CN111471790B - 与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau‑7D.1紧密连锁的分子标记，该分子标记为KASP705，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；分子标记KASP705与小麦籽粒灌浆速率QTL紧密连锁。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦籽粒灌浆速率QTL，预测小麦的籽粒灌浆速率特性，进而方便进行分子设计育种。检测分子标记为KASP705能够加强小麦籽粒灌浆速率预测的准确性，以便快速筛选出具有增加籽粒灌浆速率的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦高产品种的选育进程。

Description

与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子 标记及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及一种与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记KASP705及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上重要的粮食作物之一，超过40％的人口以小麦作为主食原料。在我国，小麦不管是在农业生产部分还是食品加工领域都占有及其重要的地位，是最主要的粮食作物之一。小麦籽粒的灌浆速率和灌浆持续期直接影响着籽粒最终的大小、品质以及粒重，最终决定小麦的产量。灌浆特性不仅影响着粒重，同样也与籽粒最终的大小、饱满指数及商品性密切相关。灌浆速率指单位时间籽粒干物质积累量，其呈现出“慢-快-慢”“S”型曲线生长的变化规律，反映了淀粉和蛋白质合成的生化反应效率(Shewry PR.Wheat[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(6):1537-1553.)。研究小麦籽粒灌浆过程中籽粒灌浆速率的遗传机制，对提高小麦产量具有重要意义。
籽粒灌浆速率是数量性状(Quantitative trait locus，QTL)，受到多基因的控制，并且受环境作用影响很大。近年来，籽粒灌浆速率逐渐成为研究的热点。在水稻、玉米、大麦中都有对籽粒灌浆速率QTL研究的相关报道，而小麦籽粒灌浆速率的却是很少。Kirigwi等在4A染色体的Xgwm601～Xwmc420区段上定位到了控制籽粒灌浆速率的QTL，可解释33％的表型变异(Kirigwi F,Van M,Brown G,et al.Markers associated with a QTLfor grain yield in wheat under drought[J].Molecular Breeding,2007,20(4):401-413.)。Bhusal等利用HD2808和HUW510构建的重组自交系群体发现控制籽粒灌浆速率的QTL位于染色体2A上(Bhusal N,Sarial A,Sharma P,et al.Mapping QTLs for grain yieldcomponents in wheat under heat stress[J].PloS One,2017,12(12):e0189594.)。
小麦材料H461相对于小麦品种川农16(国审品种)具有籽粒快速灌浆、寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性(侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系H461遗传差异研究初报.四川农业大学学报.2003,21:94-9)。同时，小麦品种川农16的灌浆速率显著低于H461。因此，利用H461和川农16构建遗传研究群体，进一步验证小麦H461的籽粒灌浆速率特性，定位控制籽粒灌浆速率基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进籽粒灌浆速率基因的图位克隆，同时为小麦特异籽粒灌浆速率材料的创制及高产育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强籽粒灌浆速率预测的准确性，提高育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。
分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNP和特定位点上的Indel进行精准的双等位基因检测。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与籽粒灌浆速率QTL紧密连锁的，且适用于荧光定量PCR平台KASP技术的分子标记，不仅能对小麦籽粒灌浆速率基因进行选择，有效调控小麦籽粒形态建成，塑造合理的籽粒形态建成群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供所述分子标记在小麦育种中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.si cau-7D.1紧密连锁的分子标记，其为分子标记KASP705，核苷酸序列SEQ ID NO.1所示(5’-CTGGAGGACGCTGTTGCNGTAGCAGGTGTTGCCGAAGTTCTCGAGGCCGAAGT-3’；其中，N为A或G)，即所述序列第18位碱基的多态性为A/G，该多态性与小麦籽粒灌浆速率相关。
分子标记KASP705与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁，二者共定位于7D染色体上标记SNP5701～SNP6093区段内，小麦籽粒灌浆QTL QGfr.sicau-7D.1能显著增加小麦籽粒灌浆速率，LOD值大于4，解释12.62％的表型变异。
本发明还提供用于荧光定量PCR扩增所述分子标记KASP705的特异性引物组。
本领域技术人员可以基于KASP检测平台技术设计用于扩增分子标记KASP705的引物，优选地，所述特异性引物对包括序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物。其中，SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示的引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
KASP705-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGGAGGACGCTGTTGCA-3’；(SEQ ID NO.2)
KASP705-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGAGGACGCTGTTGCG-3’；(SEQ ID NO.3)
KASP705-3:5’-ACTTCGGCCTCGAGAACTTC-3’；(SEQ ID NO.4)
并且，引物KASP705-1和KASP705-2的5’端分别连有不同的荧光探针；
所述荧光探针的序列如下：
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQ ID NO.5)，本发明的实施例中该探针结合FAM荧光基团。
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO.6)本发明的实施例中该探针结合HEX荧光基团。
本发明提供了分子标记KASP705或上述特异性引物的如下任一种应用：
(1)在鉴定小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1中的应用；
(2)在筛选或鉴定籽粒快速灌浆的小麦品种中的应用；
(3)在小麦分子标记辅助育种中的应用；
(4)在小麦种质资源改良中的应用。
本发明还提供了一种鉴定小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的方法，以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述的特异性引物组进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型。
优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP AssayMix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASPAssay Mix中含有引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示，三条引物体积比为2:2:5。
本发明的实施例中，荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
本发明提供的鉴定小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的方法的判断标准为：含有小麦籽粒快速灌浆QTL QGfr.sicau-7D.1的小麦品种均出现与SEQ ID NO.2所示引物标记的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的小麦品种均出现与SEQ ID NO.2所示引物标记的荧光探针明显不同的荧光信号。
在本发明中，小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1及分子标记KASP705是通过以下方法获得的：
(1)利用籽粒快速灌浆小麦H461作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有249个株系的F8代RIL群体，随机选择188个株系构成遗传作图群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用Illumina 90K SNP芯片技术，以亲本H461和川农16的DNA为模板，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B。
用CTAB法提取所述的亲本，F8群体的各单株的DNA，从数据库http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index下载获得目标区间内scaffold序列信息，根据区间内90K SNP信息，利用DNAMAN 6.0软件对差异位点进行KASP分子标记开发设计荧光定量引物。获得亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。
(3)小麦灌浆期田间鉴定所述F8群体植株的籽粒灌浆速率。
(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件IciMapping 4.1的完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping)，并结合F8群体籽粒灌浆速率表型数据将籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1定位于7D染色体上SNP5701～SNP6093的区段内。
(5)将目标区段内SNP位点转换为荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN6.0软件设计荧光定量PCR引物7对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列
正向引物2：H探针+扩增引物序列
反向引物：扩增引物序列
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
表1 7对KASP引物序列及扩增片段长度
Figure BDA0002468408710000051
Figure BDA0002468408710000061
(6)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分析
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的7对引物，以亲本H461和川农16的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为KASP705-1/2/3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记KASP705，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
b)F8群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记KASP705的PCR引物，扩增亲本H461、川农16和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长53bp，单碱基差异位点为A。亲本川农16的类型记为B，扩增片段长53bp，单碱基差异位点为G。F8群体株系类型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B。
本发明具有以下优点：本发明首次公开了来自小麦H461的籽粒灌浆速率QTLQGfr.sicau-7D.1，位于小麦7D染色体，显著增加了小麦籽粒灌浆速率。该QTL在小麦产量(调控籽粒灌浆速率)育种中具有较高的利用价值。本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦H461新籽粒灌浆速率QGfr.sicau-7D.1的分子标记KASP705，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。本发明公开的分子标记KASP705与籽粒灌浆速率QTLQGfr.sicau-7D.1显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定籽粒灌浆速率品种的选择鉴定效率，且成功率高。
附图说明
图1为本发明小麦H461籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1在6D染色体上的位置及与分子标记KASP705之间的连锁遗传图谱。
图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR引物对H461、川农16、川麦107三叶期的叶片DNA做基因型分型的结果。
图3为本发明实施例2中H461×川麦107的F8 RIL群体后代利用荧光定量PCR引物进行基因型分型的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1及分子标记KASP705的获得
在本发明中，小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1及分子标记KASP705是通过以下方法获得的：
(1)利用籽粒快速灌浆小麦H461作为母本，以小麦川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得含有249个株系的F8代RIL群体，随机选择188个株系构成遗传作图群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用Illumina 90K SNP芯片技术，以亲本H461和川农16的DNA为模板，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B。
用CTAB法提取所述的亲本，F8群体的各单株的DNA，从数据库http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index下载获得目标区间内scaffold序列信息，根据区间内90K SNP信息，利用DNAMAN 6.0软件对差异位点进行KASP分子标记开发设计荧光定量引物。获得亲本H461的带型记为A，亲本川农16的带型记为B。
(3)小麦灌浆期田间鉴定所述F8群体植株的籽粒灌浆速率。
(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件IciMapping 4.1的完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping)，并结合F8群体籽粒灌浆速率表型数据将籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1定位于7D染色体上一个16.24cM(侧翼标记SNP5701和SNP6093)的区段内。
(5)将SNP标记SNP5701、SNP6093转换荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN 6.0软件设计荧光定量PCR引物7对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列
正向引物2：H探针+扩增引物序列
反向引物：扩增引物序列
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
(6)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分析
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的7对引物，以亲本H461和川农16的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为KASP705-1/2/3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记KASP705，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
b)F8群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记KASP705的PCR引物，扩增亲本H461、川农16和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长53bp，单碱基差异位点为A。亲本川农16的类型记为B，扩增片段长53bp，单碱基差异位点为G。F8群体株系类型来源于H461的记为A，来源于川农16的记为B。
c)利用软件IciMapping 4.1的完备区间作图法(Inclusive Composite IntervalMapping)，并结合F8群体籽粒灌浆速率表型数据，发现分子标记KASP705与籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1位点紧密连锁，结果如图1所示。由图1可知，籽粒灌浆速率QTLQGfr.sicau-7D.1定位在标记SNP5701和SNP6093之间的16.24cM的区段内，而分子标记KASP705与SNP6093共分离，与QTL呈紧密连锁。
小麦籽粒快速灌浆QTL QGfr.sicau-7D.1在7D染色体上的位置及与分子标记KASP705之间的连锁遗传图谱见图1。
实施例2与小麦籽粒灌浆QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记KASP705的应用
1、DNA提取
试验材料选取H461、川农16及川麦107，其中川农16、川麦107为籽粒灌浆速率慢品种，H461为籽粒灌浆速率快品种。采用CTAB法提取小麦样品三叶期的叶片DNA。
2、检测小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的引物的筛选
2.1引物设计
将SNP标记SNP5701和SNP6093转换设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN 6.0软件设计荧光定量PCR引物7对(见表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列
正向引物2：H探针+扩增引物序列
反向引物：扩增引物序列
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
2.2荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性
(1)提取H461，川农16、川麦107三叶期的叶片DNA。
(2)以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；
其中，步骤2的引物序列如下：
KASP705-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGGAGGACGCTGTTGCA-3’；
KASP705-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGAGGACGCTGTTGCG-3’；
KASP705-3:5’-ACTTCGGCCTCGAGAACTTC-3’；
并且，引物KASP705-1和KASP705-2的5’端分别连有不同的荧光探针；
所述荧光探针的序列如下：
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物KASP705-1、KASP705-2和KASP705-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物KASP705-1、KASP705-2和KASP705-3按2:2:5体积比混合。
(4)荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有小麦籽粒灌浆QTL QGfr.sicau-7D.1的小麦样本均出现与小麦H461相同的基因型，记为A型，而不含有小麦籽粒快速灌浆QTLQGfr.sicau-7D.1的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的荧光信号，如川农16、川麦107，记为B型。H461、川农16、川麦107用KASP引物做基因型分型的结果见图2。
3、群体检测过程中引物序列KASP705-1/2/3的适用性
(1)以H461为母本，川麦107为父本杂交得到F1，F1自交获得F2，通过单粒传法加代至F8代RIL验证群体。提取群体中各株系三叶期的叶片DNA。
(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，利用本发明所提供的引物进行荧光定量PCR扩增，荧光染料为SsoFast EvaGreen。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物KASP705-1、KASP705-2和KASP705-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物KASP705-1、KASP705-2和KASP705-3按2:2:5体积比混合后，再吸取混合液0.14μL。
(4)荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的小麦样本均出现与小麦H461相同的基因型，记为A型，而不含有小麦籽粒灌浆速率QTLQGfr.sicau-7D.1的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的荧光信号，记为B型，结果如图3所示。随机抽检96株株系，45株能扩增出与H461相同类型的片段，为含有小麦籽粒灌浆QTLQGfr.sicau-7D.1的植株，预测株系植株在灌浆期籽粒灌浆速率较快。51株能扩增出与川农16、川麦107相同的B型片段，为不含有小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的植株，预测这些植株在预测株系植株在灌浆期籽粒灌浆速率较慢。
(6)小麦灌浆期间田间鉴定该96个F8植株的籽粒灌浆速率，结果见表2，籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的分子标记KASP705预测遗传群体籽粒灌浆速率的结果。与H461类型相同的植株平均籽粒灌浆速率为99.6mg·100粒-1天-1，显著高于与川农16、川麦107类型的植株平均籽粒灌浆速率为87.9mg·100粒-1天-1。实际结果与预期结果一致，说明本发明的籽粒灌浆速率长QTL QGfr.sicau-7D.1确实具有显著增加籽粒灌浆速率的作用，且分子标记KASP705可以用于跟踪鉴定籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1。
表2
Figure BDA0002468408710000121
Figure BDA0002468408710000131
Figure BDA0002468408710000141
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记及应用
<130> KHP201111451.6
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n is a or g
<400> 1
ctggaggacg ctgttgcngt agcaggtgtt gccgaagttc tcgaggccga agt 53
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tctggaggac gctgttgca 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tctggaggac gctgttgcg 39
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acttcggcct cgagaacttc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tagtctcaaa gccaggagct ctaatgggt 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tagtctcaaa gccaggagct ctaatgggc 49
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaaacaaga tcaactccag 20
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tgaagtctca aagccaggag ctctaatggg c 51
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tgaagtctca aagccaggag ctctaatggg t 51
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaaacaaga tcaactcca 19
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tcaggagctc taatgggt 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tcaggagctc taatgggc 38
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caaaacaaga tcaactccag 20
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaggtgacc aagttcatgc tgagaacttc ggcaacacct gctact 46
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtcgga gtcaacggat tgagaacttc ggcaacacct gctacc 46
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcctggagga cgctgttg 18
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tgaacttcgg caacacctgc tacc 44
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat tgaacttcgg caacacctgc tact 44
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtgcctggag gacgctgttg 20
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaggtgacc aagttcatgc tcttcggcaa cacctgctac t 41
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaaggtcgga gtcaacggat tcttcggcaa cacctgctac c 41
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtgcctggag gacgctgttg 20

Claims (6)

1.与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记，命名为KASP705，其特征在于，分子标记KASP705与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1共定位于7D染色体上标记SNP5701～SNP6093区段内，所述分子标记KASP705位于小麦籽粒灌浆速率QTLQGfr.sicau-7D.1置信区间内；
所述分子标记位于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的第18位，其多态性为A/G。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述小麦籽粒灌浆速率QTLQGfr.sicau-7D.1能显著增加小麦籽粒灌浆速率，LOD值大于4，解释12.62%的表型变异。
3.用于扩增权利要求1~2任一项所述分子标记的特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组包括序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物。
4.权利要求1~2任一项所述分子标记或权利要求3所述特异性引物组的如下任一种应用：
（1）在鉴定小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1中的应用；
（2）在筛选或鉴定籽粒快速灌浆的小麦品种中的应用；
（3）在小麦分子标记辅助育种中的应用；
（4）在小麦种质资源改良中的应用。
5.一种鉴定小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的方法，其特征在于，以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的特异性引物组进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型；含有小麦籽粒快速灌浆QTL QGfr.sicau-7D.1的小麦品种均出现与SEQ ID NO.2所示引物标记的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1的小麦品种均出现与SEQ ID NO.2所示引物标记的荧光探针明显不同的荧光信号。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示，三条引物体积比为2:2:5；和/或
荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃ 60s，采集荧光信号。
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