CN110331224B - 辣椒疫病抗性基因snp标记5-157及其特异性引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生物技术领域,具体涉及辣椒疫病抗性基因SNP标记5‑157及其特异性引物和应用。本发明确定了辣椒基因组中与辣椒疫病抗性形状相关的SNP位点,应用上述SNP位点,只需在苗期对辣椒植株的DNA检测,就可对辣椒疫病抗性基因进行判断,可以广泛应用到分子标记辅助育种中。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域,具体涉及辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记 5-157及其特异性引物和应用。
背景技术
辣椒疫病是影响辣椒生产的主要病害之一,由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici Leonian)引起,辣椒被疫霉菌侵染后可出现根系坏死,茎、叶和果实腐烂等症状,造成严重损失。经杂交引入疫病抗性基因是培育辣椒抗病品种的主要手段,该方法的难点在于辣椒材料对疫病的抗性遗传规律多样,主要由2个或2个以上多基因控制、单显性基因控制和单显性基因加修饰基因控制模型,并且抗性基因具有小种特异性和危害症状特异性特点。
分子标记辅助育种基于基因型筛选种质资源,避免或降低表型选择的误差,能大大缩短育种进程,是提高转育准确性和效率的重要手段。现有技术公开了多个辣椒疫病抗性分子标记,然而,这些分子标记也存在基因型与表型不一致等问题,影响其在材料筛选和分子标记辅助育种中的应用。针对不同抗性材料开发与相关基因连锁更紧密、适合性更高、检测更高效的分子标记有助于辣椒疫病抗性材料的选择和品种选育。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157。
本发明的再一目的在于提供上述SNP标记的KASP特异性引物。
本发明的再一目的在于提供上述SNP标记和引物的应用。
本发明的再一目的在于提供鉴定抗疫病辣椒的方法。
本发明的再一目的在于提供鉴定抗疫病辣椒的检测试剂盒。
根据本发明具体实施方式的辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157,所述SNP 标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其中SEQ ID No.1所示序列的第25位碱基用R表示,R代表为A或G。
AGTTGTTTAAGGTTTGGAAGATGARGAACTGGAATTCTTCCCGAAAGATTGTTGGACATGAAA TTGATTATTTCCAAAGAAGATATATTGAAAATTGCCTCTGGA
根据本发明具体实施方式的辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157的KASP 特异性引物,5-157引物序列如下:
前引物A1:5′-AGTTGTTTAAGGTTTGGAAGATGAA-3′,
前引物A2:5′-AGTTGTTTAAGGTTTGGAAGATGAG-3′,
后引物C:5′-TCCAGAGGCAATTTTCAATATATCTTCT-3′。
根据本发明具体实施方式的KASP特异性引物,所述前引物A1、A2的5’端加有荧光标签,其中,所述前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列,所述前引物 A2的5’端加有HEX荧光标签序列。
根据本发明具体实施方式的KASP特异性引物,所述FAM荧光标签序列为 5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’,所述HEX荧光标签序列为 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
本发明提供辣椒疫病抗性基因SNP标记的应用,尤其是在辣椒分子标记辅助育种中的应用。
根据本发明具体实施方式的鉴定抗疫病辣椒的方法,其包括应用辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157鉴定待测辣椒材料的疫病抗性的步骤
当辣椒的疫病抗病性表型为“感病”,该SNP位点为G:G基因型,即SEQ ID No.1 所示核苷酸序列的第25位G的纯合型;
当辣椒的疫病抗病性表型为“抗病”,该SNP位点为G:G基因型,即SEQ ID No.1 所示核苷酸序列的第25位为A的纯合型;或者,该SNP位点为A:G基因型,即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为A和G的杂合型。
根据本发明具体实施方式的鉴定抗疫病辣椒的方法,包括使用所述的KASP特异性引物进行PCR检测的步骤。
根据本发明具体实施方式的鉴定抗疫病辣椒的检测试剂盒,其中含有所述的KASP特异性引物。
所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。
所述荧光探针A的核苷酸序列为上述5-157引物的前引物A1,其5’末端连接荧光基团A;所述淬灭探针A的核苷酸序列为上述A1序列的反向互补序列,其3’末端连接淬灭基团;
所述荧光探针B的核苷酸序列为5-157引物的前引物A2,5’末端连接荧光基团 B;所述淬灭探针B的核苷酸序列为上述A2序列的反向互补序列,其3’末端连接淬灭基团。
在本发明中,所述荧光基团A具体为FAM荧光标签序列;所述荧光基团B具体为HEX荧光标签序列;所述淬灭基团具体为Q。
本发明的有益效果:
依据本发明的SNP分子标记可不通过辣椒疫病抗性人工接种鉴定,只在苗期对辣椒植株的DNA检测,就可以对辣椒疫病抗性基因进行判断,可广泛应用到分子标记辅助育种。本发明的SNP分子标记可用KASP基因分型技术进行大批量检测,提高效率,缩短鉴定时间。
附图说明
图1显示KASP标记5-157在杂交组合中的扩增结果,其中,蓝色点为与辣椒疫病抗性亲本相同基因型的单株(A:A基因型),绿色点为辣椒疫病感病材料(G:G 基因型),红色点为杂合型单株(G:A基因型);
图2显示KASP标记5-157在44个辣椒材料中的扩增结果,其中,蓝色点为与辣椒疫病抗性亲本相同基因型的单株(A:A基因型),绿色点为辣椒疫病感病材料 (G:G基因型)。
具体实施方式
实施例1辣椒疫病抗性基因相关SNP位点的获得及对应KASP引物的确定
1.试验材料
以感病材料77013、IVF2014032和H3,抗病材料CM334、perennial、0601M和 RP4及其F1为试验材料。
2.表型鉴定
上述各辣椒材料及其F1代表型的抗性鉴定采用人工接种鉴定方法,每个材料3 次重复,每重复10株,按照中华人民共和国农业行业标准《辣椒抗病性鉴定技术规程第1部分:辣椒抗疫病鉴定技术规程》(NYT 2060.1-2011)进行。
结果表明,77013、IVF2014032和H3的病情指数分别为80.00、80.48和75.38,大于70,属于感病材料;CM334、perennial、0601M和RP4的病情指数分别为18.09、 48.11、39.26和3.33,小于70,属于抗病材料。
3.辣椒疫病抗性基因相关SNP位点的获得及对应KASP引物的确定
(1)基因组重测序和分子标记设计
对感病材料77013和抗病材料0601M的基因组进行重测序,以抗病材料CM334 为参考基因组,确定样本中的SNP位点,并设计KASP引物。
每对KASP分子标记含有3条引物序列:A1、A2、C。
其中,A1、A2仅仅是末端的SNP位点存在差异,在A1、A2的5’端分别加有不同荧光标签序列。
FAM荧光标签序列:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’;
HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
FAM荧光标签序列和HEX荧光标签序列与KASP V4.0 2X Master mix 96/384, LowRox里带有荧光的序列互补,配对后会激发荧光。
C为反向互补序列。
KASP标记的PCR扩增体系包括DNA模板、引物混合物、荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B,以及高保真的Taq酶,dNTP等。引物混合物包括引物A1、A2和C。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′, 5′末端连接1个荧光基团FAM;荧光探针B的序列为5′ -GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′,5′末端连接1个荧光基团HEX;淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′,3′末端连接淬灭基团Q;淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′,3′末端连接淬灭基团 Q。
表1 KASP标记的核苷酸序列信息
(2)多态性SNP标记的筛选
利用上述KASP引物对感病材料77013、IVF2014032、H3及抗病材料CM334、perennial、0601M和RP4及其F1代进行PCR扩增。
KASP PCR扩增反应后读数需使用Roche 480荧光定量仪,进行KASP Genotying,读取荧光数据,根据分析结果按照如下确定待测基因的具体基因型:聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型,聚合在接近Y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型,中间显示红色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型,左下角显示黑色的样本为以H2O替代模板的空白对照。
与辣椒疫病抗性表型一致的KASP引物组合为5-157,表型及基因型鉴定结果如表2和图1所示,分子标记分型和亲本表型一致,可用于辣椒疫病抗性材料的SNP 分子标记辅助选择。
5-152、5-155和5-163标记不能准确区分抗感亲本及其F1,即双亲间在此SNP 上没有多态性,不能进行群体的分子标记分型。
表2分子标记5-157在辣椒双亲及F1代分型情况
SNP位点的多态性为SEQ ID NO.1所示序列的25位为A或G。
当辣椒的疫病抗病性表型为“感病”时,该SNP位点为G:G基因型,即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为G的纯合型;
当辣椒的疫病抗病性表型为“抗病”时,
(1)该SNP位点为G:G基因型,即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为 A的纯合型;或者
(2)该SNP位点为G:A基因型、即SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第25位为 A和G的杂合型。
实施例2利用分子标记5-157从自然群体中筛选抗疫病辣椒材料
选用44份辣椒材料,使用KASP标记进行PCR扩增。实验结果见表3、图2所示。
表3分子标记5-157在辣椒自然群体中的分型情况
结果表明,当供试辣椒的表型为“抗病”时,分子标记5-157对应的SNP位点分别为A:A基因型;当供试辣椒的表型为“感病”时,分子标记5-157对应的SNP 位点分别为G:G。因此,可利用本发明分子标记5-157从辣椒自然群体中筛选抗疫病材料。
序列表
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 辣椒疫病抗性基因SNP标记5-157及其特异性引物和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> allele
<222> (25)..(25)
<223> R = A OR G
<400> 1
agttgtttaa ggtttggaag atgargaact ggaattcttc ccgaaagatt gttggacatg 60
aaattgatta tttccaaaga agatatattg aaaattgcct ctgga 105
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agttgtttaa ggtttggaag atgaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttgtttaa ggtttggaag atgag 25
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccagaggca attttcaata tatcttct 28
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
Claims (3)
1.鉴定抗疫病辣椒的方法,其特征在于,所述方法包括使用辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157鉴定待测辣椒材料的疫病抗性的步骤,所述SNP标记5-157的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,SEQ ID No.1所示序列的第25位碱基为A或G,其中,
当辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157对应的SNP位点为G:G纯合型基因型时,则待测辣椒材料的疫病抗病性表型为感病;
当辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157对应的SNP位点为A:A纯合性基因型或A:G杂合型基因型时,则待测辣椒材料的疫病抗病性表型为抗病。
2.根据权利要求1所述的鉴定抗疫病辣椒的方法,其特征在于,使用所述辣椒疫病抗性基因相关的SNP标记5-157的KASP特异性引物对待测辣椒材料进行荧光PCR检测,所述引物序列如下:
前引物A1:5′-AGTTGTTTAAGGTTTGGAAGATGAA-3′,
前引物A2:5′-AGTTGTTTAAGGTTTGGAAGATGAG-3′,
后引物C:5′-TCCAGAGGCAATTTTCAATATATCTTCT-3′,
所述前引物A1的5’端加有FAM荧光标签序列,所述前引物A2的5’端加有HEX荧光标签序列。
3.根据权利要求2所述的鉴定抗疫病辣椒的方法,其特征在于,所述FAM荧光标签序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’,所述HEX荧光标签序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
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