이 밝혀진 유전자, 농업적으로 유용한 형질들을 이용한 여러 개의 밀도 높은 연관지도가 작성되어왔다. 그러므로 유용한 메론 마커 시스템을 적용하여 수박의 유전 연구를 크게 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.
한국특허등록 제0652501호에는 금싸라기 계통 참외의 에프1 종자 순도검정방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 마커와는 상이하다.
본 발명에서는 메론과 수박에서 선행 보고된 SSR 마커로부터 다형성을 나타내고 재현성 있는 SSR 마커를 선발하고, AFLP 분석을 통해 신뢰성 있는 SCAR 마커와 CAPS 마커를 개발하여, 개발된 염기서열에 기초한 DNA 마커를 이용하여 26개의 수박 품종의 계통발생학적 유연관계를 분석하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 86으로 표시된 43개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커를 이용하여 수박 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명에서 개발된 43개의 염기서열에 기초한 DNA 마커는 한국 수박품종의 분자 유전학적 연구에 유용하게 사용될 것이며, 특정 품종의 선발이나 여러 가지 품종이나 유전자형 사이의 유전적 다양성 분석과 유사성 분석 및 수박의 주요 형태적 특성 분석에도 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 각 프라이머 세트가 정방향 프라이머의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트인 것을 특징으로 하는, 서열번호 1 내지 86으로 표시된 43개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 마커를 제공한다.
본 발명의 마커는 표 2에 기재된 서열번호 1 내지 86으로 표시된 43개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트로서, 상기 프라이머 세트는 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된다. 43개 쌍의 프라이머 세트는 SSR 마커, SCAR 마커 및 CAPS 마커로 이루어져 있으며, CAPS 마커의 경우에는 제한효소가 표시되어 있다 (표 2 참고). 각각의 프라이머 세트는 정방향 프라이머의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 말한다.
바람직하게는, 각각의 프라이머 세트는 정방향 프라이머의 서열 내의 16개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머의 서열 내의 16개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 말하며, 더욱 바람직하게는 각각의 프라이머 세트는 정방향 프라이머의 서열 내의 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머의 서열 내의 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 말하며, 더 더욱 바람직하게는 각각의 프라이머 세트는 정방향 프라이머의 서열 내의 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머의 서열 내의 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 말한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 마커에서, 상기 마커는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 SSR (simple sequence repeat) 마커;
서열번호 31 및 32의 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트, 서열번호 43 및 44의 프라이머 세트, 서열번호 45 및 46의 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트, 서열번호 49 및 50의 프라이머 세트, 서열번호 51 및 52의 프라이머 세트, 서열번호 53 및 54의 프라이머 세트, 서열번호 55 및 56의 프라이머 세트, 서열번호 57 및 58의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 SCAR (sequence characterized amplified region) 마커; 및
서열번호 59 및 60의 프라이머 세트, 서열번호 61 및 62의 프라이머 세트, 서열번호 63 및 64의 프라이머 세트, 서열번호 65 및 66의 프라이머 세트, 서열번호 67 및 68의 프라이머 세트, 서열번호 69 및 70의 프라이머 세트, 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트, 서열번호 73 및 74의 프라이머 세트, 서열번호 75 및 76의 프라이머 세트, 서열번호 77 및 78의 프라이머 세트, 서열번호 79 및 80의 프라이머 세트, 서열번호 81 및 82의 프라이머 세트, 서열번호 83 및 84의 프라이머 세트, 서열번호 85 및 86의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 포함할 수 있다.
본 발명의 마커는 SSR (simple sequence repeat) 마커, SCAR (sequence characterized amplified region) 마커 및 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커 중에서 각각 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상 또는 14개 이상을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 마커는 표 2에 기재된 서열번호 1 내지 86으로 표시된 43개 쌍의 모든 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 국내 수박 품종들의 계통발생학적 유연관계를 15개 SSR(simple sequence repeat) 마커와 14개 SCAR(sequence characterized amplified region) 마커, 14개 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 사용하여 유전적 유사성 계수에 의해 평가하였다. SSR 마커는 이전에 수박과 메론에서 보고되어진 SSR 마커를 바탕으로 현재 시판되고 있는 수박 F1 품종들에 대한 다형성 검정을 통해 선발하였다. SCAR 마커와 CAPS 마커는 BN4001과 BN4002 계통을 이용한 AFLP(Amplified-fragment length polymorphism) 분석을 통해 개발되었다. 총 1,440개의 프라이머 조합을 사용하여 AFLP 분석을 실행한 결과 105개의 다형성 단편들을 선발하였다. 이렇게 선발된 단편들의 염기서열을 분석하여 염기서열에 특이적인 프라이머를 합성하였고, 삽입(insertion)과 결손(deletion) 또는 제한효소 절단부위의 다형성(RFLP)에 의해 실험에 사용된 두 계통 사이에 뚜렷하게 다형성을 나타내는 27개의 프라이머 조합을 선발하였다. 모두 43개의 염기서열에 기초한 DNA 마커가 개발되었으며, 수박 품종에서 각 마커의 유용 정보값을 측정하기 위해 PIC(polymorphism information content) 분석을 실시하였다. SCAR 마커의 평균 PIC 값은 0.41로 SSR 마커와 유사하였다. 이 마커들을 이용하여 수박의 품종 계통발생학적 유연관계와 유전적 다양성을 평가하였다. 분석에 사용한 26개의 수박 품종은 계통발생학적으로 크게 두 그룹으로 구분되지만 이들 사이의 형태적, 생리적 특성과 특별한 상관관계를 보이지 않는다. 이들 26개 수박 품종의 유전적 유사성은 평균 66%로 나타났다. 본 발명에서 개발된 염기서열에 기초한 DNA 마커는 앞으로 수박의 품종 동정과 유전자원의 분류에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 마커에서, 상기 마커는 표 1에 기재된 26개 수박 품종을 식별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 수박 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 수박 시료는 표 1에 기재된 26개 수박 품종일 수 있다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수박 품종을 식별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 프라이머 세트가 SSR 마커 및 SCAR 마커로 구성되는 경우에는, 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로 구성되며, 제한효소는 필요 없게 된다. 그러나, 프라이머 세트가 CAPS 마커를 포함하는 경우에는 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 외에 제한효소를 필요로 한다. 즉, CAPS 마커는 증폭 반응을 수행한 후에, 해당하는 제한효소로 절단해야 증폭 산물을 구별할 수 있기 때문이다. 본 발명의 키트에서, 상기 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 수박 품종을 식별할 수 있으며, 바람직하게는 표 1에 기재된 26개 수박 품종을 식별할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
식물재료 및 방법
식물재료
국내 종자 시장에서 판매되고 있는 F1 수박 26개 품종과 농우바이오의 남부육종연구소에서 육성한 스피드꿀수박의 모계와 부계인 'BN4001'과 'BN4002' 계통을 실험재료로 사용하였다. 'BN4001'과 'BN4002' 계통의 표현형 특성은 하기 표와 같다.
Figure 112007079807989-pat00001
본 발명에 사용된 식물 재료와 과실의 표현형적 특징은 하기 표 1에 표시하였다. 식물 재료는 모두 Citrullus lanatus var. lanatus에 속하며, 한국에서 상업적으로 육종된 F1 품종과 계통이다. 모든 식물 재료는 비닐하우스에서 재배되었으며, 파종한지 4주된 식물체를 DNA 추출과 PCR 분석에 이용하였다.
표 1. 본 발명에 사용된 수박 품종 및 이의 표현형 특성
Figure 112007079807989-pat00002
a) R round, SO; short oblong, O; oblong
b) H; heavy (10> kg), M; middle (8 - 10 kg), L; light ( 8<kg)
c) LR; light red, R; red, DR;deep red
d) GS; green striped, DGS; dark green striped, LGS; light green striped
e) L; large (0.8> cm), M; middle (0.8-0.75 cm), S; small (0.75< cm)
f) G; gray, T; tan, BL; black, BR; brown, MB; mottled black, MG; mottled gray
g) E; fruits are matured less than 55 days after flowering, M; 55-60 days, L; more than 60 days
상기 표 1에서, 각 품종의 명칭은 하기와 같다: Speed (스피드꿀), SpeedP (스피드플러스), Star (스타꿀), GulBD (꿀보단), WooRi (우리꿀), SamBG (삼복꿀), JoSSB (조생삼복꿀), SamDG (삼동꿀), SeolBG (설복꿀), JoEG (조은꿀), KWCH (겨울천하), SemiG (세미꿀), InDG (인동꿀), MNDR (마니다라), MyGG (명가꿀), MiRG (미래꿀), JoCG (조춘꿀), DrmG (드림꿀), SaeRG (새론꿀), SaeCN (새천년), ChaSD (차세대), ChoGS (초고속꿀), HaeDG (해동꿀), DongBG (동방꿀), GoNKW (고농겨울), BaekMG (백마강).
전체 DNA 분리
DNA 추출은 선행 논문(Kang et al., 2001. Theor. Appl. Genet. 102(4): 531-539)을 참고로 하여 약간의 변형을 주어 수행하였다. 4주된 어린 식물체의 잎 0.1g을 1.5ml 튜브에 0.5ml 추출용액과 함께 넣고 곱게 갈아주었다. 각 튜브를 잘 흔들어주고 65℃에 한 시간 동안 세포를 용출시켰다. 5M 포타슘 아세테이트를 160㎕를 첨가하여 섞어준 후 5,800g로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 동량의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 5,800g로 2분간 원심분리하고 펠렛을 70% 에탄올을 이용하여 2회 세정하였다. DNA를 건조시켜 RNaseH가 첨가된 증류수로 녹여 PCR 반응에 사용하였다.
개발된 SSR 과 SCAR 마커 분석
SSR 마커를 선발하기위한 PCR 반응에는 DNA 주형(template)를 30ng 사용하였고, Prime Taq 중합효소 (GenetBio Co.)를 이용하여 20㎕에서 반응하였다. PCR 조건은 94℃에서 3분 동안 초기변성 과정을 거친 후, 94℃에서 30초, 52-60℃에서 30초, 72℃에서 1분의 합성반응을 35회 시킨 후, 72℃에서 5분 동안 마지막으로 안정적인 합성을 유도하였다. 모든 증폭 반응은 Mastercycler (Eppendorf Co, Germany)로 수행하였고, 증폭 산물은 EtBr이 첨가된 3% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다. PCR 반응에 사용된 프라이머의 최적 어닐링(annealing) 온도는 'Oligonucleotide properties Calculator'를 이용하여 계산하였고, 여러 온도에서 재현성 실험을 하였다. 수박에서 다형성 판별을 위한 SSR 마커의 선발을 위해 고정계통 'BN4001'과 'BN4002'을 이용하였다. 두 계통에서 다형성이 나타나지 않는 경우 스피드꿀, 스타꿀, 삼복꿀, 미래꿀 수박을 이용하여 SSR 마커를 선발하였다. 이때 4가지 수박품종에서 다형성 판별을 위해 PCR 증폭산물에 제한효소 NlaⅢ를 처리 하였다. 메론의 흰가루병 저항성 연관마커로 개발된 9개의 SCAR 마커도 수박의 다형성 판별에 사용하였으며 PCR 조건과 과정은 SSR 분석에서와 동일하게 실시하였다.
AFLP 분석을 통한 SCAR 마커의 개발
본 실험은 Vos에 의해 개발된 AFLP 기술(Vos et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 4407-4414)을 조금 변형하여 수행하였다. 고정계통 'BN4001'과 'BN4002'의 total DNA에 제한효소 EcoRⅠ과 XbaⅠ을 처리하여 37℃에서 2시간 절단하였다. 70℃에서 1분 처리하여 제한효소를 불활성화시킨 다음 10pmole 농도의 EcoRⅠ과 XbaⅠ 어댑터를 ligation 하였다. EcoRⅠ+C 와 XbaⅠ+A 프라이머 조합을 이용하여 선행 선발증폭을 실시한 산물을 1/50 희석한 다음 주형으로 이용하였고, 4개의 선발 염기서열을 가진 EcoRⅠ과 XbaⅠ 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 Ex Taq 중합효소 (Takara Co.)를 사용하여 20㎕에서 반응하였으며, 반응 조건은 보고된 논문을 참고하였다. PCR한 증폭 산물은 2% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였으며, 두 고정계통에서 다형성을 나타내는 단편은 겔에서 분리하여 염기서열 분석을 위해 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하였다. 분석된 염기서열을 바탕으로 특이적인 프라이머 조합을 합성하여 고정계통에서 다형성을 나타내는지 확인하였다. 두 계통 사이에서 다형성을 판별할 수 없는 경우에는 SSR 마커 선발에 사용한 4개의 수박 품종을 이용하여 다형성을 분석하였으며, 또한 PCR 산물들을 여러 가지 제한효소를 처리하여 다형성을 판별하였다.
DNA 마커의 정보값 측정
수박에서 다형성이 확인된 43개의 염기서열에 기초한 DNA 마커는 각 마커의 다형성 정도를 확인하기 위해 26개의 수박품종에서 분석되었다. 수박품종에 대한 마커의 대립유전자의 구성을 평가하였고, 마커의 다형성 정도를 확인을 위해 PIC 분석을 수행하였다.
Figure 112007079807989-pat00003
pi는 i번째 대립유전자의 빈도를 나타내고, n은 마커의 대립유전자의 전체 수를 나타낸다.
수박품종의 계통발생학적 유연관계 분석
전체 26개의 수박 F1 품종에 대한 계통발생학적 유연관계를 분석하기 위해, 마커에서 다형성을 보이는 단편 하나하나를 기본 단위로 설정하였고 다형성 단편의 유무에 따라 각각 '1'또는 '0'으로 값을 주어 기본 데이타를 구축하였다. 품종의 유사성은 Nei-Li 유사성 분석표를 사용하여 측정하였다. 유전적 유사성 = 2 Nab/(Na+Nb), Nab는 두 유전자형(a,b)이 공유하는 단편의 수를 나타내고, Na 와 Nb는 각 유전자형에서 분석된 총 단편의 수를 나타낸다. Dedrogram 작성에는 NTSYS-version2 프로그램을 사용하여 품종간 유전적인 유사성을 분석하였다.
실시예 1: 수박품종 구분을 위한 SSR 마커 및 SCAR 마커의 선발
두 종류의 SSR 마커를 수박 계통과 품종에 검정하여 선발하였다. 먼저 메론에서 개발된 94개의 SSR 마커를 사용하여 실험을 수행하였다. 메론의 SSR 마커 중 23개 마커가 수박에서 재현성 있고 선명하게 PCR 증폭되었으며, 이 중에서 CMSSR30 하나만이 수박 고정계통 사이에서 다형성을 보였다. 고정계통에서 다형성 빈도가 낮았기 때문에 23개 마커를 4개의 품종에서 PCR 증폭하여 제한효소 NlaⅢ를 처리하였지만 더 이상의 다형성을 찾을 수 없었고, 나머지 71개의 마커에서는 재현성 있는 밴드를 발견할 수 없었다.
박과의 이종간에는 단순반복염기서열(microsatellite)의 상동성은 낮은 것으로 보고되고 있다. Katzir는 박과의 하나의 종에서 개발된 SSR 마커를 다른 속 또는 종에 적용이 가능한지 평가하였다. 이들은 메론의 SSR 마커 5개와 오이의 SSR 마커 2개를 이용하여 3가지 수박의 유전자형을 분석했는데, 이 중 메론 SSR 마커 2개와 오이 SSR 마커 1개는 수박에서는 재현성 있는 결과를 나타내지 못했다. 이렇게 메론과 수박사이의 SSR 마커의 상동성이 낮은 이유는 SSR 프라이머가 DNA 염기서열의 완전한 상보성을 필요로 하기 때문이다.
다음으로 수박에서 개발된 73개의 SSR 마커를 검정하여 68개의 SSR 마커에서 재현성 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었다. 이 중 10개의 마커 (MCPI-03, 04, 07, 12, 28, 30, 31, 32, EST00675, Cgb4765)가 수박 고정계통에서 다형성을 나타냈으며, 4개의 마커 (MCPI-14, 37, AB006530.1, ASUW2)는 수박 4 품종에서 다형성을 보였다 (표 2). 수박에서 개발된 73개의 SSR 마커의 다형성이 선행 연구에서 확인되 었지만 한국 시판 수박품종에서는 마커의 다형성이 19%로 낮게 나타났다. 이런 결과는 각 실험에 사용된 실험 재료의 유전형질의 다양성이 다르기 때문으로 보인다. 유전형질의 유전적 다양성을 평가하는 것은 육종과정에서 가장 중요한 단계이다. Lee는 RAPD 마커를 사용하여 39개의 수박품종의 유전적 다양성을 분석하였다. 실험에 사용된 162개의 RAPD 마커 가운데 다형성을 나타내는 35개의 RAPD 마커를 선발하였다(21% 다형성). 본 발명에서 수박의 SSR 마커가 수박품종에서 비교적 낮은 수준(19%)의 다형성을 나타냈지만 이런 염기서열에 기초한 DNA 마커는 수박의 유전적 다양성 평가와 F1 종자의 순도검정, 연관지도 작성, 품종 판별에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
메론의 흰가루병 저항성과 연관된 9개의 SCAR 마커 중 'CPM6' 하나만이 두 고정계통에서 다형성을 나타냈다. 나머지 8개의 마커는 수박에서 PCR 증폭이 되지 않았으며 DNA 염기서열 분석을 통해 코딩 영역 (coding-region)에서 유래한 염기서열이 아니라는 것이 드러났다. 이렇게 8개의 SCAR 마커가 수박에서 PCR 증폭이 되지 않는 것은 메론과 수박 사이의 발현되지 않는 염기서열의 상동성 수준이 낮기 때문일 것으로 추정된다.
실시예 2: AFLP 를 이용한 SCAR 마커의 개발
신뢰성 높은 마커의 개발을 위해 AFLP를 수행하였다. 48개의 EcoRⅠ 프라이머와 30개의 XbaⅠ 프라이머 조합을 이용하여 'BN4001'과 'BN4002' 두 고정계통 사 이에서 다형성을 보이는 프라이머 조합을 선발하였다. 도 1은 8개의 프라이머 조합을 사용한 AFLP 결과를 2% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 결과를 보여준다. 하나의 프라이머 조합에 3~17개, 평균 10개의 PCR 단편이 증폭되었다. 대략 총 14,000개의 PCR 단편 중 105개의 단편이 고정계통에서 다형성을 나타냈다.
선행 논문에는 44개의 수박품종을 구분하기 위한 AFLP 분석에서 총 707개의 단편 중 118개에서 다형성을 확인했다고 보고되고 있는데, 이와 비교해서 본 연구의 다형성 수준은 낮은 것으로 판단된다. 선행 논문의 AFLP 분석에 많은 유전자형(44개 품종)을 실험 재료로 사용했으며 수박품종 간의 유전적 다양성의 범위도 넓어서 다형성 수준(17%)이 높은 것으로 보인다.
본 발명에서 다형성이 확인된 단편들을 클로닝하고 염기서열을 분석하여 AFLP 마커를 염기서열에 기초한 DNA 마커로 전환하였다. 전환된 염기서열에 기초한 DNA 마커 중 13개는 두 고정계통과 4개의 수박품종에서 PCR 증폭 산물의 크기에 차이를 보였고, 14개의 마커는 PCR 증폭 산물에 제한효소를 처리하여 다형성을 확인하였다. 결과적으로 선발된 AFLP에서 유래한 DNA 마커들은 삽입 및 결손에 의한 다형성 또는 제한효소 절단부위의 다형성 빈도는 26%(27/105)로 나타났는데, 이러한 다형성 빈도는 메론의 유전자 지도 작성을 위해 양친에서 SNP(single nucleotide polymorphism) 또는 삽입 및 결손을 보이는 EST 클론의 다형성 빈도(67%)에 비해 상당히 낮은 것이다 (Morales et al. 2004. Genome 47: 352-360). 메론의 양친은 대부분 유전적으로 매우 먼 그룹에 속하므로 이런 계통에서는 일반적으로 다형성 정도가 높게 나타난다. 마커 선발에 사용된 6개의 유전자형(BN4001, BN4002, 4품 종)이 상기 표 1에서 보는 것처럼 여러 형태적 차이를 보이지만, 105개의 AFLP에서 유래한 마커에서의 유전적 다양성이 넓게 나타나지 않았다. 이렇게 유전적 다양성이 낮게 나타나는 것은 본 발명에 사용된 유전자형의 수가 적고 한국 수박의 유전형질의 범위가 매우 좁기 때문인 것으로 추정된다.
염기서열에 기초한 DNA 마커의 다형성 정도가 낮은 또 다른 이유는 이 마커들이 AFLP를 통해 개발되었기 때문이다. AFLP에 의한 다형성은 주로 제한효소 절단부위 또는 선발 프라이머의 염기서열 차이에 의해 나타난다. 따라서 DNA walking 방법을 이용하여 염기서열에 기초한 DNA 마커의 다형성 정도를 좀 더 늘릴 수 있을 것으로 생각된다. 이상의 결과에서와 같이 AFLP 방법을 이용하여 총 27개의 SCAR 또는 CAPS 마커를 개발하였다 (표 2).
표 2. 본 발명에서 선발된 마커 및 이의 프라이머 서열, 어닐링 온도, 수박에서 다형성을 검출하기 위해 이용된 제한효소, 및 계산된 PIC 값.
Marker name Forward primer (5' to 3') Reverse primer (5' to 3') T m Marker typea PIC value
CMSSR 30 TCCTTCTTTTCCTCGCTCTG (서열번호 1) TGCCCTAAAATCCTCACACT (서열번호 2) 52℃ SSR-M 0.45
MCPI-03 GCATAAACCACCTGTGAGTGG (서열번호 3) ATGGCTTTGCGTTTCATTTC (서열번호 4) 55℃ SSR-J 0.26
MCPI-04 AGCAAATGCATGGGGAAAAC (서열번호 5) TGTTGAATGGAGGCTTTGAG (서열번호 6) 55℃ SSR-J 0.49
MCPI-07 GGTTATGGCCATCTCTCTGC (서열번호 7) GAGAGTGGGCGTAAGGTGAG (서열번호 8) 55℃ SSR-J 0.50
MCPI-12 GGAGTAGTGGTGGAGACATGG (서열번호 9) TCCTTTCTCTTTCGCAAACTTC (서열번호 10) 55℃ SSR-J 0.43
MCPI-14 TCAAATCCAACCAAATATTGC (서열번호 11) GAGAAGGAAACATCACCAACG (서열번호 12) 55℃ SSR-J 0.47
MCPI-28 AATGTTAAGCAGTAAGCACATGG (서열번호 13) ACACCGGAGAAGGTGAATTG (서열번호 14) 55℃ SSR-J 0.48
MCPI-30 GCTTTGAAGTTTGTTTAATTTTAGTCC (서열번호 15) CGCCTCACGCTCTCTCTAAC (서열번호 16) 55℃ SSR-J 0.45
MCPI-31 TAACCGTCACCAACCCATTC (서열번호 17) TCCAAAATTGGTCGGATTTG (서열번호 18) 55℃ SSR-J 0.26
MCPI-32 AAGGCTGCAGAGACCATGAC (서열번호 19) AATGATGAAGAACGGGCAAG (서열번호 20) 55℃ SSR-J 0.50
MCPI-37 AATCTTCCCCATGCCAAAAC (서열번호 21) GACTTCCAAACCCTCCCTTC (서열번호 22) 55℃ SSR-J 0.47
AB006530.1 TGAGAGGAAAGGAACCATAA (서열번호 23) GTCTCTTGCAAAGCTCAAACT (서열번호 24) 55℃ SSR-G 0.47
EST00675 CTTCCTTTCTCTTCATTCCC (서열번호 25) TGAGGGAAAACGAGTTTAGA (서열번호 26) 55℃ SSR-G 0.26
Cgb4765 TTCTCTTCATTCCCCCAAAATC (서열번호 27) ACGGGTGAGGGAAAACGAG (서열번호 28) 55℃ SSR-L 0.26
ASUW2 GCTTCGTTGTTGCTGCCGTTG (서열번호 29) GCATAAAATCACACTCAAAC (서열번호 30) 55℃ SSR-L 0.47
WMA 1 GGAAAACGCAAAATCAGAGAG (서열번호 31) GGACGACATTTTTACCGGTC (서열번호 32) 55℃ SCAR 0.47
WM 2 CTAGAAATAAGGTTACCGCCT (서열번호 33) AGAAAACTATGGTAGCTGCAG (서열번호 34) 55℃ SCAR 0.50
WM 15 CTAGAAAGTACTGATCTCGGAG (서열번호 35) CAACACCCTTGAACTCTTTCC (서열번호 36) 55℃ SCAR 0.44
WM 27 GGATATTTGCTCTTGTGTTCGA (서열번호 37) TCGCATGGAAGCAGGAACCA (서열번호 38) 55℃ SCAR 0.26
WM 59 AAAACTTTGCAAATTCGAACC (서열번호 39) AATTCGGTTGGTTTGTTT (서열번호 40) 55℃ SCAR 0.14
WM 61 AGATAACTTTCACAAAATCCAAG (서열번호 41) AATTCGGTGATGACTTGATAAT (서열번호 42) 55℃ SCAR 0.46
WM 76 CTAGATAGACATCTAAGAGAG (서열번호 43) AATTCGAGCCTCTTTATTTGC (서열번호 44) 55℃ SCAR 0.39
WM 78 CTAGATTAGAGGTTTGGGTTCA (서열번호 45) ATTCACAGTTTCGATATGGCATT (서열번호 46) 55℃ SCAR 0.39
WM 86 CTAGATTTGGTTTTTCAACTTCC (서열번호 47) AATTCAGCCGAGTGGTTATAC (서열번호 48) 55℃ SCAR 0.26
(표 2 계속)
WM 88 AGATTTGAAATACTTCCAAAGAA (서열번호 49) ATTCTACTGGTTCCTTGCTTG (서열번호 50) 55℃ SCAR 0.72
WM 103 TAGATGCTCTATGAAGGTTACGA (서열번호 51) AATTCGACCCCATGAGATAC (서열번호 52) 55℃ SCAR 0.36
WM 106 AGATCAAGCTTAAAATAGCAAGG (서열번호 53) AATTCAAGGTCTGCCACAG (서열번호 54) 55℃ SCAR 0.50
WM 109 ATACACTTCCATATGTATCATATTTGC (서열번호 55) AATTCACAAACATTAAGGAGAAG (서열번호 56) 55℃ SCAR 0.26
CPM 6 GACAGATGAAGGAAGCCAGAAT (서열번호 57) TGGCTTCTGTCTGTACTCTCAA (서열번호 58) 53℃ SCAR 0.26
WMA 2 AAAACACCCCCGAAAATAAAACTT (서열번호59) AGGAAGGTGAGAGAGACCTTGCTA (서열번호 60) 52℃ Tru9 Ⅰ 0.36
WMA 3 TTCACATAGTGAGGGGAGAGTGTA (서열번호61) TAGAGGAACTGCCCAACGAAGTAG (서열번호 62) 60℃ Hae Ⅲ 0.35
WMA 4 AATTCCTTACATATCGGGCATTAT (서열번호63) TCTAGAGGAACTTCATCACCTTCA (서열번호 64) 52℃ Tru9 Ⅰ 0.46
WMA 5 ACGAGCAAGTATATCTACATCGTG (서열번호65) TCTAGAGGCTAAGAAGGAGCTGAG (서열번호 66) 52℃ Tru9 Ⅰ 0.50
WMA 6 ATTCACATAGTGAGGGGAGAGTG (서열번호 67) AAGCGACAACAATACATTCAACC (서열번호 68) 52℃ Hae Ⅲ 0.35
WMA 7 GGGCAATTTTTGGCTTTATTATC (서열번호 69) ACTCACCACACCAATGAACCTC (서열번호 70) 52℃ EcoR Ⅰ 0.31
WM 11 TCTCATGCAACCTAATTGATTAC (서열번호 71) CCTTTCAAAACTTATTCCTTAGGT (서열번호 72) 55℃ Tru9 Ⅰ 0.44
WM 13 CTAGAAACAGGGGTAGAGGT (서열번호 73) AATTCGTCTGTTGTTGTTGGAG (서열번호 74) 55℃ Nde Ⅱ 0.44
WM 16 TTGGTTCAATATCTACCCGGT (서열번호 75) GAATTCTACATGTATGAGAAAG (서열번호 76) 55℃ EcoR Ⅰ 0.39
WM 26 CTAGAATTGCAACCATTTTCC (서열번호 77) CAAGTGTTGTGTGAACCGAG (서열번호 78) 55℃ Hinf Ⅰ 0.48
WM 33 CTAGAATGGCAAGTCTCAGAC (서열번호 79) ATTCTTCCGAGAATCAACAACC (서열번호 80) 55℃ Taq Ⅰ 0.45
WM 38 GAACACAAGTACGGAACACC (서열번호 81) GAATTCGATGATCGAGTACCTG (서열번호 82) 55℃ EcoR Ⅰ 0.70
WM 46 CTAGAAGACGCGGGAATG (서열번호 83) ATTCTACCCCAAACCAACATA (서열번호 84) 55℃ Hae Ⅲ 0.39
WM 81 CTAGATTTCTATTACATTTTACACTT (서열번호 85) TCAACAGCATTTTGTGACATT (서열번호 86) 55℃ Hae Ⅲ 0.43
a) SSR-M; [Lee et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 108: 619-627]에 의해 멜론에서 개발된 SSR 마커, SSR-J; [Joobeur et al. (2006) Theor. Appl. Genet. 112: 1553-1562]에 의해 수박에서 개발된 SSR 마커, SSR-G; [Guerra-Sanz JM. 2002. Molecular Ecology Notes 2(3): 223-225]에 의해 수박에서 개발된 SSR 마커, SSR- L; [Levi et al. (2006) J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131(3): 393-402]에 의해 수박에서 개발된 SSR 마커. CAPS 마커의 경우에, 제한효소가 표시된다.
실시예 3: DNA 마커의 PIC 값 측정
총 43개의 염기서열에 기초한 DNA 마커가 국내 시판 수박품종의 다형성 분석에 사용되었다. 모든 마커는 26개 수박품종에서 확실하고 재현성 있는 다형성 단편들을 나타냈으며 하나의 마커는 평균 2.1개의 대립 유전자를 가졌다. 도 2는 수박 SSR 마커로부터 선발된 'EST00675'(A), 메론에서 유래한 SCAR 마커 'CPM6'(B), 수박에서 AFLP를 통해 개발된 SCAR 마커 'WM76'(C)과 CAPS 마커 'WM81'(D)을 두 고정계통과 26개의 수박품종에 검정한 PCR 증폭 양상을 나타낸다. 각 유전자형에 대한 마커의 대립 유전자 구성은 PIC 값으로 평가하였다. 마커의 평균 PIC 값은 0.41이고 'WM88'이 0.72로 가장 높았으며 'WM59'의 PIC 값이 0.14로 가장 낮게 나타났다 (표 2). SSR 마커의 다형성의 정도 값은 SCAR 및 CAPS 마커의 값과 유사하였다. 마커의 유형별로 PIC 값을 직접 비교하지는 않았지만 SSR 마커는 다른 마커 (RFLP, RAPD, AFLP)에 비해 많은 다형성을 나타낼 것이라 예상된다.
한국의 수박품종에서 마커의 PIC 값이 낮은 것은 수박품종이 재래종이나 토착종에 비해 세대교잡의 발생 빈도가 낮고 유사한 원원종에서 분리해왔기 때문인 것으로 판단된다. 개발된 염기서열에 기초한 DNA 마커의 PIC 값이 대체적으로 낮으나 수박의 다형성을 판별하는 마커로 충분히 사용될 수 있을 것이다 (도 2). 이들 마커는 특정 유전자형의 판별이나 F1 종자 생산에서 오염된 종자의 분석, 품종보호에 유용하게 사용될 것이다.
실시예 4: 수박품종의 계통발생학적 유연관계 분석
국내에서 시판되고 있는 26개 수박품종의 계통발생학적 유연관계는 앞서 개발된 43개의 염기서열에 기초한 DNA 마커를 이용하여 분석하였다. 총 26개 품종은 크게 두 개의 분류군으로 나누어지고 그들 간의 유전적 유사성은 58%였다 (도 3). 첫 번째 분류군에는 스피드와 스피드플러스, 초고속꿀, 조춘꿀 수박이 속해 있다. 이들 품종의 과실 성숙 시기는 같게 나타났지만 과실의 다른 특성에 대해서는 특별한 유사성이 없었다. 이들 4 품종을 제외한 나머지 품종이 속하는 두 번째 분류군은 3개의 하위 분류군으로 나눠지며 하위분류군 사이의 구분은 유전적 유사성 66%에 의해 구별되었다. 이들 중에서 두 번째 하위분류군 내에서의 품종간 유전적 유사성이 첫 번째와 세 번째 하위분류군 보다 가깝게 나타났다.
본 발명에서 개발한 DNA 마커를 이용한 다형성 분석을 통해 여러 분류군의 품종들을 명확하게 분류하였지만, 만약 다른 종류의 분자 마커로 이들 품종들을 분석한다면 유전적 연관성이 어느 정도는 달라질 수도 있을 것으로 판단된다. 이는 본 발명에 사용된 DNA 마커가 특정 고정계통 BN4001과 BN4002에서 다형성을 확인하여 선발한 마커이기 때문일 것으로 추정된다.
전체 26 품종들의 평균 유전적 유사성은 66%이고 백마강과 초고속꿀 수박의 유사성이 29%로 가장 낮으며, 차세대와 인동꿀, 차세대와 새천년 수박이 각각 96%로 가장 높게 나타났다 (표 3). 26개의 수박품종에 대한 유전적 다양성 평가는 기존에 보고된 논문과 비교해 그 유사성 정도가 상대적으로 매우 높다고 할 수 있다. 그러나 (주)농우바이오에서 육성한 스피드꿀수박 품종의 경우에는 표 1에 명기된 26개의 수박품종과 비교하였을 때, (주)농우바이오의 스피드플러스수박과 가장 높은 유사성을 보였으며 (89%), 다른 국내 품종들과는 모두 75% 이하의 낮은 유사성을 보이는 것으로 나타나 국내 시판되는 품종들과는 유사성이 아주 낮게 나타났다. 이러한 결과로 보아 본 명세서에 포함된 43개의 마커를 이용하여 유사성 분석을 할 경우, (주)농우바이오에서 육성한 스피드꿀수박 품종의 경우에는 국내에서 시판되고 있는 대표적인 수박품종들과는 명확하게 구분할 수 있는 것으로 나타났다.
표 3. 43개의 마커를 이용한 26개의 수박 품종 사이의 유전적 유사성 매트릭스.
Figure 112007079807989-pat00004
도 1은 8개의 프라이머 조합을 사용한 AFLP 결과를 2% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 결과를 보여준다. 화살표는 계통 사이의 다형성 (polymorphism)을 나타낸다. PCR 산물의 각 세트 위의 숫자는 AFLP 분석에 이용된 몇 가지 프라이머 조합을 나타낸다. XbaI 자리에 대한 선택적인 뉴클레오티드는 모든 반응에서 ATTT이다. EcoRI 자리에 대한 선택적인 뉴클레오티드는 CAAC (1), CATC (2), CATG (3), CACA (4), CAGC (5), CTAG (6), CTTC (7) 및 CRRG (8)이다.
도 2는 수박 SSR 마커로부터 선발된 'EST00675'(A), 메론에서 유래한 SCAR 마커 'CPM6'(B), 수박에서 AFLP를 통해 개발된 SCAR 마커 'WM76'(C)과 CAPS 마커 'WM81'(D)을 두 고정계통과 26개의 수박품종에 검정한 PCR 증폭 양상을 나타낸다. PCR 산물을 3% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.
도 3은 26개 한국 수박 품종에서 유전 관계를 보여주는 도표 (dendrogram)이다. 도포를 서열 기재 다형성 마커에 기초하여 유전적 유사성 매트릭스의 UPGMA 클러스터 분석에 의해 작성하였다.
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  1. 삭제
  2. 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 SSR (simple sequence repeat) 마커;
    서열번호 31 및 32의 프라이머 세트, 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트, 서열번호 35 및 36의 프라이머 세트, 서열번호 37 및 38의 프라이머 세트, 서열번호 39 및 40의 프라이머 세트, 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트, 서열번호 43 및 44의 프라이머 세트, 서열번호 45 및 46의 프라이머 세트, 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트, 서열번호 49 및 50의 프라이머 세트, 서열번호 51 및 52의 프라이머 세트, 서열번호 53 및 54의 프라이머 세트, 서열번호 55 및 56의 프라이머 세트, 서열번호 57 및 58의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 SCAR (sequence characterized amplified region) 마커; 및
    서열번호 59 및 60의 프라이머 세트, 서열번호 61 및 62의 프라이머 세트, 서열번호 63 및 64의 프라이머 세트, 서열번호 65 및 66의 프라이머 세트, 서열번호 67 및 68의 프라이머 세트, 서열번호 69 및 70의 프라이머 세트, 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트, 서열번호 73 및 74의 프라이머 세트, 서열번호 75 및 76의 프라이머 세트, 서열번호 77 및 78의 프라이머 세트, 서열번호 79 및 80의 프라이머 세트, 서열번호 81 및 82의 프라이머 세트, 서열번호 83 및 84의 프라이머 세트, 서열번호 85 및 86의 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커
    를 포함하는 수박 품종을 식별하기 위한 마커.
  3. 제2항에 있어서, 표 2에 기재된 서열번호 1 내지 86으로 표시된 43개 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 마커.
  4. 제2항에 있어서, 표 1에 기재된 26개 수박 품종을 식별하기 위한 것을 특징으로 하는 마커.
  5. 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 수박 품종을 식별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 수박 시료는 표 1에 기재된 26개 수박 품종인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  9. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 수박 품종을 식별하기 위한 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
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