CN109593879A

CN109593879A - 稻米中等直链淀粉含量基因Wxg1的SNP功能分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109593879A
Application number: CN201910100039.3A
Authority: CN
Inventors: 滕斌; 倪大虎; 宋丰顺; 倪金龙; 甘泉; 林翠香
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明公开了稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记及其应用，属于水稻分子育种领域。本发明所述稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记，包括由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的前引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的后引物组成的引物组Ex6‑P_C，由核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的前引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的后引物组成的引物组Ex6‑P_A。本发明所述SNP功能分子标记可以快速、准确地判断被检水稻样品是否含有Wx^g1基因，以及含有的Wx^g1基因型为纯合或杂合，进而实现对Wx^g1基因的分子标记辅助选择，有效提高分子育种辅助选择效率。

Description

稻米中等直链淀粉含量基因Wxg1的SNP功能分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记，还涉及所述SNP功能分子标记在检测水稻Wx^g1基因中的应用，属于水稻分子育种领域。

背景技术

水稻是世界上的主要粮食作物之一，水稻生产对于中国粮食安全、社会稳定和经济发展有着重要的作用。随着人民生活水平的日益提高，作为水稻育种重要目标之一的稻米品质愈来愈受到育种工作者和消费者的重视。以往研究表明，稻米直链淀粉含量是决定米饭质地和食味的重要因素。不同水稻品种直链淀粉含量差异较大，稻米直链淀粉含量一般可分为糯(0-2％)、低(6-18％)、中等(19-23％)和高(>24％)(Chen MingHsuan等,Journal of Cereal Science,2008(47):536–545；Teng Bin等,Molecular breeding,2012(30):583–595)。低直链淀粉含量的稻米煮饭胀性小，米饭较湿粘，进入人体后消化快，易引起餐后血糖升高；高直链淀粉含量的稻米煮饭胀性大，米饭干，冷后质硬口感不好，但消化吸收速度较慢，有利于保持餐后血糖稳定；中等直链淀粉含量稻米的口感和消化时间介于低与高直链淀粉含量稻米中间，既符合大部分人的食味习惯，又能避免稻米消化速度过快，保持餐后血糖的稳定。以中国南方、美国和印度尼西亚为例，这些地区的消费者偏爱的稻米直链淀粉含量大部分一般在19-23％之间。

水稻Wx基因(编码GBSS酶)是控制稻米直链淀粉合成的主效基因。Teng Bin等(Molecular breeding,2012(30):583–595)依据表观直链淀粉含量、GBSS酶活和核酸多态位点，将Wx基因可被划分为5类常见的功能等位基因，分别为wx、Wx^t、Wx^g1、Wx^g2和Wx^g3，直链淀粉含量表型分别对应于糯(2.1-2.4％)、低(12.1-16.0％)、中(21.7-23.8％)、较高(24.4-25.2％)和高(25.8-26.2％)。其中引起Wx^g1等位基因与其他Wx等位基因直链淀粉含量表型差异的核酸序列为第6外显子(EX6)上的一个A/C突变，Ex6C的表型为中等直链淀粉含量(21-23％)，Ex6A的表型则为其他直链淀粉含量。因此，只需要检测Ex6的A/C突变就可以判断水稻品系是否携带Wx^g1等位基因。

Chen等(Mol Breeding(2010)26:513-523)应用等位基因特异PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)方法对EX6上的A/C基因型进行了分型；毛艇等(水稻Wx复等位基因基于PCR的功能标记开发与利用,作物学报,2017,43(11):1715-1723.)应用四引物扩增受阻突变(tetra-primer ARMS)技术进行了EX6A/C功能标记的开发，并对水稻品种的Wx基因型进行了鉴定。但是，由于Chen等(Mol Breeding(2010)26:513-523)的AS-PCR标记对Taq酶有特定要求(需Tfl polymerase，普通Taq酶无法有效扩增)，且PCR反应程序步骤烦琐，所以使用起来存在费用昂贵、PCR耗时长、扩增效果不稳定的弊端。毛艇等(作物学报,2017,43(11):1715-1723.)开发的ARMS-PCR功能标记需要4条引物，且对PCR扩增条件要求苛刻，扩增效果易受4条引物浓度变化和退火温度的影响而波动较大，使用起来也存在步骤烦琐和扩增效果不稳定的一系列弊端。因此，需要开发一种新的基于AS-PCR技术的EX6A/C突变位点功能SNP标记，实现对水稻Wx^g1基因进行快速、准确、经济简单，稳定的鉴定。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述SNP功能分子标记在快速、准确检测水稻Wx^g1基因和基因型，以及水稻Wx^g1基因的分子标记辅助选育中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记，包括：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的前引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的后引物组成的引物组Ex6-P_C；或者，由核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的前引物和核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示的后引物组成的引物组Ex6-P_A中的任意一对或两对。

稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1为C基因型，C/A多态位点位于Wx基因第6外显子第63碱基处。为了检测C/A多态，本发明采用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法进行引物设计，以C/A SNP位点为引物的3’端，通过在3’端引入1至2个错配碱基设计特异识别C或A位点的前引物，2个前引物的后引物为相同引物。本发明所设计的用于筛选Ex6C/A多态位点的多条前引物序列中，核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的前引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的Ex6-R后引物可以特异扩增C基因型模板，不能扩增A基因型模板；核苷酸序列为SEQ IDNo.2所示的前引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的Ex6-R后引物可以特异扩增A基因型模板，不能扩增C基因型模板。本发明将上述筛选获得的特异性强的用于检测C/A多态的两对引物组，分别命名为引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A，两组前引物共用的后引物为Ex6-R。

本发明进一步公开了所述的SNP功能分子标记在检测水稻品系是否携带Wx^g1基因中的应用。

本发明进一步公开了所述的SNP功能分子标记在检测水稻品系所携带Wx^g1基因的基因型中的应用。

本发明进一步公开了所述的SNP功能分子标记在水稻Wx^g1基因的分子标记辅助选育中的应用。

本发明还公开了一种检测水稻品系是否携带Wx^g1基因的方法，包括以下步骤：(1)提取待测水稻的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，以本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物产生150bp目的条带，则待测水稻携带Wx^g1基因；若扩增产物不产生条带，则待测水稻不携带Wx^g1基因。

本发明还公开了一种检测水稻品系是否携带Wx^g1基因以及所携带Wx^g1基因的基因型的方法，包括以下步骤：(1)提取待测水稻的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，分别以本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若引物组Ex6-P_C扩增产物产生150bp目的条带，引物组Ex6-P_A扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Wx^g1基因，且Wx^g1基因型为纯合；若引物组Ex6-P_C扩增产物不产生条带，引物组Ex6-P_A扩增产物产生150bp目的条带，则待测水稻不含有Wx^g1基因；若引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A扩增产物均产生150bp目的条带，则待测水稻含有Wx^g1基因，且Wx^g1基因型为杂合。

本发明所述检测水稻品系是否携带Wx^g1基因的方法，或者检测水稻品系是否携带Wx^g1基因以及所携带Wx^g1基因的基因型的方法中，所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为20μL，其中，ddH₂O 9.4μL，10×Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 2.0μL，10.0mmol/LdNTPs 0.4μL，5.0U/μL Taq酶0.2μL，5μmol/L前引物2.0μL，5μmol/L后引物2.0μL，模板DNA2.0μL；其中，模板DNA原浓度在20-200ng/μL；所述PCR反应体积可选择在5-25μL之间。所述PCR扩增的程序包括：95℃变性5min后，94℃45S，退火温度58℃45S，72℃45S，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温。

本发明还公开了一种水稻Wx^g1基因的分子标记辅助选育的方法，包括以下步骤：

(1)以不含Wx^g1基因的水稻品种为母本，与携Wx^g1基因的水稻品种杂交，获得F₁代；

(2)以不含Wx^g1基因的水稻品种为轮回亲本，将F₁代与轮回亲本回交，获得BC₁F₁代；

(3)选取BC₁F₁代单株，利用本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C进行代换片段检测，选择携Wx^g1基因的BC₁F₁单株，将获选BC₁F₁单株与轮回亲本回交产生BC₂F₁代；

(4)选取BC₂F₁代单株，利用本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C进行代换片段检测，选择携Wx^g1基因的BC₂F₁单株，继续与轮回亲本回交产生BC₃F₁代；

(5)选取BC₃F₁代单株，利用本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C进行代换片段检测，选择携Wx^g1基因的BC₃F₁单株，继续与轮回亲本回交产生BC₄F₁代；

(6)BC₄F₁代自交产生BC₄F₂代，选取BC₄F₂代单株，利用本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A进行双标记检测，选择携有Wx^g1纯合基因的改良株系。

其中，步骤(3)、步骤(4)或步骤(5)所述代换片段检测包括：提取待测水稻单株的基因组DNA，以提取的DNA为模板，以本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C建立PCR反应体系，进行PCR扩增；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物产生150bp目的条带，则待测水稻单株携带Wx^g1基因；若扩增产物未产生条带，则待测水稻单株不携带Wx^g1基因；

步骤(6)所述双标记检测包括：提取待测BC₄F₂代单株的基因组DNA；以提取的DNA为模板，分别以本发明所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A建立PCR反应体系，进行PCR扩增；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若引物组Ex6-P_C扩增产物产生150bp目的条带，且引物组Ex6-P_A扩增产物不产生条带，则待测BC₄F₂代单株携有Wx^g1纯合基因。

本发明所述水稻Wx^g1基因的分子标记辅助选育的方法，步骤(3)、步骤(4)或步骤(5)所述代换片段检测、步骤(6)所述双标记检测中，所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为20μL，其中，ddH₂O 9.4μL，10×Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 2.0μL，10.0mmol/LdNTPs 0.4μL，5.0U/μL Taq酶0.2μL，5μmol/L前引物2.0μL，5μmol/L后引物2.0μL，模板DNA2.0μL；其中模板DNA原浓度在20-200ng/μL；所述PCR反应体积可选择在5-25μL之间。所述PCR扩增的程序包括：95℃变性5min后，94℃45S，退火温度58℃45S，72℃45S，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温。

本发明利用Ex6-P_C和Ex6-P_A引物组分别对Wx^g1基因供体Basmati 370、早籼14、与早籼14杂交后代水稻材料的基因组DNA进行扩增，结果Ex6-P_C和Ex6-P_A引物组的扩增产物长度均为150bp；对Wx^g1基因供体Basmati 370，引物Ex6-P_C扩增产物产生条带，引物Ex6-P_A扩增产物不产生条带；对早籼14，引物Ex6-P_C扩增产物不产生条带，引物Ex6-P_A扩增产物产生条带；对早籼14/Basmati 370杂交后代水稻材料，引物Ex6-P_C和Ex6-P_A扩增产物均产生条带。

本发明利用Wx^g1基因SNP功能标记中的Ex6-P_C引物对Wx^g1基因进行快速鉴定，PCR扩增结果表明，水稻品系IR64、Basmati 370、桂小占、南洋占、IAPAR9和Lemont扩增产物产生条带，说明携带有Wx^g1基因；水稻品系9311、1892S、Y58S、豪恢808和早籼14扩增产物不产生条带，说明没有携带Wx^g1基因。

本发明应用SNP标记Ex6-P_C和Ex6-P_A对Wx^g1基因辅助选育，为了将Wx^g1基因转入具有低直链淀粉含量性状的水稻材料，选择不含Wx^g1基因的早籼14与携有Wx^g1基因水稻品种Basmati 370杂交，获得F₁杂交种子。采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法将Wx^g1基因转入受体亲本中。以早籼14为轮回亲本，抽穗期完成杂交种F₁与早籼14的回交，获回交一代BC₁F₁；从BC₁F₁代起，选取单株，利用Ex6-P_C标记进行代换片段检测，选择携Wx^g1基因的单株，获选单株继续回交产生BC₂F₁代；选取BC₂F₁代单株继续进行Ex6-P_C标记检测，获选单株继续回交产生BC₃F₁代；选取BC₃F₁代单株继续进行Ex6-P_C单标记检测，获选单株继续回交产生BC₄F₁代；BC₄F₁代自交，BC₄F₂代选取单株进行Ex6-P_C和Ex6-P_A双标记检测，选择到携有Wx^g1纯合基因的早籼14改良后单株。收获改良型早籼14(早籼14-G1)种子，早籼14-G1的直链淀粉含量经测定为22.7％，原早籼14的直链淀粉含量为12.2％。

本发明通过SNP分子标记辅助选择水稻Wx^g1基因，具有快速、准确、经济、简单、稳定的优点。本发明仅需1组SNP引物标记Ex6-P_C(2条引物)便能实现对水稻品系及回交后代是否含有Wx^g1基因的检测，另1组SNP引物标记Ex6-P_A在分子标记辅助选择最后一步(检测自交纯合体)时需要。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明所开发的水稻中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记，可以准确、快速地判断被检水稻样品是否含有Wx^g1基因，以及含有的Wx^g1基因型为纯合或杂合，进而实现对Wx^g1基因的分子标记辅助选择。本发明所述分子标记位于Wx^g1基因内部，与Wx^g1基因共分离，可以更有效的提高分子育种辅助选择效率。相比于以往开发的AS-PCR和ARMS-PCR功能标记，本发明所述SNP分子标记对Taq酶无特定要求，PCR扩增反应条件无需优化，操作简单，易于推广。

附图说明

图1为Ex6-P_C和Ex6-P_A标记引物序列及SNP位点在Wx基因序列中的位置；方框为引入的错配碱基及位置；**表示人为引入的错配碱基；

图2为引物Ex6-P_C和Ex6-P_A在部分水稻亲本及杂交F₁中PCR扩增结果；注：M，标准分子量；1，Basmati 370；2，早籼14；3，早籼14/Basmati 370；

图3为应用Ex6-P_C标记快速度检测Wx^g1基因；注：M，标准分子量；1，9311；2，1892S；3，Y58S；4，IR64；5，Basmati 370；6，桂小占；7，南洋占；8，豪恢808；9，IAPAR9；10，Lemont；11，早籼14；

图4为应用Ex6-P_C和Ex6-P_A标记辅助选择Wx^g1基因的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记的开发

本发明所述中等直链淀粉含量基因为Wx^g1；所述SNP为C/A多态，Wx^g1基因为C基因型，C/A多态位点位于Wx基因第6外显子第63碱基处，其核苷酸序列如图1所示。

为了检测C/A多态，采用等位基因特异PCR(AS-PCR)方法进行设计(图1)。以C/ASNP位点为引物的3’端，通过在3’端引入1至2个错配碱基设计特异识别C或A位点的前引物，2个前引物的后引物为相同引物。本发明设计的用于筛选C/A多态的错配引物序列见表1。如表1所示，C-3前引物和Ex6-R后引物可以特异扩增C基因型模板，不能扩增A基因型模板；A-2前引物和Ex6-R后引物可以特异扩增A基因型模板，不能扩增C基因型模板。

表1用于筛选Ex6C/A多态位点的前引物序列

注：人为引入的错配碱基用下划线突出表示；筛选Ex6C/A多态位点的后引物序列为Ex6-R(AGTCGTTGCAGACGAACACAAC)。

在上述研究基础上，本发明筛选出特异性强的用于检测C/A多态的两对引物组，分别命名为引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A；两组前引物共用的后引物命名为Ex6-R。

Ex6-P_C引物组前引物Ex6-F_C核苷酸序列为：

Ex6-F_C：AACAACCCATACTTCAAAGGAAGATC；

Ex6-P_A引物组前引物Ex6-F_A核苷酸序列为：

Ex6-F_A：AACAACCCATACTTCAAAGGAAGGTA；

Ex6-P_C和Ex6-P_A引物组的通用后引物Ex6-R核苷酸序列为：

Ex6-R：AGTCGTTGCAGACGAACACAAC。

实施例2水稻Wx^g1基因SNP功能分子标记应用于Wx^g1基因的检测验证

(1)基因组DNA提取

CTAB法提取水稻基因组DNA。剪取Wx^g1基因供体Basmati 370、早籼14(直链淀粉含量为12.2％)、与早籼14杂交后代水稻材料幼嫩叶片100-200mg，移入2.0mL离心管中，向离心管中加液氮用玻棒充分研磨至粉末状，再加入700μL 65℃预热的DNA提取液(81.7g NaCl和20g CTAB充分溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl 100mL，0.5mol/L EDTA 40mL，定容至1000mL，4℃贮存。)，65℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次；加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓混匀，室温静置15min；12,000rpm离心15min，吸取上清移至另一支1.5mL离心管中，再加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃30min，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，加入200μL70％乙醇洗涤沉淀；12,000rpm离心10min后弃去乙醇，室温干燥后加入50μL灭菌水，充分溶解后备用。

(2)PCR扩增

以待测水稻材料的基因组DNA为模板，分别用引物组Ex6-P_C和Ex6-P_A进行PCR扩增，扩增体系中各组分配制见表2。

表2 PCR反应体系

注：反应体积可选择在5-25μL之间，模板DNA原浓度在20-200ng/μL之间。

扩增条件为：反应程序为：95℃变性5min后，94℃45S，退火温度58℃45S，72℃45S，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温。扩增产物采用2.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(3)Wx^g1基因的检测验证

利用Ex6-P_C和Ex6-P_A引物组分别对Wx^g1基因纯合体、杂合体和不含Wx^g1基因品种进行扩增。如图2所示，Ex6-P_C和Ex6-P_A引物组的扩增产物长度均为150bp。如引物Ex6-P_C扩增产物产生条带，引物Ex6-P_A扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Wx^g1基因，且Wx^g1基因型为纯合；进一步的，如引物Ex6-P_C扩增产物不产生条带，引物Ex6-P_A扩增产物产生条带，则待测水稻不含有Wx^g1基因；进一步的，如引物Ex6-P_C和Ex6-P_A扩增产物均产生条带，则待测水稻含有Wx^g1基因，Wx^g1的基因型为杂合。

实施例3应用SNP标记Ex6-P_C对水稻品系资源进行Wx^g1基因检测

以水稻品系9311、1892S、Y58S、IR64、Basmati 370、桂小占、南洋占、豪恢808、IAPAR9、Lemont、早籼14为试验材料。提取这些水稻材料的DNA，利用Wx^g1基因SNP功能标记中的Ex6-P_C引物对Wx^g1基因进行快速鉴定。PCR扩增结果见图3，可以看出：IR64、Basmati 370、桂小占、南洋占、IAPAR9和Lemont携带有Wx^g1基因；9311、1892S、Y58S、豪恢808和早籼14没有携带Wx^g1基因。

实施例4应用SNP标记Ex6-P_C和Ex6-P_A对Wx^g1基因辅助选育

为了将Wx^g1基因转入具有低直链淀粉含量性状的水稻材料，选择生产上推广的低直链淀粉含量、高产、抗病的水稻品种为母本(受体)与具有Wx^g1基因的水稻品系杂交获得F₁杂交种子。采用回交和分子标记辅助选择相结合的方法将Wx^g1基因转入受体亲本中，回交试验方案如图4所示。从BC₁F₁代起，选取10个左右单株进行代换片段检测，采用Ex6-P_C单标记在BC₁F₁进行单株选择，获选单株继续回交产生BC₂F₁代；BC₂F₁代选取10个单株用于继续进行Ex6-P_C标记检测，根据结果，选取单株继续回交产生BC₃F₁；BC₃F₁代选取10个单株继续进行Ex6-P_C单标记检测，根据结果，选取单株继续回交产生BC₄F₁；BC₄F₁代自交，BC₄F₂代选取10个单株进行Ex6-P_C和Ex6-P_A双标记检测，选择到携有供体Wx^g1纯合基因的改良株系。

具体的，按图4所示Wx^g1基因辅助选育路线，选择不含Wx^g1基因的早籼14与携有Wx^g1基因水稻品种Basmati 370杂交，获得F₁种子；播种F₁和早籼14，以早籼14为轮回亲本，抽穗期完成杂交种F₁与早籼14的回交，获回交一代BC₁F₁种子；播种BC₁F₁和早籼14，从BC₁F₁代起，选取10个单株，利用Ex6-P_C标记进行代换片段检测，选择到携Wx^g1基因BC₁F₁单株，抽穗期获选BC₁F₁单株与早籼14回交，获回交二代BC₂F₁种子；播种BC₂F₁和早籼14，选取10个单株继续进行Ex6-P_C标记检测，选择到携Wx^g1基因BC₂F₁单株，继续与早籼14回交产生BC₃F₁；播种BC₃F₁和早籼14，选取10个单株继续进行Ex6-P_C标记检测，选择到携Wx^g1基因BC₃F₁单株，继续与早籼14回交产生BC₄F₁；BC₄F₁代自交，收获BC₄F₂种子，BC₄F₂代进行Ex6-P_C和Ex6-P_A双标记检测，选择到携有Wx^g1纯合基因的早籼14改良后单株；收获改良型早籼14(早籼14-G1)种子，早籼14-G1的直链淀粉含量经测定为22.7％，原早籼14的直链淀粉含量为12.2％。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 稻米中等直链淀粉含量基因Wxg1的SNP功能分子标记及其应用

<130> AH-2001-181211A

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

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<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 10

caacccatac ttcaaaggaa cctc 24

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 11

aacaacccat acttcaaagg aacata 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 12

aacaacccat acttcaaagg aaccta 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 13

aacaacccat acttcaaagg aagcta 26

Claims

1.稻米中等直链淀粉含量基因Wx^g1的SNP功能分子标记，其特征在于，包括：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的前引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的后引物组成的引物组Ex6-P_C；或者，

由核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的前引物和核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的后引物组成的引物组Ex6-P_A中的任意一对或两对。

2.权利要求1所述的SNP功能分子标记在检测水稻品系是否携带Wx^g1基因中的应用。

3.权利要求1所述的SNP功能分子标记在检测水稻品系所携带Wx^g1基因的基因型中的应用。

4.权利要求1所述的SNP功能分子标记在水稻Wx^g1基因的分子标记辅助选育中的应用。

5.一种检测水稻品系是否携带Wx^g1基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测水稻的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物产生150bp目的条带，则待测水稻携带Wx^g1基因；若扩增产物不产生条带，则待测水稻不携带Wx^g1基因。

6.一种检测水稻品系是否携带Wx^g1基因以及所携带Wx^g1基因的基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测水稻的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，分别以权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若引物组Ex6-P_C扩增产物产生150bp目的条带，引物组Ex6-P_A扩增产物不产生条带，则待测水稻含有Wx^g1基因，且Wx^g1基因型为纯合；若引物组Ex6-P_C扩增产物不产生条带，引物组Ex6-P_A扩增产物产生150bp目的条带，则待测水稻不含有Wx^g1基因；若引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A扩增产物均产生150bp目的条带，则待测水稻含有Wx^g1基因，且Wx^g1基因型为杂合。

7.按照权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为20μL，其中，ddH₂O 9.4μL，10×Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 2.0μL，10.0mmol/LdNTPs 0.4μL，5.0U/μL Taq酶0.2μL，5μmol/L前引物2.0μL，5μmol/L后引物2.0μL，模板DNA2.0μL；

所述PCR扩增的程序包括：95℃变性5min后，94℃45S，退火温度58℃45S，72℃45S，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温。

8.一种水稻Wx^g1基因的分子标记辅助选育的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)选取BC₁F₁代单株，利用权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C进行代换片段检测，选择携Wx^g1基因的BC₁F₁单株，将获选BC₁F₁单株与轮回亲本回交产生BC₂F₁代；

(4)选取BC₂F₁代单株，利用权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C进行代换片段检测，选择携Wx^g1基因的BC₂F₁单株，继续与轮回亲本回交产生BC₃F₁代；

(5)选取BC₃F₁代单株，利用权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C进行代换片段检测，选择携Wx^g1基因的BC₃F₁单株，继续与轮回亲本回交产生BC₄F₁代；

(6)BC₄F₁代自交产生BC₄F₂代，选取BC₄F₂代单株，利用权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A进行双标记检测，选择携有Wx^g1纯合基因的改良株系。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)、步骤(4)或步骤(5)所述代换片段检测包括：提取待测水稻单株的基因组DNA，以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C建立PCR反应体系，进行PCR扩增；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物产生150bp目的条带，则待测水稻单株携带Wx^g1基因；若扩增产物不产生条带，则待测水稻单株不携带Wx^g1基因；

步骤(6)所述双标记检测包括：提取待测BC₄F₂代单株的基因组DNA，以提取的DNA为模板，分别以权利要求1所述SNP功能分子标记中的引物组Ex6-P_C和引物组Ex6-P_A建立PCR反应体系，进行PCR扩增；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若引物组Ex6-P_C扩增产物产生150bp目的条带，且引物组Ex6-P_A扩增产物不产生条带，则待测BC₄F₂代单株携有Wx^g1纯合基因。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为20μL，其中，ddH₂O 9.4μL，10×Buffer 2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 2.0μL，10.0mmol/LdNTPs 0.4μL，5.0U/μL Taq酶0.2μL，5μmol/L前引物2.0μL，5μmol/L后引物2.0μL，模板DNA2.0μL；