CN108330208A - 一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记。本发明的辣椒分子标记为SSR分子标记P06‑319，以辣椒细胞质基因组DNA为模板，通过引物对P06‑319F和P06‑319R进行PCR扩增，获得的DNA片段；其中，引物P06‑319F和P06‑319R均由单链DNA组成，P06‑319F序列如SEQ ID NO.1所示，P06‑319R序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用SSR标记多态性筛选获得具有稳定多态性的分子标记及其引物对用于辣椒育性的快速鉴定及辅助育种。

Description

一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记
技术领域
本发明涉及植物分子标记辅助技术领域，具体来说，涉及一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)为常异花授粉植物，以自交为主，有一定的天然杂交。培育辣椒新品种需要进行人工杂交育种，但由于辣椒花器官较小且雌雄同花，使得人工制种成本较高。利用辣椒雄性不育性培育一代杂种，可以省去人工去雄的过程，降低生产成本，极大提高一代杂种的种子纯度，是迄今为止降低辣椒制种成本的最有效途径之一。
辣椒雄性不育主要分为细胞核雄性不育型(Genic Male Sterility，GMS)、核质互作雄性不育型(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)，其中细胞核雄性不育仅由核基因控制，而细胞质雄性不育是由细胞核基因与细胞质基因共同调控，相比于GMS，CMS可获得100％的不育株，可以通过三系配套实现杂种优势育种，拥有广泛的应用前景。
辣椒CMS是由细胞质基因和细胞核基因共同调控的，其中细胞质基因能够导致花粉无法产生或丧失功能，而细胞核中的恢复基因(restorer-of-fertility，Rf)可以抑制细胞质不育基因的功能。在实际生产中，利用辣椒细胞质雄性不育实现三系配套技术育种的关键之一是找到含有恢复基因Rf的恢复系材料。为此，国内外学者在Rf基因的定位及连锁标记开发方面做了大量研究。开发了许多与Rf基因连锁的分子标记，但在紧密连锁程度及适用性上还有待提高。
当前，分子标记辅助育种在实际生产上的应用愈趋广泛，已成为育种工作的重要辅助手段，大大缩短了育种周期。分子标记辅助育种效率的高低，关键在于获得与性状紧密连锁且检测方便的分子标记，因而，开发准确率高，检测手段方便快捷的分子标记对于新品种选育具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其引物对及其检测辣椒雄性不育恢复基因的方法，本发明的分子标记用于辣椒的辅助育种。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，以甜椒细胞质雄性不育系为试验材料，构建F2定位群体，开发SSR标记并进行多态性筛选，获得具有稳定多态性的P06-319标记，通过引物对P06-319F和P06-319R的PCR扩增获得标记DNA片段，其中，P06-319F序列如SEQ ID NO.1所示，P06-319R序列如SEQ ID NO.2所示。
所述P06-319的获得方法：
(1)构建定位群体：以甜椒细胞质雄性不育系22033B436及其恢复系22033C437为试验材料，构建F2群体，对获得包含600个单株的F2群体，单株统计花粉育性，采用改良CTAB法提取辣椒基因组DNA；
(2)开发SSR标记：对辣椒基因组6号染色体的核苷酸序列进行SSR位点的全序列扫描，开发覆盖辣椒基因组6号染色体的SSR标记；
(3)筛选分子标记：利用亲本22033B436，22033C437对开发的SSR标记进行多态性筛选，获得在双亲间具有稳定多态性的分子标记P06-319；
(4)PCR产物检测：分别以辣椒雄性不育系、恢复系和保持系基因组DNA为模板，用分子标记P06-319的引物对P06-319F和P06-319R进行PCR扩增，检测扩增产物大小。
进一步的，步骤(4)中所述的分子标记P06-319在辣椒雄性不育品种(无恢复基因rfrf)的基因组DNA扩增产物含有大小为241bp的片段。
进一步的，步骤(4)中所述的分子标记P06-319在辣椒雄性不育恢复系(含纯合恢复基因RfRf)品种的基因组DNA扩增产物含有大小为192bp的片段。
进一步的，步骤(4)中所述的分子标记P06-319在不育系与恢复系杂交F1代中(含杂合恢复基因Rfrf)同时含有大小为241bp与192bp的片段。
进一步的，对分子标记P06-319进行遗传连锁分析，结果表明其与恢复基因Rf的遗传距离均为0.8cM。
更进一步的，所述分子标记P06-319用于辣椒育性的快速鉴定及辣椒辅助育种，其鉴定方法为：以待测的辣椒基因组DNA为模板，用P06-319的引物对进行PCR扩增，如果得到241bp的片段，且没有得到192bp的片段，则待测辣椒不含恢复基因，为辣椒育种所需的纯合不育系品种。
本发明的有益效果：本发明的分子标记P06-319可用于辣椒育性的快速鉴定及辅助育种，成功率为86.67％，适用性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1.P06-319与恢复基因Rf的遗传距离。图中可见其遗传距离为0.8cM，差异明显。
图2.分子标记P06-319基因型鉴定验证电泳图谱。图中可见其成功率为86.67％，适用性强。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案做详细描述。需要说明的是，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护范围。
实施例1分子标记P06-319的获得
S1构建定位群体：以甜椒细胞质雄性不育系22033B436及其恢复系22033C437为试验材料，构建F2群体，对获得包含600个单株的F2群体，单株统计花粉育性，采用改良CTAB法提取辣椒基因组DNA；
S2开发SSR标记：对辣椒基因组6号染色体的核苷酸序列进行SSR位点的全序列扫描，开发覆盖辣椒基因组6号染色体的SSR标记；
S3筛选分子标记：利用亲本22033B436，22033C437对开发的SSR标记进行多态性筛选，获得在双亲间具有稳定多态性的分子标记P06-319；
S4 PCR产物检测：分别以辣椒雄性不育系、恢复系和保持系基因组DNA为模板，用分子标记P06-319的引物对P06-319F和P06-319R进行PCR扩增，检测扩增产物大小。
PCR扩增产物的分子标记P06-319在辣椒雄性不育品种(无恢复基因rfrf)的基因组DNA扩增产物含有大小为241bp的片段；在辣椒雄性不育恢复系(含纯合恢复基因RfRf)品种的基因组DNA扩增产物含有大小为192bp的片段；在不育系与恢复系杂交F1代中(含杂合恢复基因Rfrf)同时含有大小为241bp与192bp的片段。
实施例2遗传连锁分析
用筛选所得的多态性分子标记P06-319对实施例1中步骤S1所构建的F2群体的600个单株的基因型进行分析，并结合F2群体600个单株的田间育性鉴定结果，用JoinMap4.0软件绘制细胞质雄性不育恢复基因的遗传连锁图谱(图1)。
实施例3分子标记P06-319的应用
利用15份已知基因型(RfRf，Rfrf，rfrf)的辣椒白交系对分子标记P06-319进行验证(表1)，分子标记P06-319PCR电泳图谱如图2所示，由表1可见样本4号73-8及样本14号1312基因型为纯合恢复基因RfRf，分子标记P06-319鉴定结果出现杂合恢复基因Rfrf，其余13个样本检测均准确，分子标记P06-319基因型鉴定成功率86.67％，表明其适用性强，育种实际应用中可以利用两标记对育性进行快速鉴定。
表1已知基因型辣椒自交系对分子标记P06-319的验证结果
SEQUENCE LISTING
<110> 绿亨科技股份有限公司
<120> 一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记
<130> 2018.02
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 辣椒（Capsicum annuum）
<223> P06-319F
<400> 1
tcccctttca gttgtttgga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 辣椒（Capsicum annuum）
<223> P06-319R
<400> 2
agatgtgtgg ctgagaattc aa 22

Claims (8)

1.一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其特征在于：所述分子标记为SSR分子标记P06-319，其引物对由P06-319F和P06-319R组成。
2.根据权利要求1所述的一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其特征在于：所述的引物P06-319F和P06-319R均由单链DNA组成，P06-319F序列如SEQ ID NO.1所示，P06-319R序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其特征在于，所述的分子标记P06-319的获得方法：
S1构建定位群体：以甜椒细胞质雄性不育系22033B436及其恢复系22033C437为试验材料，构建F2群体，对获得包含600个单株的F2群体，单株统计花粉育性，采用改良CTAB法提取辣椒基因组DNA；
S2开发SSR标记：对辣椒基因组6号染色体的核苷酸序列进行SSR位点的全序列扫描，开发覆盖辣椒基因组6号染色体的SSR标记；
S3筛选分子标记：利用亲本22033B436，22033C437对开发的SSR标记进行多态性筛选，获得在双亲间具有稳定多态性的分子标记P06-319；
S4 PCR产物检测：分别以辣椒雄性不育系、恢复系和保持系基因组DNA为模板，用分子标记P06-319的引物对P06-319F和P06-319R进行PCR扩增，检测扩增产物大小。
4.根据权利要求3所述的一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其特征在于：所述的分子标记P06-319在无恢复基因rfrf的辣椒雄性不育品种的基因组DNA扩增产物含有大小为241bp的片段。
5.根据权利要求3所述的一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其特征在于：所述的分子标记P06-319在含纯合恢复基因RfRf的辣椒雄性不育恢复系品种的基因组DNA扩增产物含有大小为192bp的片段。
6.根据权利要求3所述的一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其特征在于：所述的分子标记P06-319在含杂合恢复基因Rfrf的不育系与恢复系杂交F1代中同时含有大小为241bp与192bp的片段。
7.根据权利要求3所述的一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其特征在于：所述的分子标记P06-319与恢复基因Rf的遗传距离均为0.8cM。
8.根据权利要求1所述的一种检测辣椒细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，所述分子标记P06-319在辣椒育性的快速鉴定及辅助鉴定中的应用，其特征在于，鉴定方法为：以待测的辣椒基因组DNA为模板，用P06-319的引物对进行PCR扩增，如果得到241bp的片段，且没有得到192bp的片段，则待测辣椒不含恢复基因，为辣椒育种所需的纯合不育系品种。
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