CN105256031B - 利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物。本发明所提供的专用引物是用于检测甜瓜性别基因CmACS7和CmWIP1的成套KASP引物，其具体的核苷酸序列为序列表中序列1‑6。利用本发明所提供的基于PCR SNPLine平台的高通量分子标记系统进行甜瓜性别基因基因型的检测，操作流程全自动，降低了人为误差；分析通量高，非常适合大量样品同时检测。本发明基于甜瓜雌性花发育A/a基因和G/g基因序列设计高通量检测的分子标记，并应用于甜瓜雌性系基因的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速甜瓜雌性性状向优异骨干自交系的转育。

Description

利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科黄瓜属甜瓜种的重要经济作物。甜瓜植株花的性型主要有以下几种表现型：雄全同株、雌雄异花同株、两性花株、雌全同株、三性混合株、全雌系(雌性系)、全雄株。目前商业栽培的甜瓜品种绝大多数为雄全同株，由于结实花是两性花，因而在杂交授粉前必须进行人工去雄、套袋、授粉、标记等操作规程，劳动强度大、制种成本高；并且人工授粉经常会伤到雌蕊，造成授粉率低，结实率下降，产量减少。如果人工去雄不彻底还会造成串粉，种子纯度难以保证。利用全株无雄花，雌花上无雄蕊的甜瓜雌性系作为母本进行杂交育种可以有效地简化制种程序、降低制种成本、提高种子纯度，因此在杂种一代的选育中，甜瓜雌性系的研究和利用显得愈来愈重要。
甜瓜性别分化主要受3个位点(a，g，gy)上等位基因的协同控制：a基因为隐性基因，控制表现雄全同株，遗传作用于大多数单性雄花，少数两性完全花；g基因为隐性基因，控制雌两性同株性状，作用于大多数单性雌花，少数两性完全花。gy为隐性基因，控制全雌株性状，与a和g互作。以上3个基因的共同作用决定了甜瓜植株的性别发育模式，其中基因型A_G_表现为雌雄异花同株，基因型A_gg表现为全雌株，基因型aaG_表现为雄全同株，基因型aagg为两性花株，基因型为A_gggygy时，形成稳定的全雌株。
Boualem等(2008)通过图位克隆获得A/a基因序列，明确了控制甜瓜性别分化雄全同株基因a为控制ACC合成酶基因CmACS7，并揭示出雄花两性花是由CmACS7基因的一个活性位点C-T突变引起。Martin等(2009)利用雌雄异花同株和全雌系的杂交群体，图位克隆得到了控制雄花向雌花过渡的基因CmWIP1(g基因)，研究发现全雌系与转座子插入引起CmWIP1基因的启动子甲基化有关。CmWIP1(g基因)和CmACS7(a基因)相互作用形成甜瓜多种性别分化类型。
由于甜瓜性型遗传背景复杂，采用传统的杂交、回交和表型选择进行雌性系育种周期长、成本高，分子标记辅助育种可以从基因型上筛选种质资源，极大地提高育种效率，目前分子标记辅助育种已经被大量应用到育种实践中，取得较好的效果。获得与甜瓜雌性系基因连锁的分子标记，特别是针对目标基因的关键突变位点开发的功能型分子标记是利用分子标记辅助甜瓜雌性性状转育，实现种质创新的前提条件。甜瓜性别决定基因的克隆使得基于目标基因序列开发功能型分子标记成为可能，Boualem等(2008)根据A/a基因序列关键突变位点开发出CAPS标记。Martin等(2009)利用G/g基因转座子插入位点设计了SCAR标记，栾非时等(2014)基于A/a基因和G/g基因的变异位点也开发出了CAPS标记和SCAR(申请号：201410039820.1，公开号103866005A)。
然而由于针对A/a基因开发的CAPS标记需要对PCR产物进行酶切，针对G/g基因设计的SCAR需要分别对G和g基因的特异片段进行扩增，再利用聚丙烯酰胺凝胶对目标片段进行分离检测等步骤，过程较为繁琐，使得这些标记在甜瓜雌性系分子标记辅助育种方面的应用具有一定的局限性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测甜瓜性别基因的成套KASP引物。
本发明所提供的用于检测甜瓜性别基因的成套KASP引物，其中所述甜瓜性别基因为CmACS7基因和CmWIP1基因，所述成套KASP引物具体由如下(1)和(2)组成：
(1)特异于所述CmACS7基因的KASP引物：引物1、引物2和引物3；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列1的第22-47位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列2的第22-46位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA；
(2)特异于所述CmWIP1基因的KASP引物：引物4、引物5和引物6；所述引物4为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列4的第22-48位的单链DNA；所述引物5为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列5的第22-49位的单链DNA；所述引物6为核苷酸序列如序列表中序列6所示的单链DNA。
进一步，所述标签序列A的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-21位。
更加具体的，所述引物1为核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA；所述引物4为核苷酸序列如序列表中序列4所示的单链DNA；所述引物5为核苷酸序列如序列表中序列5所示的单链DNA。
上述(1)和(2)共2个KASP引物为分别单独包装。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测甜瓜性别基因的KASP引物。
本发明所提供的用于检测甜瓜性别基因的KASP引物，为前文所述(1)中的所述的特异于所述CmACS7基因的KASP引物或前文所述(2)中的所述的特异于所述CmWIP1基因的KASP引物。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测甜瓜性别基因的试剂盒。
本发明所提供的用于检测甜瓜性别基因的试剂盒，含有所述成套KASP引物或所述KASP引物。
所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团；
所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。
在本发明中，所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX；所述淬灭基团为BHQ。
在本发明中，所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B是存在于KASP V4.0 2×Master Mix中的，其中所述KASP V4.0 2×Master Mix为英国LGC公司产品，其产品目录号为KBS-1016-002(适用于96/384孔板)或KBS-1016-011(适用于1536孔板)。
所述成套KASP引物或所述KASP引物或所述试剂盒在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)检测或辅助检测甜瓜性别基因的基因型，所述甜瓜性别基因为CmACS7基因和/或CmWIP1基因；
(2)培育甜瓜雌性系。
本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测甜瓜性别基因的基因型的方法。
本发明所提供的检测或辅助检测甜瓜性别基因的基因型的方法，其中所述甜瓜性别基因为CmACS7基因和/或CmWIP1基因，所述方法为如下(A)和/或(B)：
(A)检测或辅助检测待测甜瓜的CmACS7基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒中的所述“特异于所述CmACS7基因的KASP引物”(所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为aa(SNP分型为T:T基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为AA(SNP分型为C:C基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为Aa(SNP分型为C:T基因型)；
(B)检测或辅助检测待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板，采用所述试剂盒中的所述“特异于所述CmWIP1基因的KASP引物”(所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX)进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为GG(SNP分型为G:G基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为gg(SNP分型为A:A基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为Gg(SNP分型为A:G基因型)。
所述方法在培育甜瓜雌性系中应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第五个目的是提供一种培育具有目标性状的甜瓜雌性系的方法。
本发明所提供的培育具有目标性状的甜瓜雌性系的方法，具体可包括如下步骤：采用不具所述目标性状、通过所述检测或辅助检测甜瓜性别基因的基因型的方法检测得到的CmACS7基因的基因型为AA(SNP分型为C:C基因型)且CmWIP1基因的基因型为gg(SNP分型为A:A基因型)的甜瓜雌性系作为供体亲本，采用具有所述目标性状的甜瓜作为轮回亲本，进行回交，并将回交后代进行自交，从自交后代中获得具有所述目标性状、通过所述检测或辅助检测甜瓜性别基因的基因型的方法检测得到的CmACS7基因的基因型为AA(SNP分型为C:C基因型)且CmWIP1基因的基因型为gg(SNP分型为A:A基因型)的甜瓜雌性系。
在本发明中，所述CmACS7基因的基因型为AA(SNP分型为C:C基因型)是指以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物Aa-SNPF所示序列的DNA链的核苷酸序列的第170位为C的纯合型(即扩增产物单一，如序列7所示)；所述CmACS7基因的基因型为aa(SNP分型为T:T基因型)是指以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物Aa-SNPF所示序列的DNA链的核苷酸序列的第170位为T的纯合型(即扩增产物单一，如序列8所示)；所述CmACS7基因的基因型为Aa(SNP分型为C:T基因型)是指以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物Aa-SNPF所示序列的DNA链的核苷酸序列的第170位为C和T的杂合型(即扩增产物为两种，分别如序列7和序列8所示)。其中，引物Aa-SNPF和Aa-SNPR的序列信息参见实施例。
在本发明中，所述CmWIP1基因的基因型为GG(SNP分型为G:G基因型)是指以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物为330bp的单一片段，且扩增产物中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第193位核苷酸为G的纯合型(即扩增产物单一，如序列9所示)；所述CmWIP1基因的基因型为gg(SNP分型为A:A基因型)是指以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物为336bp的单一片段，且扩增产物中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第199位核苷酸为A的纯合型(即扩增产物单一，如序列10所示)；所述CmWIP1基因的基因型为Gg(SNP分型为G:A基因型)是指以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物为330bp和336bp的两个片段，且330bp片段中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第193位核苷酸为G，336bp片段中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第199位核苷酸为A(即扩增产物为两种，分别如序列9和序列10所示)。其中，引物Gg-SNPF和Gg-SNPR的序列信息参见实施例。
在本发明中，所述CmACS7基因的GenBank登录号为EU791279.1或EU791280.1。所述CmWIP1基因的GenBank登录号为GQ870275.1或GQ870274.1。
在本发明中，所述甜瓜选自如下中任一种：M26、M29、由所述M26和所述M29杂交所得的后代、WMR 29、Védrantais、PI124112、玉姑、长香玉、西州蜜25号。
本发明将基于KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)技术的SNPline基因分型检测技术平台，根据目标基因的关键变异位点设计引物，利用引物末端碱基的特异匹配对目标基因进行SNP分型。基于PCR的SNPLine平台是高通量的分子标记系统，操作流程全自动，降低了人为误差；分析通量高，兼容96、384、1536多孔板，每天可完成20至500000个SNP基因型分型，非常适合大量样品同时检测。基于甜瓜雌性花发育A/a基因和G/g基因序列设计高通量检测的分子标记，并应用于甜瓜雌性系基因的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速甜瓜雌性性状向优异骨干自交系的转育。
附图说明
图1是利用高通量KASP分子标记分析甜瓜A/a基因型的96孔样品板SNP分型结果示意图。其中，NTC表示空白对照(黑色)，？表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型(粉色)，C:C为红色，C:T为绿色，T:T为蓝色。
图2是利用CAPS-Alu I标记分析甜瓜A/a基因型的检测结果示意图。
图3是利用高通量KASP分子标记分析甜瓜G/g基因的96孔样品板SNP分型结果示意图。其中，NTC表示空白对照(黑色)，？表示由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型(粉色)，A:A为红色，A:G为绿色，G:G为蓝色。
图4是利用SCAR标记分析甜瓜G/g基因型的结果示意图。其中，A为GG基因特异性片段PCR扩增检测结果；B为gg基因特异性片段PCR扩增检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
甜瓜品种WMR 29(aa基因型)、甜瓜品种Védrantais(aa基因型)和甜瓜品种PI124112(AA基因型)：品种名及基因型在“Boualem A,Fergany M,Fernandez R,etal.Conserved Mutation in an Ethylene Biosynthesis Enzyme Leads toAndromonoecy in Melons.Science,2008 Aug 8；321(5890):836-8”一文中均有记载，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得这些甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。
甜瓜品种玉姑：记载于“刘朋义,别之龙,彭斌等.甜瓜品种抗枯萎病的苗期鉴定.中国瓜菜,2011,24(2):11-13”一文中均有记载，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得这些甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。
甜瓜品种长香玉、甜瓜品种西州蜜25号：记载于“张棵,柳唐镜,彭德旗等.2013年海南省西甜瓜主导品种推介.中国蔬菜,2013(3)：36-37”一文中均有记载，公众可以自申请日起二十年内从申请人处获得这些甜瓜品种，仅用于重复本发明相关实验使用。
甜瓜两性花株M26：已经于2015年9月18日保藏于北京农作物种质资源库，分类号为303.1923，统一编号为32095，公众可自保藏之日起从北京农作物种质资源库、北京农林科学院蔬菜研究中心获得。
甜瓜雌雄异花同株M29：已经于2015年9月18日保藏于北京农作物种质资源库，分类号为303.1924，统一编号为32096，公众可自保藏之日起从北京农作物种质资源库、北京农林科学院蔬菜研究中心获得。
实施例1、甜瓜性别基因的高通量KASP标记设计及其专用引物序列的开发
本发明涉及的甜瓜性别基因为CmACS7基因(a基因)和CmWIP1基因(g基因)。
一、供试甜瓜材料及其基因组DNA的提取
A、供试材料选取
供试体材料：CmACS7基因(a基因)和CmWIP1基因(g基因)的基因型已知的甜瓜两性花株M26(aagg)和雌雄异花同株M29(AAGG)。其中，两亲本的基因型经现有报道的CAPS-AluI标记(具体参见“Boualem A,Fergany M,Fernandez R,et al.Conserved Mutation in anEthylene Biosynthesis Enzyme Leads to Andromonoecy in Melons.Science,2008 Aug8；321(5890):836-8”)和SCAR标记(具体参见“Martin A,Troadec C,Boualem A,et al.Atransposon-induced epigenetic change leads to sex determination inmelon.Nature.2009 Oct 22；461(7267):1135-8”)检测所得，并经测序验证。
B、基因组DNA的提取
将供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA；
DNA提取参照Murray等(1980)的方法(Murray M,Thompson W F.Rapid isolationof high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673.)的基础上改进而成；具体步骤如下：
(1)取0.3-0.5g幼嫩叶片于8连排管，每管加300μl CTAB，放入2粒钢珠，用Retch仪进行打碎。
(2)每管再加入300μl CTAB，混匀后65℃水浴60min，每隔10min颠倒混匀一次。
(3)水浴后置于室温冷却10min，加入300μl氯仿：异戊醇(24:1体积比)，充分混匀，4500rpm离心15min。
(4)取400μl上清液，加入预先加好的400μl预冷的异丙醇中(于96孔深孔板)，轻轻混匀。-20℃放置30min。
(5)于4500rpm离心30min，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀2-3次，室温下风干至无乙醇味。
(6)加入50-100μl(含0.5-1μl RNase 10mg/ml)ddH2O，37℃水浴30min。
取5μl样品在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测，并以标准λDNA为对照，将样品浓度调为一致。
二、特异于A/a基因的高通量分子标记引物的开发
利用NCBI网上公布的甜瓜CmACS7基因的一对等位基因，即A/a基因组序列信息(GenBank登录号EU791279.1/EU791280.1)，针对A与a基因的DNA序列设计引物扩增A和a基因型材料的特异片段。
上述用于特异性片段扩增的引物序列如下：
Aa-SNPF：5'-ATGGCGATTGAGATTGATAT-3'
Aa-SNPR：5'-CCCAATCTCCTTACAAAGC-3'
特异性片段扩增的PCR反应体系(25μL)为：50ng基因组DNA，2.5μL含15mM MgCl2的10×Buffer；1.0μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Taq DNA聚合酶；2.0μL浓度均为10μM的PCR上、下游混合引物；ddH2O补足到25μL。其中，Taq DNA聚合酶及反应缓冲液，dNTPs均为北京全式金生物技术有限公司产品。
PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃30s，52℃30s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持。其中PCR仪为Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；PCR扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。
测序结果：以甜瓜雌雄异花同株(AAGG)的基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列7所示；以甜瓜两性花株(aagg)的基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列8所示。经DNAMAN软件比对发现上述A/a基因扩增特异片段在170bp处存在的C-T单碱基突变位点。
相应的，若该SNP分型为C:C基因型，则以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物Aa-SNPF所示序列的DNA链的核苷酸序列的第170位为C的纯合型(即扩增产物单一，如序列7所示)，此时CmACS7基因的基因型为AA；若该SNP分型为T:T基因型，则以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物中具有引物Aa-SNPF所示序列的DNA链的核苷酸序列的第170位为T的纯合型(即扩增产物单一，如序列8所示)，此时CmACS7基因的基因型为aa；若该SNP分型为C:T基因型，则以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Aa-SNPF/Aa-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物具有引物Aa-SNPF所示序列的DNA链的核苷酸序列的第170位为C和T的杂合型(即扩增产物为两种，分别如序列7和序列8所示)，此时CmACS7基因的基因型为Aa。
根据该SNP设计高通量KASP分子标记。
用于高通量筛选的KASP标记引物序列如下：
a-F：5’-TCTGGTGTTATTCAAATGGGCTTAG-3’；
A-F：5’-CTGGTGTTATTCAAATGGGCTTAG-3’；
A/a-R：5’-CCCAATCTCCTTACAAAGCAAAACAAAAC-3’。
针对SNP位点，上游引物a-F和A-F的3′端为等位变异碱基(粗体下划线部分的T或C)，将a-F和A-F在5’端加上相应的通用接头序列(荧光标签序列)，如下：
a-F adaptor：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(FAM荧光标签序列)；
A-F adaptor：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(HEX荧光标签序列)。
得到相应的A/a基因高通量分子标记引物序列：
a_Allele-F：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTGGTGTTATTCAAATGGGCTTAGT-3’(序列1，其中下划线部分为FAM荧光标签序列)；
A_Allele-F：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGTGTTATTCAAATGGGCTTAGC-3’(序列2，其中下划线部分为HEX荧光标签序列)；
A/a-R：5’-CCCAATCTCCTTACAAAGCAAAACAAAAC-3’(序列3)。
上述引物由上海生工公司北京合成部合成。
三、特异于G/g基因的高通量分子标记引物的开发
利用NCBI网上公布的甜瓜CmWIP1基因的一对等位基因，即G/g基因组序列信息(GenBank登录号GQ870275.1/GQ870274.1)，针对G与g基因的DNA序列设计引物扩增G和g基因型材料的特异片段。
上述用于特异性片段扩增的引物序列如下：
Gg-SNPF：5'-GATCTTATTCTTGGCTTTGTCC-3'；
Gg-SNPR：5'-GGGTATTGCTGTTATTATCATTG-3'。
特异性片段扩增的PCR反应体系(25μL)为：50ng基因组DNA，2.5μL含15mM MgCl2的10×Buffer；1.0μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Taq DNA聚合酶；2.0μL浓度均为10μM的PCR上、下游混合引物；ddH2O补足到25μL。其中，Taq DNA聚合酶及反应缓冲液，dNTPs均为北京全式金生物技术有限公司产品。
PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃30s，55℃30s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持。其中PCR仪为Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；PCR扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。
测序结果：以甜瓜雌雄异花同株M29(AAGG)的基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列9所示；以甜瓜两性花株M26(aagg)的基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列10所示。经DNAMAN软件比对发现，上述G/g扩增特异片段存在G-A单碱基突变位点。
相应的，若该SNP分型为G:G基因型，则以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物为330bp的单一片段，且扩增产物中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第193位核苷酸为G的纯合型(即扩增产物单一，如序列9所示)，此时CmWIP1基因的基因型为GG；若该SNP分型为A:A基因型，则以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物为336bp的单一片段，且扩增产物中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第199位核苷酸为A的纯合型(即扩增产物单一，如序列10所示)，此时CmWIP1基因的基因型为gg；若该SNP分型为A:G基因型，则以待测甜瓜基因组DNA为模板，采用引物对Gg-SNPF/Gg-SNPR进行PCR扩增所得特异性扩增产物为330bp和336bp的两个片段，且330bp片段中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第193位核苷酸为G，336bp片段中具有引物Gg-SNPF所示序列的DNA链的第199位核苷酸为A(即扩增产物为两种，分别如序列9和序列10所示)，此时CmWIP1基因的基因型为Gg。
根据该SNP位点设计所述的高通量分子标记。
上述用于高通量筛选的标记引物序列如下：
G-F：5’-TGATCCTAATCTCTCCATCAATAATA-3’；
g-F：5’-GTGATCCTAATCTCTCCATCAATAATA-3’；
G/g-R：5’-GTAATGTTGAAAAGGGGATAAACTAAAACAAGT-3’；
针对SNP位点，上游引物G-F和g-F的3′端为等位变异碱基(粗体下划线部分的G或A)，将G-F和g-F在5’端加上相应的通用接头序列(荧光标签序列)，如下：
G-F adaptor：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′(FAM荧光标签序列)；
g-F adaptor：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′(HEX荧光标签序列)。
得到相应的G/g基因高通量分子标记引物序列：
G_Allele-F：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATCCTAATCTCTCCATCAATAATAG-3’(序列4，其中下划线部分为FAM荧光标签序列)；
g_Allele-F：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTGATCCTAATCTCTCCATCAATAATAA-3’(序列5，其中下划线部分为HEX荧光标签序列)；
G/g-R：5’-GTAATGTTGAAAAGGGGATAAACTAAAACAAGT-3’(序列6)。
上述引物由上海生工公司北京合成部合成。
实施例2、利用高通量KASP标记检测甜瓜性别基因的方法的建立
一、提取基因组DNA
参见实施例1步骤一。
二、PCR扩增
以步骤一提取的基因组DNA为模板，用实施例1开发的用于检测2种甜瓜性别基因(CmACS7基因和CmWIP1基因)的KASP标记的专用引物分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
KASP基因分型PCR反应体系：
96孔板：10ng基因组DNA，5μl KASP V4.0 2×Master Mix，0.14μl KASP 72×assay mix，加ddH2O至10μl。
384孔板：5ng DNA，2.5μl KASP V4.0 2×Master Mix，0.07μl KASP 72×assaymix，加ddH2O至5μl。
1536孔板：5ng DNA，2.5μl KASP V4.0 2×Master Mix，0.07μl KASP 72×assaymix，加ddH2O至5μl。
其中，KASP V4.0 2×Master Mix为LGC公司产品，其种用于96/384孔板的KASPV4.0 2×Master Mix的产品目录号为KBS-1016-002；用于1536孔板的KASP V4.0 2×Master Mix的产品目录号为KBS-1016-011。KASP V4.0 2×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。
当检测CmACS7基因的基因型时，KASP 72×assay mix由实施例1获得的引物a_Allele-F、A_Allele-F和A/a-R分别稀释至浓度为100μM后，将a_Allele-F稀释液、A_Allele-F稀释液和A/a-R稀释液与ddH2O按12:12:30:46的体积比混合得到。
当检测CmWIP1基因的基因型时，KASP 72×assay mix由实施例1获得的引物G_Allele-F、g_Allele-F和G/g-R分别稀释至浓度为100μM后，将G_Allele-F稀释液、g_Allele-F稀释液和G/g-R稀释液与ddH2O按12:12:30:46的体积比混合得到。
KASP基因分型PCR扩增反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃20s，61-55℃(每个循环降0.6℃)1min，共循环10次；阶段3：94℃20s，55℃1min，共循环26次。其中PCR水浴热循环为Hydrocycler 16-32高通量热循环系统，适用于96、384和1536孔板。
实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照，每个PCR板设置2个空白对照。
三、PCR扩增产物的荧光扫描
采用双向单激发读板仪PHERAstar对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm，HEX激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。
每个PCR扩增产物样本设置至少3个重复。
四、等位基因分型
采用KrakenTM软件对双向单激发读板仪PHERAstar扫描数据分析(具体操作方法参考KrakenTM软件说明书，公众可以直接从LGC公司购买，见网址http://www.lgcgroup.com/products/genotyping-software/kraken/#.VhcaT9Kl8_M)，根据分析结果按照如下确定待测甜瓜性别基因的具体基因型：聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型，左下角显示黑色的样本为空白对照。
具体而言，如下：
(a1)判定CmACS7基因的基因型：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为aa(SNP分型为T:T基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为AA(SNP分型为C:C基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为Aa(SNP分型为C:T基因型)；
(a2)判定CmWIP1基因的基因型：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为GG(SNP分型为G:G基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为gg(SNP分型为A:A基因型)；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为Gg(SNP分型为A:G基因型)。
实施例3、高通量KASP标记检测甜瓜性别基因的验证及在育种中的应用
一、高通量KASP分子标记的验证
1、供试材料选取
供试体材料包括：甜瓜两性花株M26(aagg)和甜瓜雌雄异花同株M29(AAGG)为亲本进行杂交获取的F1代，F1代自交获得F2代。选择已知基因型甜瓜品种WMR 29(aa基因型)、甜瓜品种Védrantais(aa基因型)和甜瓜品种PI124112(AA基因型)作为对照。
以上F2代分离群体于2012年秋在海南培育、采种，于2013年8月在大棚中催芽直播，定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青试验基地，其中父本、母本、F1、WMR 29(aa基因型)、Védrantais(aa基因型)和PI 124112(AA基因型)各定植20株，F2定植120株。
2、高通量KASP标记检测
一方面，采用本发明实施例1开发高通量KASP标记检测步骤1中供试甜瓜的性别基因(CmACS7基因和CmWIP1基因)的基因型，具体操作参见实施例2，获得各供试甜瓜的性别基因的基因型。另一方面，观察记录步骤1中供试甜瓜的性别表型。进而统计高通量KASP标记检测基因型结果与性别表型结果的吻合度。另外，本发明的发明人还采用现有报道的CAPS-Alu I标记检测供试甜瓜的CmACS7基因的基因型，具体参见“Boualem A,Fergany M,Fernandez R,et al.Conserved Mutation in an Ethylene Biosynthesis Enzyme Leadsto Andromonoecy in Melons.Science,2008 Aug 8；321(5890):836-8”一文根据A/a基因序列关键突变位点开发出CAPS标记；采用现有报道的SCAR标记检测供试甜瓜的CmWIP1基因的基因型，具体参见“Martin A,Troadec C,Boualem A,et al.A transposon-inducedepigenetic change leads to sex determination in melon.Nature.2009 Oct 22；461(7267):1135-8”一文中利用G/g基因转座子插入位点设计的SCAR标记。
(1)利用A/a基因高通量KASP分子标记体系分析亲本和F2群体单株的CmACS7基因的基因型，以已知基因型的甜瓜种质资源材料WMR 29(aa基因型)、Védrantais(aa基因型)和PI 124112(AA基因型)为对照，部分样品的检测结果如图1所示，根据A/a基因的C-T关键变异位点设计的标记引物，将F2群体单株进行SNP分型得到C:C、C:T和T:T三种基因型，分别对应为：AA、Aa和aa基因型。左下角显示黑色的样本为每个PCR板的空白对照，聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型(aa)，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型(AA)，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型(Aa)，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。
利用本发明A/a基因高通量KASP分子标记检测供试F2群体的120个单株中，SNP分型结果与CAPS-Alu I酶切结果(部分样品检测结果如图2所示)，有114株分析结果一致，吻合率达到95％，不吻合的单株酶切结果均为H(即C:T基因型)，而采用本发明的的高通量KASP标记分析结果为C:C基因型(见表1)，分析可能是CAPS-Alu I酶切方法中样品酶切不彻底所致。为了进一步证实发明人的推测，对本发明方法和CAPS-Alu I标记检测方法不吻合的样本进行CmACS7基因目标区段测序，结果证实了发明人的推测，本发明的结果是正确的(其为C:C基因型)。
(2)利用G/g高通量KASP分子标记体系分析亲本和F2群体单株CmWIP1基因的基因型，以已知基因型的甜瓜亲本材料甜瓜两性花株M26(aagg)和雌雄异花同株M29(AAGG)为对照，部分样品的检测结果如图3所示，根据G/g基因的G-A关键变异位点设计的标记引物，将F2群体单株进行SNP分型得到G:G、A:G和A:A三种基因型，分别对应为：GG、Gg和gg基因型。左下角显示黑色的样本为每个PCR板的空白对照，聚合在接近X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型(GG)，聚合在接近Y轴上的显示红色的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型(gg)，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型(Gg)，显示粉色的样本可能由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。
利用本发明G/g基因高通量KASP分子标记检测供试F2群体120个单株中，SNP分型结果与SCAR标记结果(部分样品检测结果如图4所示)，有117株均表现一致，吻合率达到97.5％(见表1)，部分不吻合的样品可能是由于SCAR标记要求样品浓度较高，样品浓度过低导致扩增条带模糊所致，为了进一步证实发明人的推测，对本发明方法和SCAR标记检测方法不吻合的样本对目标区段进行测序，结果证实了发明人的推测，本发明的结果是正确的。
(3)本发明A/a基因和G/g基因高通量KASP分子标记检测所有供试F2群体单株的SNP分型结果均与性别表型相符合，基因型A_G_表现为雌雄异花同株，基因型A_gg表现为全雌株，基因型aaG_表现为雄全同株，基因型aagg为两性花株，准确率达到100％。
120个F2群体单株的具体分析结果见表1。
表1 F2群体A和g的基因型分析结果与表型比较分析
注：表1中粗体部分是本发明检测方法与现有对照方法检测结果差异处。
二、高通量KASP分子标记在甜瓜雌性系转育方面的应用
以甜瓜两性花株M26(aagg)和甜瓜雌雄异花同株M29(AAGG)为亲本进行杂交获取的F1代，F1代自交获得F2代。从F2代中选取经步骤一鉴定为AAgg基因型的纯合雌性系，以其为供体亲本(记为P1)，分别以甜瓜品种玉姑(雄全株，aaGG基因型，记为P2)、甜瓜品种长香玉(雄全株，aaGG基因型，记为P3)、甜瓜品种西州蜜25号(雄全株aaGG基因型，记为P4)为轮回亲本进行甜瓜雌性系的回交转育，利用实施例1获得的A/a和G/g基因的高通量分子标记进行基因型检测，具体操作方法参见实施例2。
其中，亲本甜瓜的基因型是利用实施例1获得的A/a和G/g基因的高通量分子标记进行基因型检测(具体操作方法参见实施例2)，并经测序验证后获得的。
试验中，BC群体保留检测基因型为AaGg的植株，BC4F2群体保留AAgg纯合雌性系株。待植株长至10片真叶左右时，进行田间鉴定，调查所保留株花的性型，验证田间调查表型结果是否与基因型检测结果吻合。
通过对不同回交群体基因型数据统计分析，发现利用A/a和G/g基因的高通量分子标记分析得到的回交后代的基因型分离比例符合理论预期(见表2)，对通过KASP标记分析保留的具有目标基因型的植株进行后期表现型观察，发现保留植株的A/a基因和G/g基因高通量分子标记分析结果与植株性型调查结果吻合率高达100％。在回交转育的过程中，随着回交代数的增加果实品质和外观性状逐渐趋近于转育的轮回亲本。转育至BC4代果实品质和外观性状非常接近转育的轮回亲本，进一步将BC4进行了自交，通过高通量KASP分子标记对A/a和G/g基因的筛选，培育出符合目标性状的稳定的雌性系(AAgg)母本自交系。利用雌性系作母本进行甜瓜杂一代制种，省去了人工去雄的烦杂工序，大大简化了制种程序，降低制种成本，可提高杂一代种子纯度，是甜瓜杂一代有效的制种途径。
表2不同世代利用高通量KASP标记分析基因型统计结果

Claims (7)

1.用于检测甜瓜性别基因的成套KASP引物，所述甜瓜性别基因为CmACS7基因和CmWIP1基因，其特征在于：所述成套KASP引物由如下（1）和（2）组成：
（1）特异于所述CmACS7基因的KASP引物：引物1、引物2和引物3；所述引物1为核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中序列3所示的单链DNA；
（2）特异于所述CmWIP1基因的KASP引物：引物4、引物5和引物6；所述引物4为核苷酸序列如序列表中序列4所示的单链DNA；所述引物5为核苷酸序列如序列表中序列5所示的单链DNA；所述引物6为核苷酸序列如序列表中序列6所示的单链DNA。
2.用于检测甜瓜性别基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的成套KASP引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A的核苷酸序列如序列表中序列1的第1-21位所示，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-21位所示序列的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团；
所述荧光探针B的核苷酸序列如序列表中序列2的第1-21位所示，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-21位所示序列的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团；
所述荧光基团A为FAM；所述荧光基团B为HEX；所述淬灭基团为BHQ。
4.权利要求1所述的成套KASP引物或权利要求2或3所述的试剂盒在如下任一中的应用：
（1）检测或辅助检测甜瓜性别基因的基因型，所述甜瓜性别基因为CmACS7基因和CmWIP1基因；
（2）培育甜瓜雌性系。
5.一种检测或辅助检测甜瓜性别基因的基因型的方法，所述甜瓜性别基因为CmACS7基因和CmWIP1基因，其特征在于：所述方法为如下（A）和（B）：
（A）检测或辅助检测待测甜瓜的CmACS7基因的基因型的方法，包括如下步骤：
以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述试剂盒中的所述“特异于所述CmACS7基因的KASP引物”进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为aa；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为AA；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmACS7基因的基因型为Aa；
（B）检测或辅助检测待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测甜瓜的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的试剂盒中的所述“特异于所述CmWIP1基因的KASP引物”进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型：若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为GG；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为gg；若所述待测甜瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测甜瓜的CmWIP1基因的基因型为Gg。
6.权利要求5所述方法在培育甜瓜雌性系中应用。
7.一种培育具有目标性状的甜瓜雌性系的方法，包括如下步骤：采用不具所述目标性状、通过权利要求5所述的方法检测得到的CmACS7基因的基因型为AA且CmWIP1基因的基因型为gg的甜瓜雌性系作为供体亲本，采用具有所述目标性状的甜瓜作为轮回亲本，进行回交，并将回交后代进行自交，从自交后代中获得具有所述目标性状、通过权利要求5所述的方法检测得到的CmACS7基因的基因型为AA且CmWIP1基因的基因型为gg的甜瓜雌性系。
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