CN110079629A - 一种西瓜短蔓紧密连锁的snp标记、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西瓜短蔓紧密连锁的SNP标记、检测方法及应用，本发明的SNP标记在幼苗期就可以准确、快速鉴定短蔓性状，具有效率高、限制因素少等优点；本发明的SNP标记提高了选育短蔓株型的效率，缩短了育种周期；本发明对西瓜分子标记辅助选择育种，提高西瓜杂交育种和制种效率，保障制种质量等方面具有重要意义。

Description

一种西瓜短蔓紧密连锁的SNP标记、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，更具体的说是涉及一种西瓜短蔓紧密连锁的SNP标记、检测方法及应用。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)，为葫芦科(Cucurbitaceae)西瓜属(Citrullus)，是一年生蔓生草本植物，原产于非洲，其果实汁多味美、营养丰富，是一种重要的园艺作物。中国是西瓜生产与消费大国，其栽培面积和产量在十大水果中居第4位，其产业的发展对于增加农民收入、推动农村经济发展具有重要作用。

株高是作物的重要农艺性状之一，矮生性状包括矮秆、短蔓、紧凑株型和丛生等。蔓长作为重要的农艺性状，对改良西瓜的株型具有重要作用，因此长期以来一直是育种家的研究重点。目前，我国大面积栽培的西瓜为长蔓品种，蔓较长，单位面积土地种植密度低，土地利用率低。而西瓜短蔓植株适于高密度栽培，增加产量；短蔓西瓜品种的培育改革西瓜栽培方式，使西瓜生产更简约，省工省力。随着当前西瓜保护地生产的发展和设施条件的改善，为矮生西瓜品种的选育提供了良好的机遇。通过传统育种方法对西瓜短蔓性状的选择需要在茎生长期进行，存在鉴定周期长、效率低的缺点，而利用分子标记辅助选择育种(MAS，molecularmarker-assisted selection)可在苗期完成对短蔓性状的选育，不仅省时省力，而且还可以提高选育的准确性和效率，因此建立西瓜短蔓性状的分子标记辅助选择体系，对提高育种效率和加速育种进程具有重要意义。

西瓜短蔓形态发育的调控网络复杂且精细，由基因、microRNA及激素等共同决定。有关西瓜短蔓基因克隆、调控机理等基础研究较为薄弱，而开发与西瓜短蔓性状紧密连锁的DNA分子标记，能够加速育种进程及有效辅助西瓜短蔓株型的选育。

因此，提供一种西瓜短蔓紧密连锁的SNP标记、检测方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种西瓜短蔓紧密连锁的SNP标记、检测方法及应用，目的是提供一个与西瓜短蔓紧密连锁的分子标记W122218_4，用该分子标记在苗期可准确检测出西瓜植株的蔓长是否为短蔓，为西瓜短蔓分子标记辅助选择技术体系的建立提供帮助。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种西瓜短蔓性状紧密连锁的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2；其中，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与西瓜短蔓性状高度连锁，SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列与西瓜长蔓性状高度连锁。

进一步，一种用于检测西瓜短蔓性状的引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。

进一步，一种用于检测西瓜短蔓性状的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物对。

进一步，上述SNP标记、引物对或试剂盒在西瓜育种中的应用。

进一步，一种检测西瓜短蔓性状的方法，通过检测待测西瓜是否含有上述SNP标记来确定所述西瓜短蔓性状。

进一步，一种检测西瓜短蔓性状的方法，具体包括：

(1)提取待测西瓜的基因组DNA；

(2)利用上述引物对对西瓜基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果，对比所述测序结果与上述SNP标记来确定所述待测西瓜短蔓性状；

或对所述PCR扩增产物用限制性内切酶Hin6I(GCGC)进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测西瓜的短蔓性状。

进一步，所述PCR的扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min，35cycles；72℃，5min。

进一步，通过所述测序结果来确定短蔓性状的具体操作为：当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列一致，表示该植株的西瓜蔓长为短蔓；

当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列不一致且与SEQ ID NO.2序列一致，表示该植株的西瓜蔓长为长蔓。

进一步，通过所述凝胶电泳显示结果来确定蔓长性状的具体操作为：当显示出所述PCR扩增产物可以被限制性内切酶Hin6I(GCGC)切开，表示该植株的西瓜蔓长为短蔓；

当显示出所述PCR扩增产物不可被限制性内切酶Hin6I(GCGC)切开，表示该植株的西瓜蔓长为长蔓。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种西瓜短蔓紧密连锁的SNP标记、检测方法及应用，通过利用基因组重测序技术鉴定SNPs，根据鉴定的SNPs和公布的西瓜基因组数据开发分子标记，并扫描F₂分离群体，结合群体植株的短蔓表型，开发与短蔓调控基因连锁更加紧密的分子标记；本发明开发的分子标记(W122218_4)与短蔓调控基因位点连锁紧密，因而对西瓜短蔓性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于西瓜育种实践。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的M08(长蔓)和21号(短蔓)的表型示意图；

图2附图为本发明提供的分子标记W122218_4在亲本(M08和21号)、F₁及F₂代植株中的多态性电泳图谱；

其中，1：M08；2：21号；3：F₁，M08×21号；

4-13：F₂，M08×21号，短蔓单株，共10株；

14-24：F₂，M08×21号,长蔓单株，共11株。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所示，选择西瓜种质材料M08(长蔓)，材料21号(短蔓)，以M08和21号为亲本，杂交获得F₁代植株，F₁代植株自交构建F₂分离群体。

用CTAB法提取亲本、F₁及F₂分离群体的叶片总DNA：取上部幼嫩叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热的800μl CTAB提取缓冲液，65℃水浴30min；加入氯仿异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混匀后8000r/min离心10min；将上清液转入新的离心管中，加2/3体积的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀；10000r/min离心10min；倒去上清液，用体积分数为75％的乙醇冲洗沉淀两次，倒掉后吸干剩余液体，干燥3min后，用100μl ddH₂O(含0.1％RNA酶)溶解，4℃保存备用。

将亲本M08(长蔓)和21号(短蔓)进行基因组重测序。然后分析数据，获得等位基因SNP及Indel位点的测序频率，并开发与短蔓性状相关联的CAPS或dCAPS分子标记。

具体为：

首先将两个亲本DNA重测序数据比对西瓜参考基因组，寻找两个亲本中等位基因的SNPs及Indel位点，计算这些SNPs及Indel位点在两个亲本测序数据中的测序频率。如果等位基因的SNPs及Indel位点在两个亲本中的测序频率存在显著差异，表明该基因位点可能与目标基因连锁。若染色体的某个区域内密集的存在多个与目标基因连锁的SNPs及Indel位点，表明基因可能位于该染色体区域内。

其次根据测序数据鉴定出的SNPs及Indel位点，在基因所在区域设计一个分子标记，通过扫描F₂分离群体，检测该标记是否与目标性状连锁。若连锁，则继续在目标基因所在区域的外围设计侧翼分子标记，扫描F₂分离群体鉴定交换单株。根据交换单株蔓长表型，将基因定位到两个分子标记之间；进一步在两个分子标记之间继续开发标记(根据鉴定出的SNPs及Indel位点)，扫描交换单株，确定连锁区间。

根据鉴定的SNPs位点及其在参考基因组上的侧翼序列设计引物，参见SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4，以抽提的双亲本、F₁和F₂分离群体DNA为模板分别进行PCR扩增(PCR片段包含SNPs)，PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min；用相应的限制性内切酶对PCR产物进行切割，使用2％琼脂糖凝胶电泳显示结果，亲本、F₁和F₂代的多态性条带具体参见图2，扩增产物的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；从长蔓植株中扩增的PCR片段无法被酶切开，在琼脂糖凝胶上显示长度为740bp的条带，而从短蔓植株中扩增的PCR产物可被酶切成两个小的片段364bp和376bp的条带，片段长度加起来与无法被酶切的长度相同；因此即得到可区分短蔓和长蔓植株的多态性分子标记。

本发明研究得到的上述引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，可以用来鉴定西瓜蔓长是否为短蔓；同样，利用本发明引物对可以制备试剂盒，该试剂盒中至少含有本发明的上述引物对，该试剂盒可用来鉴定短蔓形状。

本发明得到分子标记(名称为W122218_4)的两条核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，长度均为740bp，在染色体上的具体位置为，Chr09:1850519-1851259。

本发明得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与西瓜短蔓形状高度连锁；

本发明得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.2与西瓜长蔓形状高度连锁。

本发明研究得到的上述分子标记(名称为W122218_4)，核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，可以用来鉴定西瓜蔓长是短蔓还是长蔓。

利用本发明的分子标记检测西瓜短蔓形状的方法：提取待测西瓜的基因组DNA，利用上述设计的引物对，对西瓜的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行测序得到其核苷酸序列，比较检测的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列是否一致，如一致(条带可被限制性内切酶Hin6I切开)，表示该植株的蔓长为短蔓，如若不一致，而与SEQ IDNO.2序列一致(条带不可被限制性内切酶Hin6I切开)，则表示该植株的蔓长为长蔓。

本发明利用基因组重测序技术鉴定SNPs，根据鉴定的SNPs和公布的西瓜基因组数据开发分子标记，并扫描F₂分离群体，结合群体植株的蔓长表型，开发与短蔓调控基因连锁更加紧密的分子标记，因而对西瓜短蔓性状分子标记辅助育种体系的建立更有帮助；本发明的分子标记可以简便、快速、高通量地应用于西瓜育种实践。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种西瓜短蔓紧密连锁的SNP标记、检测方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 740

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agtgccccat gcttttgaaa ttggtaacac ctcttttctt tttttttttt aattattatt 60

attaattatt ttttaatttg tccctcttag acaagactca aatcaatctt tatcgattta 120

ttggctgaaa agggagagat tgaccccaaa tttgcatgcg acgtttgaaa atgattaaaa 180

aataaataaa taattaaata aaaccccaac aaaaagaatg ggtttttttt ttttaagggt 240

tctgccgctg agtgatggct aataattttg aaatttaaac taatcattgt caatctctaa 300

ctcttaacta ttattagagt gattatatta acatttattt cgttgacatt ttttcccatt 360

aaagcgctaa aggggaaaaa tgtgtcccaa ccactacaaa ttttcatata gtaatactac 420

tgtcatttgt tactatttaa atagtgtttt ctattagttt actattctca tttaccaaat 480

atcttcgcaa ttaaattgga tctttttttt ctttcatata tatgtttact aattatatca 540

caaaaagtat atatttgggg aagaagtcca tttcttttga tatgtttact tatatcacaa 600

aaaataattg tattaagcta atggagaaga agacttgatt tgctctaata tcatcttaaa 660

ttgtcgatta atccaagacc ttaagctaat aggtaaagac aagatttaat atcattccaa 720

tctaaagcca aacaccacct 740

<210> 2

<211> 740

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

agtgccccat gcttttgaaa ttggtaacac ctcttttctt tttttttttt aattattatt 60

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ttgtcgatta atccaagacc ttaagctaat aggtaaagac aagatttaat atcattccaa 720

tctaaagcca aacaccacct 740

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agtgccccat gcttttgaaa ttggt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aggtggtgtt tggctttaga ttgga 25

Claims (9)

1.一种西瓜短蔓性状紧密连锁的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；其中，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与西瓜短蔓性状高度连锁，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与西瓜长蔓性状高度连锁。

2.一种用于检测西瓜短蔓性状的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。

3.一种用于检测西瓜短蔓性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物对。

4.权利要求1所述的SNP标记、权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在西瓜育种中的应用。

5.一种检测西瓜短蔓性状的方法，其特征在于，通过检测待测西瓜是否含有权利要求1所述的SNP标记来确定所述西瓜短蔓性状。

6.根据权利要求5所述的一种检测西瓜短蔓性状的方法，其特征在于，具体包括：

(1)提取待测西瓜的基因组DNA；

(2)利用权利要求2所述的引物对对西瓜基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果，对比所述测序结果与权利要求1所述的SNP标记来确定所述待测西瓜短蔓性状；

或对所述PCR扩增产物用限制性内切酶Hin6I进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳显示结果来确定所述待测西瓜的短蔓性状。

7.根据权利要求6所述的一种检测西瓜短蔓性状的方法，其特征在于，所述PCR的扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min，35cycles；72℃，5min。

8.根据权利要求6所述的一种检测西瓜短蔓性状的方法，其特征在于，通过所述测序结果来确定短蔓性状的具体操作为：当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列一致，表示该植株的西瓜蔓长为短蔓；

当所述PCR扩增产物的核苷酸序列和SEQ ID NO.1序列不一致且与SEQ ID NO.2序列一致，表示该植株的西瓜蔓长为长蔓。

9.根据权利要求6所述的一种检测西瓜短蔓性状的方法，其特征在于，通过所述凝胶电泳显示结果来确定蔓长性状的具体操作为：当显示出所述PCR扩增产物可以被限制性内切酶Hin6I切开，表示该植株的西瓜蔓长为短蔓；

当显示出所述PCR扩增产物不可被限制性内切酶Hin6I切开，表示该植株的西瓜蔓长为长蔓。