CN108531636A - 一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM01及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM01及其应用，针对目前单性雌花甜瓜的选育中存在的问题，如年限长、效率低且成本高等缺点，本发明提供了一种鉴定甜瓜单性花的TJcM01分子标记及其专用引物，通过聚合酶链式反应，在甜瓜植株早期就可完成对单性雌花与非单性雌花甜瓜材料的区分，具有特异性好，准确率高，不受环境影响的优点。

Description

一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM01及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM01 及其应用。

背景技术

甜瓜Cucumis melo L.属于葫芦科Cucurbitaceae，黄瓜属Cucumis，是一种重要的园艺作物，其风味独特品质优良，深受消费者欢迎。据联合国粮农组织(FAO)数据显示我国甜瓜产量和栽培面积均居世界第一，这对提升农民的经济效益具有重要意义。甜瓜花性型按花器官着生部位可分为两类，即单性雌花与两性花，单性雌花与两性花相比是一种理想的杂交育种材料，受到广泛关注。目前栽培的甜瓜都是雄花两性花，在杂交一代制种过程中，授粉需要人工去雄，操作较为繁锁，若去雄操作不当会降低座果率和种子纯度。因此选育单性雌花甜瓜，是当前甜瓜遗传育种的重要目标之一。

Adnane Boualem证实甜瓜单性雌花由显性单基因A控制，发现甜瓜的雄性两性花是由于A基因单核苷酸突变导致A57V替换，造成CmACS-7编码的乙烯生物合成酶发生突变造成的。此外，葫芦科花性型的表达模式可以通过激素(如乙烯)和环境因素进行修饰。

当前对于单性雌花甜瓜的选育，一般还采用传统杂交的方法，具有年限长、效率低且成本高等缺点。分子标记辅助育种可以直接从DNA水平对性状进行选择，具有高效，准确及经济等优点，可大幅缩短育种周期，是传统育种技术的有力补充。InDel标记具有准确性高、稳定性好等优点，并且其检测简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，能够基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，直接在电泳技术平台上检测即可。

开发合适的InDel分子标记，用于单性雌花甜瓜品种或品系的选育，能够加快育种进程，提高育种效率，降低育种成本，具有重要的实际应用价值。

发明内容

针对目前单性雌花甜瓜的选育中存在的问题，如年限长、效率低且成本高等缺点，本发明提供了一种鉴定甜瓜单性雌花的TJcM01分子标记及其专用引物，通过聚合酶链式反应，在甜瓜植株早期就可完成对单性雌花与非单性雌花甜瓜材料的区分，具有特异性好，准确率高，不受环境影响的优点。

一种鉴定甜瓜单性花的分子标记TJcM01的专用引物，其特征是所述引物为从5`端到3`端的第1-26位的单链DNA序列的正向引物 CCAAATCTTCGCACCTGAACATTAAC；从5`端到3`端的第1-32位单链DNA序列的反向引物ACTTCTTTGGTAATGAACCTTTTCATATGTAG。

利用本发明的分子标记专用引物，以待检测材料的基因组DNA为模板，通过PCR 扩增获得分子标记，通过测序发现，在单性雌花的甜瓜材料中分子标记大小为235bp的 PCR产物，从5`端到3`端的单链DNA序列为：CCAAATCTTCGCACCTGAACATTAACAAAATTATATAGTAATTATCTTAATTAATTATCCTCATCGATAAAGTGAATATCTAATTAAAAATTTAAAGTCAAAAGTGTGAATTTCTTGAAATATCAAATTAAGACAAAATTCAAATCAATTTGAAAACATATAAACAAAATGGTAAATTAGACAAAAAAAAAAAATCCTAAAAACTACATATGAAAAGGTTCA TTACCAAAGAAGT。

利用本发明的专用引物鉴定甜瓜的分子标记方法，其特征是提取甜瓜待检测样品的基因组DNA作为模板，利用分子标记专用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。

1)利用CTAB法提取待测甜瓜样品任意组织或器官的基因组DNA。

2)以步骤1所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记特异性引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。

3)利用聚丙烯凝胶电泳技术，对步骤2所得的PCR扩增产物进行电泳分离。

4)利用银染对PCR扩增产物进行染色。

5)通过判断扩增产物的大小，扩增产物较小的为235bp的DNA片段，含有235bp扩增产物的待测样品为单性雌花甜瓜材料；不含有235bp扩增产物的待测样品为非单性雌花甜瓜材料。

上述PCR扩增所用的模板为甜瓜基因组DNA。

上述PCR扩增所用的引物为如下：

1)由序列表中序列2所示的单链DNA分子，或者将序列2删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。

2)由序列表中序列3所示的单链DNA分子，或者将序列3删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。

本发明公开的一种用于鉴定甜瓜单性雌花的专用引物及分子标记方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

1、使用传统方法进行单性雌花选育时，需要做田间检测，费时费力，易受环境影响；而本方法采用DNA检测的方式，不受环境影响。

2、从检测时间上来说，传统方法的检测需要在开花期进行，而本方法在苗期或种子期即可进行检测，检测的时间更早。

3、现有技术中与ACS-7连锁标记少，无共分离标记，而本发明中的抗性基因可以做到与ACS-7共分离。

4、传统方法对于单性雌花的筛选达不到100％，而本方法的准确性可达到100％。

综上所述，本发明方法特异性好，准确率高，具有不受环境影响的优势，且对单性雌花甜瓜材料进行很好的区分，也可区分纯合与杂合。因此，本发明获得了一个可以高效、准确区分甜瓜是否为单性雌花材料的分子标记。

附图说明

图1为甜瓜单性雌花与两性花田间表型鉴定：Oa831为单性雌花甜瓜材料，Oa808为两性花甜瓜材料。

图2为本发明的分子标记的鉴定结果：其中M表示DNA Marker，其余泳道为不同样品的PCR扩增产物的电泳结果，分别为：1号表示单性雌花Oa831材料的鉴定结果， 2号表示两性花Oa808的鉴定结果，F1表示Oa831与Oa808杂交的F1代材料鉴定结果，其余为F2代材料的鉴定结果。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例中的甜瓜材料Oa831、Oa808及F1代材料，公众可从天津大学植物资源及育种实验室获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。

实施例1、分子标记的获得

甜瓜基因CmACS-7是调节甜瓜花性型的重要调控因子，利用甜瓜基因组重测序信息，在该基因所在位置附近区域，获得1个InDel分子标记TJcM01，其序列如序列表中序列 1所示。为利用该InDel位点，设计了合适的特异性引物，包括上游引物F和下游引物R，引物序列如下：

上游引物F：CCAAATCTTCGCACCTGAACATTAAC

下游引物R：ACTTCTTTGGTAATGAACCTTTTCATATGTAG

实施例2、甜瓜材料Oa831、Oa808及F2代分离群体的获得及材料花性型的鉴定

甜瓜材料Oa831为母本，Oa808为父本，进行杂交获得F1代，F1代自交获得F2代甜瓜材料。在田间正常培养，待开花期观察材料的花性型，根据处于开放状态的花朵是否含有雄蕊、雌蕊，确定Oa831为单性雌花材料，Oa808为两性花材料，F1代为单性雌花材料，39株F2甜瓜植株中，27株表现为单性雌花材料，12株表现为两性花材料。

实施例3、分子标记在鉴定甜瓜是否为单性雌花甜瓜中的应用

对实施例2中的甜瓜材料，利用CTAB法提取叶片的基因组DNA，具体的步骤为：取甜瓜幼嫩叶片0.2g入1.5mL离心管中，加50μL 2％CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400μL，65℃水浴30min；加入400μL氯仿：异戊醇(24:1)，轻摇5min。12000 rpm离心5min；取上清200μL，加入预冷的异丙醇200μL混匀，-20℃放置20min；12000 rpm离心10min；弃上清，加入150μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100μL溶解DNA，室温放置1h；用蒸馏水将DNA稀释到50ng/μL，作为PCR模板使用或-20℃保存备用。

以上述甜瓜基因组DNA为模板，实施例1中的上游引物F和和下游R为引物，进行PCR扩增，采用10μL的反应体系，包括：

PCR扩增采用的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。

对PCR扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中，140v恒压电泳90min，对凝胶进行染色，观察结果。也可以将特异性引物及PCR的其他成分制成试剂盒，用于鉴定甜瓜是否为单性雌花甜瓜。

从结果中可以发现，单性雌花材料Oa831中仅扩增出一条235bp的条带，两性花材料Oa808中仅扩增出一条263bp的条带，F1代材料同时扩增出263和235bp的条带。F2 代群体中，表型鉴定为两性花的12株材料中，均只扩增出了一条263bp的条带，与两性花材料Oa808相同；表型鉴定为单性雌花的27株材料中，7株只扩增出235bp的条带，与单性雌花材料Oa831相同，为纯合的单性雌花甜瓜材料，20株同时扩增出235bp和 263bp的条带，与F1代甜瓜材料相同，为杂合的单性雌花甜瓜材料。分子标记鉴定结果与甜瓜花性型的的表型鉴定结果一致。

综合以上结果可知，利用序列表中序列1所示的InDel标记TJcM01，及其序列2和序列3所示的特异引物对待鉴定甜瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增，电泳分离，银染检测后，发现甜瓜花性型的鉴定结果与田间表型鉴定结果一致，表明本发明提供的 InDel标记TJcM01及其特异引物可以用于对甜瓜花性型进行辅助筛选和鉴定，筛选或者辅助筛选具有单性雌花的甜瓜品系或品种。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种用于鉴定甜瓜单性花的分子标记物TJcM01及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 235

<212> DNA

<213> PCR扩增产物

<400> 1

CCAAATCTTC GCACCTGAAC ATTAACAAAA TTATATAGTA ATTATCTTAA TTAATTATCC 60

TCATCGATAA AGTGAATATC TAATTAAAAA TTTAAAGTCA AAAGTGTGAA TTTCTTGAAA 120

TATCAAATTA AGACAAAATT CAAATCAATT TGAAAACATA TAAACAAAAT GGTAAATTAG 180

ACAAAAAAAA AAAATCCTAA AAACTACATA TGAAAAGGTT CATTACCAAA GAAGT 235

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CCAAATCTTCGCACCTGAACATTAAC 26

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ACTTCTTTGGTAATGAACCTTTTCATATGTAG 32

Claims (3)

1.一种鉴定甜瓜单性花的分子标记TJcM01的专用引物其特征在于：所述引物为从5`端到3`端的第1-26位的单链DNA序列的正向引物CCAAATCTTCGCACCTGAACATTAAC；从5`端到3`端的第1-32位单链DNA序列的反向引物ACTTCTTTGGTAATGAACCTTTTCATATGTAG。

2.利用权利要求1的专用引物鉴定甜瓜单性花的分子标记方法，其提取甜瓜待检测样品的基因组DNA作为模板，利用分子标记专用引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤如下：

1)利用CTAB法提取待测甜瓜样品任意组织或器官的基因组DNA；

2)以步骤1所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记特异性引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)利用聚丙烯凝胶电泳技术，对步骤2所得的PCR扩增产物进行电泳分离；

4)利用银染对PCR扩增产物进行染色；

5)通过判断扩增产物的大小，扩增产物较小的为235bp的DNA片段，含有235bp扩增产物的待测样品为单性雌花甜瓜材料；不含有235bp扩增产物的待测样品为非单性雌花甜瓜材料。