CN116590453B - 一个与莲植株矮化性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个与莲植株矮化性状相关的SNP分子标记及其应用。本发明利用BSA‑Seq和遗传连锁分析的方法，在莲中首次定位了一个控制植株矮化的隐性基因，筛选到一个与基因共分离的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于第1号染色体第143369132碱基，该处碱基为C或T，并开发了扩增该SNP分子标记的PARMS引物(序列如SEQ ID No:3‑5所示)，可以用来预测、鉴定和筛选莲矮化植株，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲矮化植株性状，提高了工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及一个与莲植株矮化性状相关的SNP分子标记及其应用，属于分子生物学及作物育种技术领域。
背景技术
株高是影响植物株型的重要性状，作物株高与其抗倒伏能力、光合效率、产量密切相关。株高的遗传调控研究主要在大田作物中展开。上个世纪中叶，在水稻和小麦育种中兴起了第一次绿色革命，通过研究株高的遗传调控机制和关键基因，为株型育种提供了理论基础，最终成功选育出半矮杆品种，实现了株型的改良。
莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)，又称莲藕、荷花等。莲(荷花)是中国的传统名花，中国是莲的世界分布中心和栽培中心。莲是重要水生观赏花卉植物，品种丰富，在水体绿化、湿地建设、生态恢复和庭院绿化中发挥着越来越重要的作用。不同的应用生境对莲的株型等观赏性状提出了更高的要求，利用莲丰富的种质资源培育中具有市场竞争力的莲品种，满足现代莲产业发展需求，是目前莲研究领域的重要方向，因此，挖掘控制莲株高性状基因并开发相关分子标记对于莲新品种选育具有重要意义。
目前，关于植物植株矮化方面的分子标记研究较多，例如，CN114517241A公开了一种小麦矮杆基因Rht8的功能KASP分子标记及其应用；CN115873972A公开一种与燕麦株高相关的KASP分子标记及其应用；CN114774568A公开了一种玉米半矮杆基因ZmD13的分子标记(dCAPS标记)及其应用；CN115109862A公开了一种水稻株高控制基因高效应变异的KASP功能标记组及应用；CN115786566A公开了一种与白菜型油菜株高和分枝角度紧密连锁的SSR分子标记及其应用，CN114134247A公开了与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物序列和应用。但迄今为止，控制莲株高性状的基因位点还未见报道，更无法获得其分子标记。
同时，在分子标记的研究方面，传统方法PCR/RE(Polymerase Chain Reaction/Restriction Enzyme)、PAGE等需要电泳基因分型，而本发明采用PARMS(Penta-primerAmplification Refractory Mutation System)进行SNP基因分型。PARMS技术是新开发的一种SNP基因分型技术，该技术利用五条引物(一对通用荧光引物、一对等位基因特异引物和一条反向共用引物)对SNP或短Indel位点进行等位基因特异性扩增，通过荧光扫描进行基因分型。与传统方法相比，PARMS具有操作简便、耗时短和成本低等优势。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一个与莲植株矮化性状相关的SNP分子标记及其应用。本发明利用BSA-Seq和遗传连锁分析的方法，在莲中首次定位一个控制莲株高的隐性基因，定位区间内筛选出一个和基因共分离的SNP分子标记，开发了该SNP标记的PARMS引物。上述的标记和引物可以用来预测、鉴定和筛选莲矮化植株，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲矮化植株性状，提高了工作效率。
本发明的技术方案是：一个与莲植株矮化性状相关的SNP分子标记，其特征是，所述SNP分子标记位于第1号染色体第143369132碱基，该处碱基为C或T；该SNP位点上下游150bp的序列如SEQ ID No:1-2所示。
在其中一些实施例中，所述SNP分子标记的TT基因型对应的莲植株矮化，所述SNP分子标记的CC或CT基因型对应的莲株高正常。
本发明还提供了一种可以扩增上述SNP分子标记的PARMS引物，所述引物包括：序列如SEQ ID No:3所示的正向引物S1-236-F1、序列如SEQ ID No:4所示的正向引物S1-236-F2以及序列如SEQ ID No:5所示的反向引物S1-236-R。
本发明还提供了上述SNP分子标记和PARMS引物在莲分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了上述SNP分子标记和PARMS引物在鉴定莲矮化植株和基因型方面的应用。
上述鉴定莲矮化植株和基因型的具体方法为：采集待检测莲的叶片DNA为模板，利用如SEQ ID No:3-5所示的PARMS扩增引物进行Touchdown PCR扩增，获得扩增产物；PCR产物用QuantStudio 5荧光定量PCR仪Genotyping模式采集FAM和HEX荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图；在基因分型图中，右下角的分型结果为T:T，对应矮化植株样品；中间部分分型结果为T:C，对应株高正常样品，左上角的分型结果为C:C，对应株高正常样品。
本发明的技术效果是：本发明利用BSA-Seq和遗传连锁分析的方法，首次在莲中定位到一个控制莲植株矮化的SNP分子标记，并继而开发了扩增该SNP分子标记的PARMS引物。本发明的SNP分子标记准确性好，根据SNP分子标记和PARMS引物，可以直接用于莲矮化植株和基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲矮化植株性状，提高了工作效率，为莲分子育种提供有效的技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例1中F2群体中的矮化植株和株高正常植株；
图2为本发明实施例1中莲矮化基因定位图；
图3为本发明实施例2中利用SNP分子标记和PARMS引物对F2群体550株单株检测的基因分型图；其中，红色为矮化植株样品，蓝色为株高正常植株样品，绿色为株高正常植株样品，黑色为空白对照。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
在本发明中的其中一个方面，采用结合BSA-Seq和遗传连锁分析方法进行SNP变异位点查找，发现与莲植株矮化性状相关的SNP位点位于1号染色体上，143369132bp位置，该处的碱基为C或T，可作为控制莲植株矮化的SNP分子标记。
在本发明的另一方面，根据查找到的与莲植株矮化相关的SNP分子标记，进一步设计了检测SNP变异位点的PARMS引物。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明所用试剂均有市售。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1:莲植株矮化基因定位、SNP标记及PARMS引物开发
本实施例查找到与莲植株矮化基因的SNP位点，并设计针对该SNP位点的PARMS引物。
具体包括以下步骤：
1、从鄂莲9号(E9)与山东本地莲品种ZW2杂交F1中选择了一个单株(编号F1-005)自交获得150株F2群体，经多年株高鉴定，该F2群体莲可分为两类，一类植株矮化，一类株高正常(图1)。
2、遗传分析：F2群体株高呈典型的双峰分布，经卡平方测验，矮化植株和株高正常植株分离比例符合1∶3，初步预测矮化性状为单隐性基因控制。另外，遗传分析还表明：株高正常的母本ZW2及F1在该位点均为杂合，株高正常的父本E9在该位点为显性纯合。
3、基因定位：选择F2群体中株高最大植株、株高最小植株各30株，分别构建DNA混池，进行BSA-seq分析。结果显示在Chr1上有唯一定位区间(图2a)，进一步证明了矮化性状为单基因控制。
通过双亲基因组重测序数据，针对BSA-seq定位位置附近70Mb区间内高质量SNP位点开发了PARMS标记，对150个F2群体单株进行基因分型，构建了遗传连锁图，各个标记的遗传位置和物理位置顺序完全一致，结合F2群体单株株高数据，把莲藕矮化基因初步定位在分子标记S1-129至S1-119间，遗传距离为5.5cM，该区间物理位置位于上述BSA定位区间范围内。通过加密定位区间分子标记，对400株F2群体进行基因型分析，结合所有植株两年的表型数据，把基因定位于分子标记S1-130和S1-106区间，对应参考基因组558kb(图2b)。根据两个亲本的全基因组重测序数据，查找该定位区间内的SNP变异位点。在143369132bp位置查找到一个SNP位点变异C/T。
3、设计PARMS引物：根据143369132bp位置SNP位点上下游150bp的序列，用PARMS引物设计网站(http://www.snpway.com)设计等位基因特异引物S1-236-F1/S1-236-F2和反向共用引物S1-236-R。
在143369132bp位置SNP位点上下游150bp的序列如下(参见SEQ ID No:1-2)：
GAGTTAATCTCTTAAAAAATGAAGCACATGAGAAAGTACCAAAGGAGGAAGGGGTC CAAAATCTGGTGTCCTCCTTATTAGGGTCCAAGAAGACATTTCGAAGGATGGCTAACAG AGACATGATGCATCCCAAGTCTGTATCCCTAATTG[C/T]CCTTCTTAGGCATAGGTTCCAC CCAAAACTAGAAGAAGAAACAAAAGGGCTTAAGAAGGATGAGATGGGTTCATGTTTCA AATCTGACAGAGCATACAAAGAGGGAAATTGGTCCATCAAGGGTGAATCCCCAACCCAA TGGTGTTCCCA。
引物序列如下，
S1-236-F1(SEQ ID No:3)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGGAACCTATGCCTAAGAAGGG；
S1-236-F2(SEQ ID No:4)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGGAACCTATGCCTAAGAAGGA；
S1-236-R(SEQ ID No:5)：
GACATTTCGAAGGATGGCTAACAG。
实施例2：实施例1的莲矮化基因SNP分子标记及PARMS引物的验证
通过F2群体(将F1-005再次自交获得550个单株)对实施例1查找到的SNP分子标记及PARMS引物进行验证。
具体包括如下步骤：
1、以F2群体基因组550个单株的DNA(利用CTAB法从莲的叶片中提取基因组DNA)为模板，利用分子标记的扩增引物PARMS引物，进行Touchdown PCR扩增，获得扩增产物。
PCR扩增体系(10μl)：5μl 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μl10mM S1-236-F1引物，0.15μl 10mM S1-236-F2引物，0.4μl 10mM反向共用引物S1-236-R，0.5μl模板DNA，3.8μl ddH2O。
PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环。
2、对扩增产物进行检测与分析
检测方法：PCR产物用QuantStudio 5荧光定量PCR仪Genotyping(基因分型)模式采集FAM和HEX荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图(FAM和HEX荧光信号在图中分别显示蓝色和红色图像，杂合信号显示绿色图像)，输出基因型检测结果用于后续分析。
利用实施例1的SNP分子标记及PARMS引物，对F2分离群体(550个单株)进行检测，其中T:T的荧光信号有132个单株，T:C的荧光信号有280个单株，C:C的荧光信号有138个单株。结合550个单株表型分析发现，检测结果与表型一致的准确率为100％。莲矮化基因分型结果如图3所示，图中右下角(红色)的分型结果为T:T，对应矮化植株样品，图中中间部分(绿色)分型结果为T:C，对应株高正常样品，图中左上角(蓝色)的分型结果为C:C，对应株高正常样品，可见，利用该SNP分子标记可用于区分莲株高。
以上结果充分说明，实施例1的SNP分子标记，T与莲矮化植株性状紧密连锁，C或者杂合与莲正常株高紧密连锁。在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到的T:T荧光信号的材料，就能够选育出矮化植株纯合材料；保留检测到C:C荧光信号的材料，就能够选育株高正常纯合材料；保留检测到T:C荧光信号的材料，就能够选育出株高正常杂合材料。通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
本发明的SNP分子标记准确性好，能够用来预测、鉴定和筛选与莲植株矮化相关性状，在苗期可以有效地进行筛选，提高了工作效率，减少后期种植的人力物力财力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种扩增与莲植株矮化性状相关的SNP分子标记的PARMS引物，其特征是，所述引物为：序列如SEQ ID No:3所示的正向引物S1-236-F1，序列如SEQ ID No:4所示的正向引物S1-236-F2以及序列如SEQ ID No:5所示的反向引物S1-236-R；
所述SNP分子标记位于第1号染色体第143369132碱基，该处碱基为C或T；SNP分子标记的TT基因型对应的莲植株矮化，SNP分子标记的CC或CT基因型对应的莲株高正常。
2.SNP分子标记在与莲植株矮化性状相关的莲分子标记辅助育种中的应用，所述SNP分子标记位于第1号染色体第143369132碱基，该处碱基为C或T；SNP分子标记的TT基因型对应的莲植株矮化，SNP分子标记的CC或CT基因型对应的莲株高正常。
3.权利要求1所述的PARMS引物在与莲植株矮化性状相关的莲分子标记辅助育种中的应用。
4.SNP分子标记在与莲植株矮化性状相关的莲矮化植株鉴定和相对应的基因型鉴定方面的应用；所述SNP分子标记位于第1号染色体第143369132碱基，该处碱基为C或T；SNP分子标记的TT基因型对应的莲植株矮化，SNP分子标记的CC或CT基因型对应的莲株高正常。
5.权利要求1所述的PARMS引物在与莲植株矮化性状相关的莲矮化植株鉴定和相对应的基因型鉴定方面的应用。
6.采用权利要求1所述的PARMS引物鉴定与莲植株矮化性状相关的莲矮化植株和相对应的基因型的方法，其特征是：采集待检测莲的叶片DNA为模板，利用如SEQ ID No:3-5所示的PARMS扩增引物进行Touchdown PCR扩增，获得扩增产物；PCR产物用QuantStudio 5荧光定量PCR仪Genotyping模式采集FAM和HEX荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图；在基因分型图中，右下角的分型结果为T:T，对应矮化植株样品；中间部分分型结果为T:C，对应株高正常样品，左上角的分型结果为C:C，对应株高正常样品。
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