CN110331222B

CN110331222B - 一种棉花育性恢复相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110331222B
Application number: CN201910566536.2A
Authority: CN
Inventors: 邢朝柱; 张梦; 吴建勇; 冯娟娟; 郭立平; 戚廷香; 张学贤; 王海林; 唐会妮; 乔秀琴
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-06-27
Also published as: CN110331222A

Abstract

本发明公开了一种棉花育性恢复相关的分子标记及其应用。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测棉花恢复基因的引物对，其由引物1和引物2组成；所述引物1为如下(a)或(b)：(a)序列表中序列2所示的单链DNA分子；(b)将序列表中序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述引物2为如下(c)或(d)：(c)序列表中序列3所示的单链DNA分子；(d)将序列表中序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中序列3具有相同功能的单链DNA分子。本发明的分子标记与棉花育性恢复紧密相关，能够有效用于恢复系和“三系”杂交棉的分子标记辅助选择育种。

Description

一种棉花育性恢复相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学遗传育种技术领域，特别涉及一种棉花育性恢复相关的分子标记及其应用。

背景技术

田间育种实践表明，利用棉花杂种优势可以大幅度提高纤维产量、改进纤维品质以及增强抗逆性。目前，生产上大面积推广的棉花杂交种大多数是由人工去雄授粉杂交获得。然而棉花主产区及周边地区的劳动力成本正逐年提高，导致许多从事杂交棉生产的种子企业难以为继，因此，大力发展简化、高效、低成本的棉花生产已大势所趋。“三系法”杂交制种程序简便，制种成本仅为人工去雄杂交的30-40％，很适合生产上大规模推广和应用。近年来，棉花“三系”杂交种(以哈克尼西棉细胞质雄性不育“三系”材料为主)的审定已经取得了一些进展(如本课题组选育的晋审转基因抗虫三系杂交种中棉所83和国审转基因抗虫三系杂交种中棉所99)，但是由于棉花中恢复基因来源狭窄、易丢失以及育性恢复的分子机制尚不明了，从而阻碍了强恢复力的优异恢复系亲本选育和“三系”杂交种的大面积推广应用。

目前，育种家在生产上主要通过常规的回交改良方法来选育强恢复力的优异恢复系，但是该方法不仅育种年限长，而且转育后每一代都需要大量的测交试验和后代表型性状调查，来确保恢复基因的存在，费时费力；再加上田间表型鉴定易受环境因素等影响，因此，不能准确、真实地判断棉花植株中恢复基因存在与否及位点是否纯合。另一方面，恢复系的种子纯度对于“三系”杂交种制种至关重要，一旦混杂，其后代将会出现不育株，从而严重影响棉花产量和棉农收益。与常规育种技术相比，分子标记辅助选择技术可以从分子水平上直接鉴定出DNA序列的差异，并且不受发育时期、环境因素以及基因是否表达等影响。特别是，插入缺失(Insertion-deletion,InDel)标记具有共显性好、操作简单、准确率高、位点特异性且扩增产物易于检测等优点，近年来已经在辅助选择育种、种质资源鉴定和遗传图谱构建等领域得到了广泛应用。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，迫切需要开发一种与恢复基因共分离的InDel分子标记，并利用该分子标记对恢复基因进行准确、快速而又高效的跟踪，从而实现恢复系和“三系”杂交棉的分子标记辅助选择育种。

本发明提供了一种棉花育性恢复相关的分子标记鉴定方法，旨在解决现有技术中含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系选育时田间鉴定检测方法费时费力、准确性差且恢复系回交改良过程中恢复基因易丢失等问题，从而加快优异恢复系田间选育和回交改良进程，同时保证恢复系和“三系”杂交棉的制种纯度。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了鉴定或辅助鉴定待测棉花恢复基因的引物对。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测棉花恢复基因的引物对，其由引物1和引物2组成；所述引物1为如下(a)或(b)：

(a)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

(b)将序列表中序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下(c)或(d)：

(c)序列表中序列3所示的单链DNA分子；

(d)将序列表中序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。

所述引物1和引物2的摩尔比为1:1。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定待测棉花恢复基因的试剂盒。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测棉花恢复基因的试剂盒，包含由所述引物1和所述引物2组成的引物对。

所述鉴定或辅助鉴定待测棉花恢复基因的引物对在如下(1)-(6)任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)鉴定或辅助鉴定棉花材料是否含有恢复基因及位点是否纯合；

(2)制备鉴定或辅助鉴定棉花材料是否含有恢复基因及位点是否纯合的产品；

(3)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系；

(4)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的产品；

(5)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度；

(6)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度的产品。

所述棉花恢复基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定棉花恢复基因的方法，包括如下步骤：

采用所述引物对对待测棉花样品的基因组DNA进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳分析；根据扩增结果进行判断，标准如下：

如果只扩增出113bp的单一条带，则待测棉花材料不含恢复基因位点；

如果只扩增出182bp的单一条带，则待测棉花材料的恢复基因位点纯合；

如果同时扩增出113bp和182bp这两个条带，则待测棉花材料的恢复基因位点杂合。

PCR扩增反应体系及条件为：

20μl反应体系：内含DNA模板1μl与19μl PCR反应液(10μl康为世纪公司2×Es TaqMasterMix(Dye)，10μM InDel引物对各0.8μl，ddH2O 7.4μl)，混匀。

扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸15sec，30个循环；4℃保存。

所述恢复基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

所述电泳分析为琼脂糖凝胶电泳分析。

鉴定或辅助鉴定棉花恢复基因的方法在如下(1)-(6)任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(3)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系；

(4)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的产品；

(5)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度；

(6)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度的产品。

本发明还提供了棉花恢复系回交改良的方法。

本发明所提供的棉花恢复系回交改良的方法，包括如下步骤：

采用所述的引物对，对用于恢复系回交改良的转育群体从回交一代开始进行分子标记跟踪，每一代从回交群体中选择综合农艺性状优良且恢复基因位点杂合的单株，继续与轮回亲本材料进行回交；这样回交4-6代后，再选择目标优良单株自交，自交后代继续采用所述的引物对进行分子检测，筛选出综合农艺性状优良且恢复基因位点纯合的新恢复系材料。

所述恢复基因位点杂合的单株为含有182bp和113bp两个目标条带的单株；所述恢复基因位点纯合的新恢复系材料为只扩增出182bp的单一条带的新恢复系材料。

本发明以陆地棉“三系”材料：哈克尼西棉细胞质雄性不育系ZBA、保持系ZB和恢复系中恢46(H46)为亲本，分别构建了恢复基因近等基因系和F2分离群体，结合本课题组前期定位结果，利用BSA测序以及亲本重测序数据，对恢复基因进行精细定位，并成功筛选到了一个与恢复基因共分离的InDel分子标记。

根据本发明的实施例，所述分子标记表现为SEQ ID No.1所示的一段长度为69bp的特异插入片段，其核苷酸序列为：“TATGGTAGTACATTGACATTTATCCATAATCAAAATCAATATATTTGATTAAAGACCGACCAAGTATTT”，各个碱基数为：A：27个；T：24个；G：8个；C：10个；A：39.1％；T：34.8％；G：11.6％；C：14.5％；A+T＝73.9％，G+C＝26.1％。上面所述InDel标记的插入位点在陆地棉染色体Chr_D05：54092053(参考南京农业大学的陆地棉TM-1基因组测序结果)。在恢复系材料中存在这一特异插入片段，而在不含恢复基因的棉花材料如不育系中，则不含有这一特异插入片段。

基于此，依据PCR引物的设计原则，本发明在插入序列两侧设计上、下游引物，成功将其转化为一个InDel分子标记，引物对的序列如下所示：

正向引物：5'-TTCCAACTTAACGGGGCTCTA-3'(SEQ ID No.2)；

反向引物：5'-AACATGCAAACTATGAAATGG-3'(SEQ ID No.3)。

本发明的分子标记与棉花育性恢复紧密相关，能够有效用于恢复系和“三系”杂交棉的分子标记辅助选择育种。进而能够针对恢复系选育过程中恢复基因易丢失的问题，利用本发明的InDel分子标记对用于恢复系回交改良的转育群体进行早期选择(如苗期)，即可判定优良单株中恢复基因存在与否，从而有效提高恢复系育种的选择效率和准确性。例如，利用该分子标记的特异性引物对(SEQ ID No.2-3)对待测棉花植株叶片基因组DNA进行简单的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，选择扩增产物仅为182bp单一条带的棉花植株，即可快速筛选出恢复基因位点纯合的棉花单株，从而直接应用于后续分子育种实践中。

根据本发明的实施例，其另一个用途在于，利用SEQ ID No.2-3所示的引物对在室内鉴定棉花恢复系的种子纯度以及恢复系回交改良中的应用。

本发明的棉花育性恢复相关的分子标记具有如下优点：

(1)早期选择：本发明提供的棉花育性恢复相关的分子标记不受棉花生长发育阶段的限制，在生长早期(如苗期)就可以室内鉴定棉花植株中恢复基因存在与否及位点是否纯合，无需进行测交后代表型鉴定，从而显著加快棉花恢复系的育种进程。

(2)简单实用、易操作：本发明所涉及的DNA提取、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测等程序都是简单的加样过程，便于普通技术人员操作，具有良好的商业化应用前景。

(3)低成本、低污染：之前报道的恢复基因相关的分子标记，如SSR标记需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染等繁琐且有污染的技术进行检测，CAPS标记则需要昂贵的限制性内切酶进行酶切，而本发明的InDel标记只需通过简单的琼脂糖凝胶电泳检测即可，从而显著节约了检测成本。

(4)速度快、准确率高：一般来说，常规育种中恢复系的选育过程需要大量的测交试验和后代表型性状调查，费时费力；而且田间表型鉴定易受环境因素等影响，因此，不能准确、真实地判断棉花植株中恢复基因存在与否及位点是否纯合。而本发明的InDel标记具有共显性好、准确可靠、重复性好等优点，只需对提取的DNA进行简单的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳即可从分子水平上区分出棉花恢复系、三系杂交种以及常规种，而且不受外界环境因素等影响，提高了恢复基因鉴定的准确性。

本发明的附加方面和其它优点将在下面的实施例中部分给出，部分将从下面的具体描述中变得浅显易懂，或通过本发明的实践中了解到。

附图说明

本发明上述和/或附加的方面和优点，从下面的附图对实施例的描述中将变得明显和易于理解，其中：

图1为本发明实施例3所述，哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系及其它材料InDel标记分析的电泳检测结果图(1.8％Agarose)，其中泳道M为Marker；1-4泳道分别为课题组已有的4个恢复系材料：中恢46(H46)、中恢80(H80)、DR和ZR；5和6泳道分别为中棉所83和中棉所99，7-10泳道分别为4个常规棉品种：中棉所45、中棉所69、中棉所100和中棉所110。

图2为本发明实施例4所述，利用具有SEQ ID NO.2-3所示核苷酸序列的引物对哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系H46种子进行纯度鉴定的电泳检测结果图(1.5％Agarose)，其中泳道M为Marker，泳道2为对照不育系，泳道1、3-24为待测恢复系H46种子。

图3为本发明实施例4所述，利用具有SEQ ID NO.2-3所示核苷酸序列的引物对哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系H80种子进行纯度鉴定的电泳检测结果图(1.5％Agarose)，其中泳道M为Marker，泳道2为对照不育系，泳道1、3-24为待测恢复系H80种子。

图4为本发明实施例4所述，利用具有SEQ ID NO.2-3所示核苷酸序列的引物对哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系DR种子进行纯度鉴定的电泳检测结果图(1.8％Agarose)，其中泳道M为Marker，泳道2为对照不育系，泳道1、3-24为待测恢复系DR种子。

图5为本发明实施例4所述，利用具有SEQ ID NO.2-3所示核苷酸序列的引物对哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系ZR种子进行纯度鉴定的电泳检测结果图(1.8％Agarose)，其中泳道M为Marker，泳道2为对照不育系，泳道1、3-24为待测恢复系ZR种子。

图6为本发明实施例5所述，利用具有SEQ ID NO.2-3所示核苷酸序列的引物对恢复基因近等基因系群体(BC₅F₁)植株进行PCR扩增的产物电泳检测结果图(2.5％Agarose)。

图7为本发明实施例5所述，利用具有SEQ ID NO.2-3所示核苷酸序列的引物对BC₅F₂群体植株进行PCR扩增的产物电泳检测结果图(1.5％Agarose)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。这里需要特别指出，以下描述的实施例是示例性的，仅用于解释和说明本发明，但不能理解为对本发明的限制。

生物材料的来源：

中恢46(H46)：保藏号：CGMCC5166，记载过中恢46(H46)的非专利文献是：Wu J,Zhang M,Zhang X,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,Xing C.Development of InDelmarkers for the restorer gene Rf1and assessment of their utility for marker-assisted selection in cotton.Euphytica 2017,213(11).

中恢80(H80)：保藏号：CGMCC5167，记载过中恢80(H80)的非专利文献是：Wu J,Zhang M,Zhang X,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,Xing C.Development of InDelmarkers for the restorer gene Rf1and assessment of their utility for marker-assisted selection in cotton.Euphytica 2017,213(11).

DR：公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：WuJ,Zhang M,Zhang X,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,Xing C.Development ofInDel markers for the restorer gene Rf1 and assessment of their utility formarker-assisted selection in cotton.Euphytica 2017,213(11).

ZR：公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：WuJ,Zhang M,Zhang X,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,Xing C.Development ofInDel markers for the restorer gene Rf1 and assessment of their utility formarker-assisted selection in cotton.Euphytica 2017,213(11).

中棉所83：审定编号：晋审棉2011003

中棉所99：审定编号：国审棉2016013

中棉所45：审定编号：国审棉2003002/品种权授权号：CNA20050564.5

中棉所69：审定编号：豫审棉2008002/晋引棉2014001

中棉所100：审定编号：国审棉2016003

中棉所110：审定编号：国审棉20180001/豫审棉201800003

哈克尼西棉细胞质雄性不育系ZBA：公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Wu J,Cao X,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,XingC.Development of a candidate gene marker for Rf1 based on a PPR gene incytoplasmic male sterile CMS-D2 Upland cotton.Molecular Breeding 2014,34(1):231-240.

保持系ZB：公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Wu J,Zhang M,Zhang X,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,Xing C.Developmentof InDel markers for the restorer gene Rf1 and assessment of their utilityfor marker-assisted selection in cotton.Euphytica 2017,213(11).

实施例1、基因组DNA的提取

利用改良的CTAB法分别提取4个恢复系材料：中恢46(H46)、中恢80(H80)、DR和ZR，2个转基因抗虫三系杂交种中棉所83和中棉所99，以及4个常规棉品种：中棉所45、中棉所69、中棉所100和中棉所110共10个材料的种子(或者叶片)基因组DNA，具体方法如下：

(1)首先将棉花种子剥去外壳，每粒种子单独研磨成粉末后转移至1个2ml的离心管，并迅速加入800μl已预热的CTAB裂解液(65℃)，颠倒混匀后置于65℃水浴锅30-40min，且每间隔10min缓慢颠倒混匀一次。

(2)水浴结束后，取出离心管，加入800μl氯仿：异戊醇(24:1)，反复颠倒约30-50次，颠倒混匀至不分层为止。

(3)4℃条件下，12000rpm离心10min。

(4)用无尖的1ml蓝色大枪头吸取上清液(约700μl)并转移至另一个2ml离心管中。

(5)再次加入与上清液等体积(约700μl)的氯仿：异戊醇(24:1)，来回颠倒约30-50次，混匀。

(6)4℃条件下，12000rpm离心10min。

(7)同样用无尖的1ml蓝色枪头吸取上清液(约600μl)并转移至另一个1.5ml离心管中。

(8)加入0.8倍体积(约480μl)的冰冷异丙醇(-20℃冰箱放置)，颠倒约20-30次，直至有絮状DNA生成，-20℃冰箱静置30min。

(9)再用200μl黄色小枪头挑出DNA至另一个1.5ml离心管中，依次加入100-300μl75％乙醇洗1-2次，100-300μl无水或95％乙醇洗1次。

(10)倒去无水或95％乙醇，倒置管壁，置于超净工作台中过夜干燥。再加入200-500μl ddH2O,室温下溶解DNA，直至完全溶解，测定浓度后稀释到10-50ng/μl，4℃短期或-20℃长期保存备用。

实施例2、基因定位和分子标记开发

(1)群体构建与育性调查

本试验以陆地棉“三系”材料：哈克尼西棉细胞质雄性不育系ZBA、保持系ZB和恢复系中恢46(H46)为亲本，分别构建了恢复基因近等基因系和F₂分离群体。试验材料种植于中国农业科学院棉花研究所东场试验基地(河南省安阳县白璧镇东；36°10’N,114°35‘E)，田间按照常规方法管理。育性调查方法为：在7月上旬至8月中下旬的开花期间，尽量选择晴朗的天气，从早上9点左右开始调查恢复基因近等基因系和F₂群体中单株的育性。为了提高群体育性调查的准确性，一共调查5次，每株至少观察3个花朵。根据手指捻破花药是否出现花粉为标准，来判断棉花单株的育性。

(2)基因定位

恢复基因近等基因系和F₂群体单株叶片DNA提取程序参照实施例1。分别随机选取恢复基因近等基因系可育单株和不育单株各100株的总DNA等量混合构建成可育DNA池和不育DNA池进行全基因组重测序(BSA-seq)。利用亲本间多态性SSR标记将恢复基因定位至BNL3535与NAU3652这两个SSR标记之间，其遗传距离分别为0.049cM和0.078cM(Wu J,CaoX,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,Xing C.Development of a candidate genemarker for Rf1 based on a PPR gene in cytoplasmic male sterile CMS-D2 Uplandcotton.Molecular Breeding 2014,34(1):231-240.)。然后在这两个标记之间，我们获取其物理图谱位置得到参考序列后，基于BSA-seq结果，在目标定位区间开发新的SNP标记和InDel标记(Oligo 7设计)，筛选获得了在两亲本及可育DNA池和不育DNA池之间有多态性的分子标记。最后，利用新开发的多态性标记对F₂分离群体中2500个单株进行基因分型(按a、b、h读取基因型数据)，并结合单株的表型数据，从而对恢复基因进行精细定位，成功筛选到了一个与恢复基因共分离的InDel分子标记。这是基于比较小的遗传群体获得的目的基因初步定位结果，再利用近年来发展起来的新技术BSA-seq结果，在目标定位区间开发新的SNP标记和InDel标记，利用新开发的多态性标记对重新构建的比较大的F2分离群体中2500个单株进行基因分型，从而对恢复基因进行精细定位，筛选到的与目的基因共分离的分子标记。

(3)分子标记开发

将亲本恢复系H46和不育系ZBA进行全基因组重测序和序列比较，结合上述筛选到的与哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因共分离的分子标记，在恢复系中恢复基因目标定位区域内鉴定到一段长度为69bp的特异插入片段，其核苷酸序列为：“TATGGTAGTACATTGACATTTATCCATAATCAAAATCAATATATTTGATTAAAGACCGACCAAGTATTT”(SEQ ID No.1)，各个碱基数为：A：27个；T：24个；G：8个；C：10个；A：39.1％；T：34.8％；G：11.6％；C：14.5％；A+T＝73.9％，G+C＝26.1％。而在不含恢复基因的棉花材料如不育系中，则不含有这一特异插入片段。

基于此，依据一般PCR引物的设计原则，在插入序列两侧设计上、下游引物，成功将其转化为一个InDel分子标记，引物对的序列如下所示：

正向引物：5'-TTCCAACTTAACGGGGCTCTA-3'(SEQ ID No.2)；

反向引物：5'-AACATGCAAACTATGAAATGG-3'(SEQ ID No.3)。

实施例3、分子标记的育性恢复相关性验证

利用上述引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该InDel分子标记的多态性和扩增稳定性。具体地，以实施例1中提取的10个棉花材料种子基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，其中：

(1)PCR反应体系及条件：

(2)结果分析：

PCR扩增结束后，用移液器吸取6-10μl扩增产物点样至浓度为1.5-3％琼脂糖凝胶中(注意制胶时需添加浓度为0.4‰-0.5‰的GelRed^TM，采购于Biotium公司)，然后在电泳缓冲液1×TBE中进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察，结果如图1所示(1.8％中，M代表TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(泳道中6个条带由下及上依次为：100bp、250bp、500bp、750bp、1,000bp、2,000bp；其中750bp是指示带，显示亮带；上样量为5ul，下同)，1-4泳道分别为课题组已有的4个恢复系材料：中恢46(H46)、中恢80(H80)、DR和ZR，5和6泳道分别为课题组近年来选育的晋审转基因抗虫三系杂交种中棉所83和国审转基因抗虫三系杂交种中棉所99，7-10泳道分别为4个常规棉品种：中棉所45、中棉所69、中棉所100和中棉所110。图1的结果显示，4个恢复系材料仅在以DL2,000 DNA Marker为标准的182bp处检测到单一目标条带；恢复基因位点杂合的“三系”杂交种中棉所83和中棉所99在以DL2,000 DNAMarker为标准的182bp和113bp处均能检测到目标条带；不含恢复基因的4个常规棉品种则仅在以DL2,000 DNA Marker为标准的113bp处检测到单一目标条带。

实施例4、哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系种子纯度鉴定

首先，以实施例1中所述的基因组DNA的提取方法，对课题组已有的4个哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系材料的种子进行DNA提取。然后，参照实施例3中的PCR反应体系及条件，利用具有SEQIDNO.2-3所示核苷酸序列的InDel标记引物对4个恢复系各随机抽取的23粒种子DNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果分别见图2、图3、图4和图5(1.5％or 1.8％Agarose)。图2的结果显示，与对照不育系(2泳道)的113bp带型相比，恢复系H46的种子仅能在以DL2,000 DNA Marker为标准的182bp处检测到单一目标条带(1,3-24泳道)；图3的结果显示，与对照不育系(2泳道)的113bp带型相比，恢复系H80的种子仅能在以DL2,000 DNAMarker为标准的182bp处检测到单一目标条带(1,3-24泳道)；图4的结果显示，与对照不育系(2泳道)的113bp带型相比，恢复系DR的种子仅能在以DL2,000 DNA Marker为标准的182bp处检测到单一目标条带(1,3-24泳道)；图5的结果显示，与对照不育系(2泳道)的113bp带型相比，恢复系ZR的种子仅能在以DL2,000 DNA Marker为标准的182bp处检测到单一目标条带(1,3-24泳道)。以上图2至图5的结果说明4个待测恢复系种子的纯度均达到100％，可以直接用于后续“三系”杂交棉制种。

实施例5、哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系分子标记辅助选择改良

DNA提取程序参照实施例1。利用具有SEQIDNO.2-3所示核苷酸序列的InDel标记引物对24个恢复基因近等基因系群体(BC₅F₁)植株DNA进行PCR扩增的产物电泳检测结果见图6(2.5％Agarose)。如图6所示，不含恢复基因的单株仅能在以DL2,000 DNA Marker为标准的113bp处检测到单一目标条带，而恢复基因位点杂合的单株则同时检测到182bp和113bp。

BC₅F₁的获得方法请见非专利文献：Wu J,Cao X,Guo L,Qi T,Wang H,Tang H,Zhang J,Xing C.Development of a candidate gene marker for Rf1 based on a PPRgene in cytoplasmic male sterile CMS-D2 Upland cotton.Molecular Breeding2014,34(1):231-240.具体方法为：哈克尼西棉细胞质雄性不育系ZBA[S(rf₁rf₁)]作为母本与父本恢复系中恢46(H46)[N(Rf₁Rf₁)]杂交得到可育的F₁[S(Rf₁rf₁)]，F₁作为母本再与ZBA的同核异质系保持系ZB[N(rf₁rf₁)]杂交得到BC₁F₁，后续在每一代回交群体中选择可育单株[S(Rf₁rf₁)]作为母本，与轮回亲本ZB连续回交5代后所得即为BC₅F₁群体，理论上可育[S(Rf₁rf₁)]和不育[S(rf₁rf₁)]单株比例近似为1:1。

上述182bp DNA序列(包含69bp插入片段，加粗部分)为：

上述113bp DNA序列(不包含69bp插入片段)为：TTCCAACTTAACGGGGCTCTAGCAAGAGTAGATAGATATATCCTACTCAAAGATTAAATCAACATCTATGGTTTCAAAAGATACCGTAAAATCCATTTCATAGTTTGCATGTT(SEQ ID No.5)。

此外，利用具有SEQIDNO.2-3所示核苷酸序列的InDel标记引物对24个BC₅F₂群体植株DNA进行PCR扩增的产物电泳检测结果见图7(1.5％Agarose)，我们一共发现了3种不同带型的单株。其中，恢复基因位点纯合的单株仅扩增出182bp的单一目标条带；恢复基因位点杂合的单株在182bp和113bp处均能检测到目标条带；而不含恢复基因的单株仅能在113bp处检测到单一目标条带。由此证明，该InDel分子标记(SEQIDNO.1所示的核酸序列)在恢复系和不含恢复基因材料之间具有多态性，与棉花育性恢复性状紧密相关。

BC₅F₂的获得方法为：在BC₅F₁群体中选择目的基因Rf1处于杂合状态的可育单株[S(Rf1rf1)]进行自交的后代群体即为BC₅F₂，一共获得三种基因型即纯合可育[S(Rf₁Rf₁)]:杂合可育[S(Rf₁rf₁)]:不育[S(rf₁rf₁)]＝1:2:1，符合孟德尔遗传定律即育性恢复是由显性单基因控制的性状。由于目的基因未知，本发明筛选与目的基因共分离即一起遗传的分子标记来时刻追踪目的基因，从而进行恢复系的分子标记辅助育种。

基于此，在育种实践上，可以利用具有SEQ ID NO.2-3所示核苷酸序列的InDel标记引物对用于恢复系回交改良的转育群体从回交一代便开始进行分子标记跟踪，即每一代从回交群体中选择综合农艺性状优良且恢复基因位点杂合的单株(即含有182bp和113bp两个目标条带)继续与轮回亲本(父本)材料进行回交。这样回交4-6代后，再选择目标优良单株自交，自交后代继续利用InDel标记(SEQ ID NO.2-3)进行分子检测，即可快速筛选出综合农艺性状优良且恢复基因位点纯合的新恢复系材料。

因此，本发明为建立棉花恢复系分子标记辅助选择系统和有效利用恢复基因资源创造了有利条件，可加快优异恢复系和“三系”杂交棉的选育进程，且结果准确可靠。

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 一种棉花育性恢复相关的分子标记及其应用

<130> SPI19124

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> 棉花恢复系

<400> 1

tatggtagta cattgacatt tatccataat caaaatcaat atatttgatt aaagaccgac 60

caagtattt 69

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正向引物

<400> 2

ttccaactta acggggctct a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反向引物

<400> 3

aacatgcaaa ctatgaaatg g 21

<210> 4

<211> 182

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 182 bp DNA序列

<400> 4

ttccaactta ccggggctgt agcaagagta aatagatata tggtagtaca ttgacattta 60

tccataatca aaatcaatat atttgattaa agaccgacca agtattttat cctactcaaa 120

gattaaatca acatctatgg tttcaaaaga taccgtaaaa tccatttcat agtttgcatg 180

tt 182

<210> 5

<211> 113

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 113 bp DNA序列

<400> 5

ttccaactta acggggctct agcaagagta gatagatata tcctactcaa agattaaatc 60

aacatctatg gtttcaaaag ataccgtaaa atccatttca tagtttgcat gtt 113

Claims

1.鉴定或辅助鉴定待测棉花恢复基因的引物对，其由引物1和引物2组成；所述引物1为序列表中序列2所示的单链DNA分子；所述引物2为序列表中序列3所示的单链DNA分子；所述棉花恢复基因的InDel分子标记为序列表中序列1所示的DNA分子；所述引物对用于检测所述棉花恢复基因的InDel分子标记。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物1和引物2的摩尔比为1:1。

3.权利要求1或权利要求2所述的引物对在如下(1)-(6)任一中的应用：

(3)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系；

(4)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的产品；

(5)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度；

(6)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度的产品。

4.一种鉴定或辅助鉴定棉花恢复基因的方法，包括如下步骤：

采用权利要求1或2所述的引物对对待测棉花样品的基因组DNA进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳分析；根据扩增结果进行判断，标准如下：

如果同时扩增出113bp和182bp这两个条带，则待测棉花材料的恢复基因位点杂合；

所述恢复基因的InDel分子标记为序列表中序列1所示的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述电泳分析为琼脂糖凝胶电泳分析。

6.权利要求4所述的方法在如下(1)-(6)任一中的应用：

(3)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系；

(4)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的产品；

(5)鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度；

(6)制备鉴定或辅助鉴定棉花恢复系的种子纯度的产品。

7.棉花恢复系回交改良的方法，包括如下步骤：

采用权利要求1或2所述的引物对，对用于恢复系回交改良的转育群体从回交一代开始进行分子标记跟踪，每一代从回交群体中选择综合农艺性状优良且恢复基因位点杂合的单株，继续与轮回亲本材料进行回交；这样回交4-6代后，再选择目标优良单株自交，自交后代继续采用权利要求1或2所述的引物对进行分子检测，筛选出综合农艺性状优良且恢复基因位点纯合的新恢复系材料。

8.根据权利要求7所述的棉花恢复系回交改良的方法，其特征在于：所述恢复基因位点杂合的单株为含有182bp和113bp两个目标条带的单株；所述恢复基因位点纯合的新恢复系材料为只扩增出182bp的单一条带的新恢复系材料。