CN110724755B - 一种与西瓜节间长度连锁的caps标记引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组及其应用，属于生物技术领域。所述CAPS标记引物组包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用所述CAPS标记引物组对185份F2分离群体进行节间长度鉴定，结果显示正常节间长度和节间缩短的西瓜鉴定的准确率为100％。本发明不需要经过西瓜伸蔓期鉴定，在苗期就可以准确快速的鉴定出西瓜节间长度，可以提高育种效率，缩短鉴定时间，且还具有工作量小、生产成本低等优点。本发明适用于西瓜的遗传鉴定与育种。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及西瓜育种技术，具体涉及一种与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组及其应用。
背景技术
在传统的选择育种中，因为难以确定后代的基因型，选择的依据通常是植物的表现型而不是基因型，选择时间较长，且表现型易受环境因素的影响，导致选择的不准确和效率较低。分子标记辅助育种以与目标形状紧密连锁分子标记为工具对目标性状进行筛选，通过分子标记以基因型进行种质资源的筛选，具有准确、快速、不受环境条件干扰的优点，避免了传统育种过程中性状选择的盲目性，提高了育种效率。
CAPS标记是对扩增产物进行酶切分析的一种分子标记，具有高通量、简单、稳定、灵敏度高等特定，是目前分子标记辅助育种工作中极具发展前景的分子标记。西瓜是一种重要的园艺作物，我国是世界第一大的西瓜生产和消费大国，然而在西瓜育种过程中，可用的分子标记较少，仍以传统的选择育种为主，效率较低，难以快速获得满足市场需求的新品种。节间长度是西瓜重要的农艺性状，节间较短的节间缩短植株，株型紧凑，适于高密度栽培，在一定程度上能节约土地资源，提高单位面积产量，因此节间缩短西瓜是西瓜育种中很重要的种质资源。因此存在需求开展西瓜节间长度研究，开发可用于西瓜育种的分子标记，以缩短育种进程提高育种效率。
发明内容
为解决上述西瓜育种过程中的技术问题，本发明基于西瓜节间长度的研究，开发一种可用于西瓜育种的分子标记，以缩短育种进程，提高育种效率。具体地，本发明给出一种与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组，利用该CAPS标记引物组能够在苗期准确、快速地鉴定出西瓜蔓长，具有通量大、扩增产物稳定、检测快速等优点，可显著提高西瓜节间长度选择育种效率。
一种与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组，所述CAPS标记引物组包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述与西瓜节间长度连锁的CAPS标记酶切位点位于西瓜第9号染色体第1859049bp处，多态性表现为A/G碱基差异。
本发明还给出了所述的CAPS标记引物组在西瓜育种中的应用。
本发明还进一步给出了所述的CAPS标记引物组在鉴定节间缩短西瓜资源中的应用。
本发明还进一步给出了所述的CAPS标记引物组在鉴定节间缩短西瓜基因型中的应用。
作为本发明所述CAPS标记引物组应用的优选，所述CAPS标记引物组通过PCR方法进行应用。
本发明给出了所述PCR方法，具体包括：
以西瓜基因组DNA为模板DNA进行PCR反应，得PCR扩增产物；
将所述部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分扩增产物进行酶切反应；
酶切所述PCR扩增产物后琼脂糖凝胶电泳；
根据所述酶切产物的带型判断节间长度性状的等位基因型；
扩增片段经TaqI酶切，节间缩短纯合子酶切成638bp的条带，正常节间长度纯合子酶切成172bp和466bp的两条带，正常节间长度杂合子酶切成172bp、466bp和638bp的三条带。
作为本发明所述CAPS标记引物组应用的优选，所述PCR反应体系以20μL计，包括10μL 2×Taq PCR MasterMix，2μL模板DNA，正、反向引物各1μL和6μL ddH2O。
作为本发明所述CAPS标记引物组应用的优选，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
作为本发明所述CAPS标记引物组应用的优选，所述酶切的反应体系以15μL计，包括0.3μL限制酶、1.5μL buffer、3.2μL ddH2O和10μL PCR产物。
与现有技术相比，本发明所述与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组及其应用，具有的有益效果或优点包括：本发明不需要经过西瓜伸蔓期鉴定，在苗期就可以准确快速的鉴定出西瓜节间长度，可以提高育种效率，缩短鉴定时间，且还具有工作量小、生产成本低等优点。利用本发明所述引物组进行西瓜育种时，检测方法准确可靠，操作简便，能够更简单检测西瓜节间长度，从而更好的服务西瓜品种的选育或是改良，在分子辅助育种领域，为节间缩短西瓜品种选育或改良提供了科学依据。
附图说明
图1是本发明所述与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组PCR扩增产物电泳图。
图2是本发明所述酶切产物电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组及其应用进行详细的说明。
一种与西瓜节间长度连锁的CAPS标记引物组，所述CAPS标记引物组包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。CAPS标记引物组的信息见表1。
表1，CAPS标记引物组信息
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | SEQ ID NO |
| F | CCCAAACCCCACCTCACTTT | 1 |
| R | ATACCAACAGGCACGTGGTT | 2 |
在本发明中，所述控制西瓜节间长度基因的CAPS标记酶切位点位于西瓜第9号染色体第1859049bp处，多态性表现为A/G碱基差异。
本发明提供了上述CAPS标记引物组在西瓜育种中的应用。具体地，所述应用包括西瓜杂交育种中节间缩短后代的筛选。通过用节间缩短西瓜资源与常规西瓜品种杂交后，在F2群体中的大批量筛选，以及将节间缩短性状转育到现有的栽培种的后代筛选，借助分子标记跟踪检测，可以快速、准确选育出具有节间缩短性状的西瓜新品种。
本发明所述鉴定通过PCR的方式进行，PCR方法具体包括：
以西瓜基因组DNA为模板DNA进行PCR反应，得PCR扩增产物；
将所述部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分进行酶切反应；
酶切所述PCR产物后琼脂糖凝胶电泳；
根据所述酶切产物的带型判断节间长度性状的等位基因型；
扩增片段经TaqI酶切，结果为节间缩短纯合子得到638bp左右的条带，正常节间长度纯合子酶切成172bp和466bp左右的两条带，正常节间长度杂合子则显示出172bp、466bp和638bp左右的三条带。
本发明利用PCR进行基因型鉴定时，以西瓜基因组DNA为模板DNA进行PCR，得PCR产物。本发明对所述西瓜基因组DNA的来源并没有特殊限定。本发明以所述西瓜基因组DNA为模板DNA进行PCR，所述PCR的反应体系以20μL计，包括10μL 2×Taq PCR MasterMix，2μL模板DNA，正、反向引物各1μL和6μL ddH2O。本发明所述PCR的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。得扩增产物后，本发明将所述部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分扩增产物进行酶切反应。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳的方法并没有特殊限定。在本发明实施例中，PCR扩增产物电泳图如图1所示。
本发明酶切所述PCR产物后琼脂糖凝胶电泳。本发明所述酶切与进行所述PCR时所用引物具有相同的酶切位点。本发明所述酶切的体系以15μL计，优选包括0.3μL限制酶、1.5μL buffer、3.2μL ddH2O和10μLPCR产物，之后再37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳进行多态性检测，在凝胶成像系统中拍照。本发明根据所述酶切产物的带型判断节间长度性状的等位基因型，在本发明实施例中酶解结果的条带如图2所示，扩增片段经TaqI酶切，结果为节间缩短纯合子得到638bp左右的条带，正常节间长度纯合子酶切成172p和466bp左右的两条带，正常节间长度杂合子则显示出172bp、466bp和638bp左右的三条带。
本发明还提供了上述CAPS标记引物组在西瓜育种中的应用。本发明所述CAPS标记引物组在西瓜育种中的应用，可以采用与上述相同的PCR方法进行。
本发明还提供了上述CAPS标记引物组在西瓜杂交育种中节间缩短后代筛选的应用，本发明所述西瓜杂交育种中节间缩短后代的筛选，可以采用与上述相同的PCR方法进行。
实施例1，与西瓜节间长度紧密连锁的CAPS标记引物组的开发
将西瓜节间缩短基因定位在第9号染色体上物理位置9433-34418608区间内，以其中1859049处SNP位点为中心向两侧各扩大了50bp，利用BatchPrimer3对其进行引物设计。针对该标记，以SNP位点具有差异的5份西瓜节间缩短种质材料“短125长果”、“短126花”、“短127绿”、“短128黄”和“短117”，及其他10个正常节间长度西瓜种质材料进行标记检测验证(表2)。具体操作步骤如下：
1、提取待测样品的基因组DNA；
2、扩增含SNP位点的核苷酸片段。PCR的反应体系总体积为20μL，包括10μL 2×TaqPCR MasterMix，2μL模板DNA，正、反向引物各1μL和6μL ddH2O。PCR的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
3、扩增产物质量检测。取5μL扩增产物与1μL Loading buffer混合后，在1％琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统中拍照。
4、酶切反应。酶切反应参照TaKaRa的内切酶操作指南，用限制性核酸内切酶酶切PCR产物，15μL酶切体系包括0.3μL限制酶、1.5μL buffer、3.2μL ddH2O和10μLPCR产物，37℃酶切过夜。
5、酶切产物电泳及其判断。1％的琼脂糖凝胶电泳检测，点样后，在250V直流电压电泳20min左右，在凝胶成像系统中拍照，读取各样品的PCR带型；根据所述酶切产物的带型判断节间长度性状的等位基因型；扩增片段经TaqI酶切，结果为节间缩短纯合子得到638bp左右的条带，正常节间长度纯合子酶切成172bp和466bp左右的两条带，正常节间长度杂合子则显示出172bp、466bp和638bp左右的三条带。
利用上述方法可准确的鉴定西瓜节间缩短和正常节间长度性状，准确率为100％。
表2试验材料及表型
实施例2，与西瓜节间长度紧密连锁的CAPS标记引物组的应用
1、选择节间缩短西瓜资源“短125”与正常节间长度西瓜资源“郑州籽瓜”杂交，得到F1，F1自交得到F2，185份F2分离群体植株为待测样品，提取待测群体的基因组DNA。
2、针对实施例1中的SNP位点，以待测样品基因组DNA为模板，扩增出SNP所在的核苷酸片段。
3、PCR扩增反应条件及酶切方法均同实施例1。根据内切酶酶切产物电泳结果，若仅得到638bp左右的条带，则待测材料为节间缩短类型；做仅得到172bp和466bp左右的两条带，则判定待测材料为正常节间长度；若呈现出三条带，则待测材料为杂合类型，当代表现为正常节间长度。
4、鉴定结果
对185份F2代分离群体植株的检测结果显示，120个为正常节间长度，45个为节间缩短。
综上所述，本发明提供的CAPS标记引物组可以准确快速的鉴定出西瓜节间长度，可以提高育种效率，缩短鉴定时间，适于西瓜的遗传鉴定与育种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的技术启示和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.CAPS标记引物组在西瓜节间缩短性状育种中的应用，所述CAPS标记与西瓜节间长度连锁，酶切突变位点位于西瓜参考基因组第9号染色体第1859409bp处，多态性表现为A或G碱基，所述西瓜参考基因组是西瓜97103 V1版；
所述CAPS标记引物组包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列为5’CCCAAACCCCACCTCACTTT’3，所述反向引物R的核苷酸序列为5’ATACCAACAGGCACGTGGTT’3；
采用所述CAPS标记引物组以西瓜基因组DNA为模板进行PCR反应，得到PCR扩增产物，采用TaqI酶切所述PCR扩增产物，根据酶切产物的带型判断节间长度性状的等位基因型，其中，节间缩短纯合子酶切成638bp的条带，正常节间长度纯合子酶切成172bp和466bp的两条带，正常节间长度杂合子酶切成172bp、466bp和638bp的三条带。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCR反应体系以20μL计，包括10μL 2×Taq PCR Master Mix，2μL模板DNA，正、反向引物各1μL和6μL ddH2O。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酶切的反应体系以15μL计，包括0.3μL限制酶、1.5μL缓冲液、3.2μL ddH2O和10μL PCR产物。
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