CN108424956A

CN108424956A - 一种鉴定甜瓜种子纯度的三重pcr方法

Info

Publication number: CN108424956A
Application number: CN201810585223.7A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 马长生; 刘东明; 胡倩梅; 朱华玉; 胡建斌
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2038-06-08
Also published as: CN108424956B

Abstract

本发明属于甜瓜栽培技术领域，具体涉及一种鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR鉴定方法专利申请事宜。该方法用于杂交种纯度鉴定，具体包括：提取待检测材料DNA、进行三重PCR扩增、电泳检测并进行分析评价等步骤。本申请所提供的快速鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，不仅可在同一反应中同时鉴定多个位点，从而可以缩短工作时间，还可以成倍减少试剂耗材的消耗量。采用本发明所述的方法鉴定甜瓜种子纯度时，可有效克服传统单一PCR在种子纯度鉴定中速率慢的缺陷，具有时间短、特异性好、准确性高、低成本和广适用性等特点，能够简捷快速地获知甜瓜种子材料的纯度，以便于更有针对性地开展后续的种质资源分析和育种工作。

Description

一种鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法

技术领域

本发明属于甜瓜栽培技术领域，具体涉及一种鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR鉴定方法专利申请事宜。

背景技术

甜瓜（Cucumis melo L）为葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis）一年生草本蔓生植物，起源于印度及其毗邻地区。我国是甜瓜生产大国，2015年我国甜瓜栽培面积达到46.09万公顷，产量为1527.1万吨。

甜瓜栽培过程中，品种纯度是确保甜瓜产量和管理措施一致性的重要前提要素。因此，对于品种纯度进行检测是相关栽培种植、繁殖育种等工作开展的重要前提工作。现有技术中，种子纯度鉴定是一项较为繁重的工作，特别是甜瓜自身存在的丰富变异表型，大大加重了育种和纯种鉴定的工作量。

现有技术中，一般性的种子纯度鉴定有田间鉴定和分子鉴定这两种方法。田间种子纯度鉴定时，依据苗期部分性状进行种子纯度鉴定时一般需要3-4周，而依据结实期部分性状进行种子纯度鉴定时则一般需要3-4个月时间，并且田间管理的过程中需要投入大量的人工及药剂、肥料等成本，所需周期长、消耗大；另一方面，对难以判定的表型还要求育种工作者具有丰富的鉴定经验。由于这些技术限制，除非特别必须时，现有田间种子纯度鉴定方法已无法适应栽培育种的快速化、标准化要求。

随着分子生物技术的发展，基于聚合酶链式反应技术（PCR）的种子纯度鉴定已成为纯度鉴定一大潮流，该方法针对材料的不同性状一般只需1周即可完成种子纯度的鉴定工作，可大大缩短鉴定周期，另外亦不需要大量人工以及所有的肥料、药剂成本，而且技术操作简单，对工作者的经验没有要求。因此具有较大应用潜力。但该技术也存在一定缺陷，主要是：一般一个PCR反应体系仅应用一对标记，而在面临需要鉴定多个位点的需求时，就需要多个反应，因此使得该方法的经济适用性和效率性仍有较大提升空间。

多重PCR（multiplex PCR），又称多重引物PCR或复合PCR，PCR反应方式中一种，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相似，但该方法的主要特点和优势是：在进行聚合酶链式反应时可在同一PCR反应体系里加上2对及以上标记，能同时扩增出多个核酸片段，可以尽可能少的消耗获得尽可能多的遗传信息。相较于单一PCR，多重PCR有以下几个优点：（1）高效性，可在同一反应中同时鉴定多个位点，缩短了工作时间；（2）经济适用性，多重PCR成倍减少试剂耗材的消耗量；（3）广泛适用性，凡可以用PCR技术进行基因分型的材料都可以使用多重PCR。但总体而言，现有技术中，尚未见到较好的利用多重PCR技术进行甜瓜种子纯度鉴定的相关报道。

发明内容

本申请目的在于提供一种快速准确鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，从而为甜瓜的栽培种植、田间管理等工作奠定应用基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，该方法具体包括如下步骤：

（1）提取待检测材料DNA

提取待检材料的DNA，具体而言：例如以待检甜瓜活体组织（具体例如：幼苗期植株幼叶）作为样品来源，利用CTAB法提取其基因组DNA，以此作为PCR扩增用模板；

所述甜瓜品种具体例如为：DHL92、TopMark等；

（2）进行三重PCR扩增

PCR扩增时，具体引物序列设计要求为：结合本申请发明目的而言，引物设计的原则为：依据引物进行扩增后，PCR扩增产物大小应具有多态性；同时PCR扩增产物大小应符合60个左右（具体例如50~60个）碱基差（优选情况下，应不小于60个碱基差）的条件要求；

以针对DHL92×TopMark的杂交F1代纯度鉴定为例，具体鉴定时，引物序列组合可从如下引物序列组合中选择（具体如SEQ ID NO.1~24），具体选择时，依据PCR产物长度，选择相邻两个PCR产物长度在60个碱基差左右的3个、或者4个引物对组合进行后续PCR扩增；

；

具体而言：例如选择CmSSR06968、CmSSR13983、CmSSR13629的3个引物对的组合，或者选择CmSSR06968、CmSSR13983、CmSSR13629、CmSSR23498的4个引物对的组合；

PCR扩增时，10μL扩增体系设计为：

3对引物（F引物、R引物），每条引物各0.5μL（5μmol/μL），共3μL；

步骤（1）所制备PCR扩增用模板，1μL（25ng/μL）；

Magic Mix×3.0，5μL，

ddH₂O，1μL，

PCR反应程序采用Touch-down，扩增程序主要分为6个阶段，具体而言：

第一阶段：95℃预变性5min；

第二阶段：94℃变性45S，68~58℃进行6个循环的退火，每个循环降低2℃，每次1min；72℃延伸1min；

第三阶段：94℃变性30S；58~50℃进行8个循环的退火，每个循环降低1℃，每次1min；72℃延伸1min；

第四阶段：94℃变性30S；50℃退火30s；72℃延伸1min；将此阶段进行20个循环；

第五阶段：72℃延伸7min；

第六阶段：4℃保温；

（3）电泳检测并进行分析评价

对步骤（2）中PCR扩增产物进行30%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，依据电泳图谱对种子纯度进行分析检测，纯度判断方法为：

由于在设计扩增用引物时，PCR扩增产物具有多态性，因此待鉴定杂交种的父母本具有特定的有差异的条带，而据此父母本获得的杂交后代在进行PCR扩增时扩增产物也会带有父母本的组合条带，以此作为依据，如果待鉴定杂交后代中的扩增产物的条带组合与父母本组合条带结果不同，则待鉴定材料为假杂种，进而进行统计即可获得杂交种的纯度结果。

本申请中，在前期研究基础上，发明人利用TopMark 和DHL92这两个品种配制了杂交组合，以其F1代作为模拟商品种，对其进行了模拟种子纯度鉴定。在此基础材料基础上，通过引物筛选、单一PCR与多重PCR的比较、最适片段差的选择、最大引物添加对数的确定、以及多重PCR在群体中的稳定性验证等工作，最终证明：多对引物相互之间PCR产物片段差达到60bp及以上、每个反应体系引物添加对数少于4对时，能够有效同时进行多个位点的扩增，此时即可利用多重PCR技术来提高种子纯度鉴定效率。

总体而言，本申请所提供的快速鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，不仅可在同一反应中同时鉴定多个位点，从而可以缩短工作时间，还可以成倍减少试剂耗材的消耗量。采用本发明所述的方法鉴定甜瓜种子纯度时，可有效克服传统单一PCR在种子纯度鉴定中速率慢的缺陷，具有时间短、特异性好、准确性高、低成本和广适用性等特点，能够简捷快速地获知甜瓜种子材料的纯度，以便于更有针对性地开展后续的种质资源分析和育种工作。因此，本发明在甜瓜育种实践和生产中具有广阔的应用前景和重要的应用价值。

附图说明

图1 为CmSSR24633和CmSSR27535的扩增电泳图，其中M：marker；1：CmSSR24633；2：CmSSR27535；3：CmSSR24633和CmSSR27535，每个组合扩增条带中前两个是亲本，后四个是F1单株；

图 2为7个引物组合的扩增电泳图，其中M：marker；1-7：7个不同的引物组合，每个组合中前两个为亲本,后四个为F1单株；

图 3为引物组合8、9、10的扩增电泳图；其中M：marker ；8、9、10三个组合包含不同数目的引物，每个组合中前两个为亲本,后四个为F1；

图4为不同数目的引物在群体中的扩增电泳图；其中M：marker；1、2：不同数目引物在DHL92、TopMark中的扩增图，3：在F1群体中的扩增图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例涉及部分生物材料实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

选用材料为农艺性状差异较大的DHL92和TopMark进行相关实验（这两个材料均为可公开获得的种子资源材料）：

DHL92品种材料：该品种为一个高度纯和的双单倍体材料，果实成熟时果实形状为瓶颈，果皮绒毛较少，无网纹，果皮底色为灰绿色，覆有墨绿色小斑点，外果肉和内果肉为白色，瓜瓤颜色为浅橘色，果实硬度15以上；

TopMark品种材料：该品种为经多代自交的典型厚皮甜瓜，果实成熟时果实形状为圆形，果皮绒毛密且多，果实外部全部附有密且粗的网纹，果皮底色为深黄色，无覆纹，外果肉为黄色，内果肉及瓜瓤为橘色，果实硬度7左右；

TopMark ×DHL92的F1代，为按现有常规杂交方式由发明人自行杂交制备，具体过程不再赘述。

实施例1

（一）待检材料DNA模板提取制备

一般而言，对甜瓜基因组DNA提取时以幼苗期幼叶为材料来源具有较好便捷性和易操作性，本实施例即以甜瓜幼苗活体叶片组织作为样品，对其基因组DNA进行了提取操作，具体过程简要介绍如下。

对待检甜瓜种子用温汤浸种催芽，将DHL92和TopMarker材料各10株播种于育苗穴盘中分别作为对照组1、对照组2，将TopMarker ×DHL92 的F1代100株均匀播种于事先铺有吸水纸的保鲜盒中作为实验组，播种后在种子上部盖上三层吸水纸并浇透水，于光照培养箱中进行育苗，于大约两叶一心时提取幼叶DNA。

对每个组别生物材料样品分别提取基因组DNA，具体操作如下：

在2ml离心管中加入2粒钢珠，撕取1.5cm左右叶片，塞入离心管中，加入80μL、0.4MNaOH，盖好盖子放入高通量组织粉碎机中，震荡3分钟；将磨碎的组织样品放入离心机中瞬时离心，使离心管壁上的组织细胞离到底部；

将离心过的样品放入水浴锅中100℃、90s，水浴后对样品进行瞬时离心；

吸取15μL上清至一新的1.5ml离心管中，并加入200μL、 0.1M （pH=8）的Tris-HCl中，徒手震荡几次后，采用琼脂糖凝胶电泳技术对所提DNA的质量和完整性进行检测，对质量和完整性不合格的进行重新提取，然后对提取合格基因组DNA样品直接作为后续PCR扩增模板用于后续实验或者4℃保存备用。

（二）多重PCR扩增用引物开发设计

在前期研究工作基础上，发明人以甜瓜全基因组为研究对象，设计了若干SSR引物，以此为基础，以步骤（一）中的双亲TopMark 和DHL92材料基因组（即对照组1、对照组2）为模板，筛选确定了在亲本间存在多态性、条带清晰、易于识别、PCR产物片段合适、并可以稳定扩增的12对引物；

具体引物序列信息如下：

。

在上述筛选所得引物基础上，分别进行单一（引物对）PCR与多重PCR，以对两种PCR方法差异及优劣进行评价；

PCR扩增时，分别以双亲TopMark 和DHL92（对照组1、对照组2）及其F1随机挑选单株材料（实验组）所提取基因组DNA作为模板，分别进行单一PCR扩增或多重PCR扩增对比；

PCR扩增时，均采用10μL扩增体系，具体设计为：

基因组DNA，30ng/μL，1μL（约30ng）；

每对引物，F、R各0.5μL（引物浓度均为5 μmol/L）；

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，补齐10μL。

具体而言：单一PCR扩增时，采用单一引物对，每条引物各0.5μL（5μmol/μL）（共2条引物，因此一共1μL）；多重PCR扩增时，根据引物对数量确定总体系，但每条引物各0.5μL（5μmol/μL），因此两个引物对时，用量为2μL，三个引物对时，用量为3μL，四个引物对时，用量为4μL，

步骤（1）所制备PCR扩增用模板，1μL（25ng/μL）；

Magic Mix×3.0，5μL，

ddH₂O，单一PCR扩增时，用量为3μL；多种PCR扩增时，根据引物对体系用量，调整ddH₂O用量，例如，采用三个引物对时，ddH₂O用量为1μL，采用两个引物对时，ddH₂O用量为2μL，采用四个引物对时，ddH₂O用量为0μL。

单一引物对PCR扩增时，扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃5min。

多重PCR扩增时，PCR反应程序采用Touch-down，扩增程序主要分为6个阶段，具体而言：

第一阶段：95℃预变性5min；

第二阶段：94℃变性45S，结合Touch-down程序，68~58℃进行6个循环的退火，每个循环降低2℃，每次1min；72℃延伸1min；

第三阶段：94℃变性30S；结合Touch-down程序，58~50℃进行8个循环的退火，每个循环降低1℃，每次1min；72℃延伸1min；

第五阶段：72℃延伸7min；

第六阶段：4℃保温。

在前述筛选所得12对引物对基础上，（依据PCR产物片段长度不同）设计选择了2对、3对或4对引物对进行多重PCR，具体引物对组合列表如下：

引物对组合，

。

需要说明的是，2对引物对组合设计时，依据PCR产物片段长度不同、PCR产物差，按梯度组合出7个组合，组合1-7的PCR产物片段差分别为18bp、36bp、54bp、76bp、91bp、111bp、132bp，使组合1到组合7相邻组合间的PCR产物差递增约为20bp，以获得合适的PCR产物长度差组合。3对引物对组合、4对引物对组合（组合8-10），这三个组合则是通过添加不同的标记数目，以获得反应体系中合适的标记对数。

对PCR扩增产物进行30%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每个点样孔上样量1.5μL，200V、112mA、22W进行电泳，待电泳指示剂距凝胶底部1cm时停止电泳。电泳结束后切掉电源，将凝胶小心取出进行银染，在浓度为0.007mol/L 的AgNO₃ 染色液中缓慢摇晃3min，快速用蒸馏水洗涤后在显色液（0.37 mol/L NaOH+1.5%甲醛）中摇晃至显现出条带为止，用蒸馏水漂洗，数码相机拍照，并进行分析，具体电泳结果如图1、图2、图3、图4所示。

依据电泳结果，分析可以看出，单一PCR与添加2对引物的多重PCR扩增效果类似，两重PCR并不影响扩增结果（图1所示）。但合适的PCR产物差对于电泳检测结果的准确性、便捷性显然是有较大影响的，当引物间PCR产物片段长度差不小于60bp 时能够明显拉开条带间差距，此时对于电泳条带的判读不具有直接性影响，但显然便于用于进一步的直观性的分析、判定（如图2所示，较大的片段长度差对于直观性的判定显然更为有利）。

而对于多重PCR体系中引物对使用数量而言，随着反应体系中的引物对使用数量增多， PCR产物电泳结果分析难度也显著增加，而另一方面，采用3对引物对电泳结果进行分析时，无论PCR扩增体系稳定性、还是结果分析的准确性和便捷性显然都是较好的折衷结果（如图3、图4所示，3对引物对于最终结果分析显然已经较为充足，4对引物时虽然也有较好结果，但显然随着引物对数量增加，反应体系设计难度、操作难度、以及后续分析难度显然也有明显增加，因此，3对引物的应用显然是较好的结果）。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 一种鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims

1.一种鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，其特征在于，该方法用于杂交种纯度鉴定，具体包括如下步骤：

（1）提取待检测材料DNA

提取待检材料的DNA；

（2）进行三重PCR扩增

PCR扩增时，具体引物序列设计要求为：依据引物进行扩增后，PCR扩增产物大小应具有多态性；同时PCR扩增产物大小应具有不小于50个的碱基差；

PCR扩增时，同时采用3对引物或4对引物组合进行PCR扩增；

（3）电泳检测并进行分析评价

对步骤（2）中PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，依据电泳图谱对种子纯度进行分析检测，纯度判断方法为：

2.如权利要求1所述鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，其特征在于，步骤（3）中，凝胶电泳检测时采用30%聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3.如权利要求1所述鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，其特征在于，步骤（1）中，以待检甜瓜活体组织作为样品来源，利用CTAB法提取其基因组DNA。

4.如权利要求1所述鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计为：

3对引物，每条引物各0.5μL、5μmol/μL，共3μL；

PCR扩增用模板，1μL、25ng/μL；

Magic Mix×3.0，5μL；

ddH₂O，1μL，

PCR反应程序采用Touch-down，扩增程序分为6个阶段，具体而言：

第一阶段：95℃预变性5min；

第五阶段：72℃延伸7min；

第六阶段：4℃保温。

5.如权利要求1所述鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，其特征在于，步骤（1）中，待检材料为DHL92×TopMark的杂交F1代。

6.如权利要求5所述鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，其特征在于，步骤（2）中，引物对组合从如下引物序列中选择，引物序列如SEQ ID NO.1~24所示，具体如下：

。

7.如权利要求6所述鉴定甜瓜种子纯度的三重PCR方法，其特征在于，步骤（2）中，引物对组合具体选择为：CmSSR06968、CmSSR13983、CmSSR136293个引物对组合，或者CmSSR06968、CmSSR13983、CmSSR13629、CmSSR234984个引物对组合。