CN117925886A - 与并肩荷性状相关的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与并肩荷性状相关的SNP分子标记及应用。所述SNP分子标记位于第4号染色体第457620碱基，该处碱基为A或G。其中，SNP分子标记的GG基因型对应并肩荷植株，所述SNP分子标记的AA或AG基因型对应普通荷叶植株。扩增上述SNP分子标记的PARMS引物序列如SEQ ID No:1‑3所示。根据SNP分子标记和PARMS引物，可以直接用于并肩荷植株和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的鉴定并肩荷植株，为并肩荷分子育种提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及作物育种技术领域，具体涉及一种与并肩荷性状相关的SNP分子标记及应用。
背景技术
莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)，又称莲藕、荷花等。荷花是中国的传统名花，中国是莲的世界分布中心和栽培中心。莲是重要水生观赏花卉植物，品种丰富，在水体绿化、湿地建设、生态恢复和庭院绿化中发挥着越来越重要的作用。并蒂莲是荷花中的珍品，被赋予很多美好的寓意，其形成原因仍未有定论。并肩荷指莲植株的两枝荷叶相伴而生，直到顶端两片叶子才分开，但依然“肩并着肩”，故名“并肩荷”。并蒂莲已十分珍贵，并肩荷更是十分罕见。物以稀为贵，因此能够选育出并肩荷品种将对莲新品种选育具有里程碑式意义。经检索，目前还没有对并肩荷进行选育的报道。
PARMS(Penta-primer Amplification Refractory Mutation System)技术是一种新SNP基因分型技术，该技术利用引物对SNP位点进行等位基因特异性扩增，然后通过荧光扫描，马上可以得到基因分型结果，具有操作简便、耗时短和成本低等优势。
发明内容
本发明首先自团队承担建设的山东省水生蔬菜种质资源圃中保存的400余份莲种质资源构建了大量杂交和自交组合，同时进行了大量的杂交莲子种植及选育工作。在鄂莲9号(E9)与山东本地莲藕品种ZW2杂交F1代单株(编号F1-003)的自交群体里意外发现了一类并肩荷植株，并且自交分离群体中普通荷叶植株数量和并肩荷植株(部分荷叶为并肩荷叶)数量分离比符合3∶1，我们推测这一并肩荷性状受单基因控制。然后我们利用BSA-Seq和遗传连锁分析的方法，成功定位到了这一个控制并肩荷性状的隐性基因，并最终在定位区间内鉴定出一个和基因共分离的SNP分子标记，开发了该SNP标记的PARMS引物。上述的标记和引物可以直接用于并肩荷植株和相对应的基因型的鉴定，在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲植株是否是并肩荷植株，为并肩荷新品种分子选育提供了技术支持。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种与并肩荷性状相关的SNP分子标记，其特征是，所述SNP分子标记位于第4号染色体第457620碱基，该处碱基为A或G。
其中，SNP分子标记的GG基因型对应并肩荷植株，SNP分子标记的AA或AG基因型对应普通荷叶植株。
本发明的另一目的是提供一种扩增上述SNP分子标记的PARMS引物，所述引物序列如下，
S4-160-F1(SEQ ID No:1)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTTCGAGCATGGAAAGTTGACA；
S4-160-F2(SEQ ID No:2)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTTCGAGCATGGAAAGTTGACG；
S4-160-R(SEQ ID No:3)：
TCATTCAATCTCTCCGGACTGATC。
本发明还提供了上述SNP分子标记、PARMS引物在并肩荷分子育种中的应用。
本发明还提供了上述SNP分子标记、PARMS引物在并肩荷植株和相对应的基因型鉴定方面的应用。
采用上述的PARMS引物鉴定并肩荷植株和相对应的基因型的方法，其特征是，
(1)以待检测植株的DNA为模板，利用如SEQ ID No:1-3所示的PARMS扩增引物进行Touchdown PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(2)PCR扩增产物用QuantStudio 5荧光定量PCR仪Genotyping模式采集FAM和HEX荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图；
(3)在基因分型图中，右下角的分型结果为G:G，对应并肩荷植株样品，中间部分分型结果为A:G，对应普通荷叶植株样品；左上角的分型结果为A:A，对应普通荷叶植株样品。
PCR扩增体系(10μl)：5μl 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μl10mM S4-160-F1引物，0.15μl 10mM S4-160-F2引物，0.4μl 10mM反向共用引物S4-160-R，0.5μl模板DNA，3.8μl ddH2O。
PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用BSA-Seq和遗传连锁分析的方法，定位到一个控制并肩荷性状的SNP分子标记，并继而开发了扩增该SNP分子标记的PARMS引物。本发明首次获得了控制并肩荷性状的基因位点并开发相关分子标记，对于并肩荷育种具有里程碑式意义。
(2)本发明的SNP分子标记准确性好，根据SNP分子标记和PARMS引物，可以直接用于并肩荷植株和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的鉴定并肩荷植株，为并肩荷分子育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1群体中代表性植株的并肩荷叶和普通荷叶及叶柄对比图；其中a,b为并肩荷叶；c为普通荷叶；d为并肩荷叶和普通荷叶的叶柄横截面；
图2为本发明实施例1中并肩荷基因定位图；
图3为本发明实施例2中利用SNP分子标记对群体400株单株进行检测的基因分型图；其中，右下角(红色)为并肩荷植株样品，左上角(蓝色)为普通荷叶植株样品，中间部分(绿色)为普通荷叶植株样品，黑色为空白对照。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明所用试剂均有市售。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：并肩荷基因定位及SNP标记PARMS引物开发
本实施例查找到与并肩荷性状相关基因的SNP位点，并针对该SNP位点设计PARMS引物。具体包括以下步骤：
1、发明人所在团队长期以来一直从事莲藕育种工作，利用团队承担建设的山东省水生蔬菜种质资源圃中保存的400余份莲种质资源构建了大量杂交和自交组合，同时进行了大量的杂交莲子种植及选育工作。经多年表型鉴定，在鄂莲9号(E9)与山东本地莲藕品种ZW2杂交F1代单株(编号F1-003)的自交群体里发现其表型可以分为两类：一类植株的荷叶会部分发育成并肩荷叶，一类植株的荷叶全部为普通荷叶(图1)。遗传分析表明，群体普通荷叶植株数量和并肩荷植株数量分离比例符合3∶1，初步预测并肩荷性状为单隐性基因控制。
2、基因定位：选择自交分离群体中普通荷叶植株和并肩荷植株各30株，分别构建DNA混池，进行BSA-seq分析。结果显示：在Chr4上有唯一定位区间(图2a)，进一步证明了并肩荷性状为单基因控制。
通过基因组重测序数据，针对BSA-seq定位位置附近SNP位点开发了PARMS标记，对188个分离群体单株进行基因分型，构建了遗传连锁图，各个标记的遗传位置和物理位置顺序完全一致。结合分离群体单株是否为并肩荷植株这一质量性状表型数据，把并肩荷基因初步定位于S4-164至染色体末端之间，遗传距离为4.58cM。通过增加分子标记数量，并对扩大的900株群体进行基因型分析，结合所有植株多年表型数据，把基因定位于分子标记S4-161至染色体末端之间，对应参考基因组857kb(图2b)。根据两类表型代表性植株的全基因组重测序数据，查找该定位区间内的SNP变异位点。在457620bp位置查找到一个SNP位点变异A/G。
3、设计PARMS引物：根据457620bp位置SNP位点上下游150bp的序列，用PARMS引物设计网站(http://www.snpway.com)设计等位基因特异引物和反向共用引物。
在457620bp位置SNP位点上下游150bp的序列如下(参见SEQ No.4-5)：
GCTTCATGAGCTCATCAGGAACACCACCTCGAAGCGCATTGTTGCCAAGATTTAGG GTTTTTAGACCTTGAAGATTCCCAAAACAGGCAGGAATAGAACCGGAGAAGTTGTTGTG AGACAGAATTAGGGTTTCGAGCATGGAAAGTTGAC[A/G]CAAACTGGAATCGATCAGTC CGGAGAGATTGAATGATCTAAGATTGATGGAAACGACTCTCCCAGTACGGTTTTCGCAG GCGATTCCGGTCCAGTTGCTACATTTGAACCCAACCCACCTCGCCAAACTTTGCTTTGGG TCGTTAATGGA。
引物序列如下，
S4-160-F1(SEQ ID No:1)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTTCGAGCATGGAAAGTTGACA；
S4-160-F2(SEQ ID No:2)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTTCGAGCATGGAAAGTTGACG；
S4-160-R(SEQ ID No:3)：
TCATTCAATCTCTCCGGACTGATC。
实施例2：实施例1的并肩荷SNP分子标记及PARMS引物的验证
通过分离群体(将F1-003再次自交获得400粒莲子)对实施例1查找到的SNP分子标记及PARMS引物进行验证。
具体包括如下步骤：
1、以分离群体基因组(400个单株)DNA为模板(利用CTAB法从莲的叶片中提取基因组DNA)，利用分子标记的扩增引物PARMS引物，进行Touchdown PCR扩增，获得扩增产物。
PCR扩增体系(10μl)：5μl 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μl10mM S4-160-F1引物，0.15μl 10mM S4-160-F2引物，0.4μl 10mM反向共用引物S4-160-R，0.5μl模板DNA，3.8μl ddH2O。
PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环。
2、对扩增产物进行检测与分析
检测方法：PCR产物用QuantStudio 5荧光定量PCR仪Genotyping(基因分型)模式采集FAM和HEX荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图(FAM和HEX荧光信号在图中分别显示蓝色和红色图像，杂合信号显示绿色图像)，输出基因型检测结果用于后续分析。
利用实施例1的SNP分子标记及PARMS引物，对分离群体(400个单株)进行检测，其中G:G的荧光信号有105个单株，A:G的荧光信号有207个单株，A:A的荧光信号有88个单株。结合400个单株表型分析发现，检测结果与表型一致的准确率为100％。并肩荷基因分型结果如图3所示，图中右下角(红色)的分型结果为G:G，对应并肩荷植株样品，图中中间部分(绿色)分型结果为A:G，对应普通荷叶植株样品，图中左上角(蓝色)的分型结果为A:A，对应普通荷叶植株样品。可见，利用该SNP分子标记可用于区分并肩荷性状。
以上结果充分说明，实施例1的SNP分子标记，G与并肩荷性状紧密连锁，A或者杂合与普通荷叶性状紧密连锁。在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到的G:G荧光信号的材料，就能够选育出并肩荷植株纯合材料；保留检测到A:A荧光信号的材料，就能够选育出普通荷叶植株纯合材料；保留检测到A:G荧光信号的材料，就能够选育出普通荷叶植株杂合材料。通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
本发明的SNP分子标记准确性好，能够用来预测、鉴定和筛选并肩荷性状，在苗期可以有效地进行筛选，提高了工作效率，减少后期种植的人力物力财力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种扩增与并肩荷性状相关的SNP分子标记的PARMS引物，所述引物序列如下，
S4-160-F1(SEQ ID No:1)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTTCGAGCATGGAAAGTTGACA；
S4-160-F2(SEQ ID No:2)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTTCGAGCATGGAAAGTTGACG；
S4-160-R(SEQ ID No:3)：
TCATTCAATCTCTCCGGACTGATC；
所述SNP分子标记位于第4号染色体第457620碱基，该处碱基为A或G；
其中，SNP分子标记的GG基因型对应并肩荷植株，SNP分子标记的AA或AG基因型对应普通荷叶植株。
2.与并肩荷性状相关的SNP分子标记在并肩荷分子育种中的应用，所述SNP分子标记位于第4号染色体第457620碱基，该处碱基为A或G；其中，SNP分子标记的GG基因型对应并肩荷植株，SNP分子标记的AA或AG基因型对应普通荷叶植株。
3.权利要求1所述的PARMS引物在并肩荷分子育种中的应用。
4.与并肩荷性状相关的SNP分子标记在并肩荷植株和相对应的基因型鉴定方面的应用；所述SNP分子标记位于第4号染色体第457620碱基，该处碱基为A或G；其中，SNP分子标记的GG基因型对应并肩荷植株，SNP分子标记的AA或AG基因型对应普通荷叶植株。
5.权利要求1所述的PARMS引物在并肩荷植株和相对应的基因型鉴定方面的应用。
6.采用权利要求1所述的PARMS引物鉴定并肩荷植株和相对应的基因型的方法，其特征是，
(1)以待检测植株的DNA为模板，利用如SEQ ID No:1-3所示的PARMS扩增引物进行Touchdown PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(2)PCR扩增产物用QuantStudio 5荧光定量PCR仪Genotyping模式采集FAM和HEX荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图；
(3)在基因分型图中，右下角的分型结果为G:G，对应并肩荷植株样品，中间部分分型结果为A:G，对应普通荷叶植株样品；左上角的分型结果为A:A，对应普通荷叶植株样品。
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