CN112080582A - 一种与小麦穗长主效qtl位点紧密连锁的kasp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与小麦穗长主效QTL位点紧密连锁的KASP分子标记及其应用。本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的穗长大于AA基因型小麦的穗长。本发明还保护一种小麦育种方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；选择CC基因型小麦进行育种。所述育种的目标为获得穗长增加的小麦。所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第36位核苷酸，为A/C多态。本发明通过分子遗传改良小麦的穗部性状，对进而提高小麦的产量具有极其重要的意义。

Description

一种与小麦穗长主效QTL位点紧密连锁的KASP分子标记及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术和分子育种领域，具体涉及一种与小麦穗长主效QTL(quantitative trait locus)位点紧密连锁的KASP分子标记及其应用。

背景技术

小麦是我国主要粮食作物之一，其产量的高低直接影响人们生活水平与国家的粮食安全。因此，在耕地面积有限的情况下，提高小麦单产是我国育种家选育小麦品种的首要目标。小麦单产受亩穗数、穗粒数和千粒重及环境因素共同影响。穂长作为小麦穂部重要组成性状，与小麦的产量三要素中的穗粒数和粒重密切相关。此外，穂长直接影响小穗密度，小穗密度较低的麦穗可以减缓赤霉病的扩展。因此，发掘穗长相关基因/QTL位点，开发紧密连锁的分子标记，通过分子育种，提高小麦穗粒数以获得高产小麦新品种，对小麦育种具有极其重要的意义。

分子标记辅助选择育种技术，是利用控制目标性状位点/基因连锁的分子标记，通过分子生物学检测基因分型，达到对目标性状选择的目的；其优点是简单快速，不受环境及环境互作的影响，能够快速且高效的选育出目标资源材料。单核苷酸的多态性(SNP，SingleNucleotide Polymorphisms)，是指在基因组上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP标记主要有以下特点：1、数量多，分布广泛；2、适于快速、规模化筛查；3、易于估计等位基因的频率；4、易于基因分型。KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)，可针对绝大多数基因组DNA的SNPs和特定位点InDels，进行非常准确的双等位基因评分。与传统的PCR标记如RFLP、SSR等条带读取复杂，耗时长、通量低等相比，KASP标记具有操作简单、通量高、分析时间短等优点。

小麦穗长与产量三要素的穗粒数和粒重密切相关，是品种选育过程中的一个重要指标。因此，定位控制穗长的主效QTL位点，获得与穗长位点紧密连锁的KASP分子标记，可对小麦穗长位点进行高通量有效检测，并应用于分子标记辅助选择育种。

发明内容

本发明的目的是提供一种与小麦穗长主效QTL位点紧密连锁的KASP分子标记及其应用。

本发明提供了检测特异SNP的物质在鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状中的应用。

本发明还提供了检测特异SNP的物质在小麦育种中的应用。所述应用中，选择基于所述特异SNP为CC基因型的小麦进行育种。所述育种的目标为获得穗长增加的小麦。所述应用中，选择基于所述特异SNP为AA基因型的小麦进行育种。所述育种的目标为获得穗长减小的小麦。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的穗长大于AA基因型小麦的穗长。

本发明还保护一种小麦育种方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；选择CC基因型小麦进行育种。所述育种的目标为获得穗长增加的小麦。

以上任一所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第36位核苷酸。所述特异SNP为A/C多态。

本发明还保护一种特异DNA分子，如序列表的序列1所示。序列1中的M代表A或C。

本发明还保护所述特异DNA分子在鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状中的应用。基于所述序列1中的M，CC基因型小麦的穗长大于AA基因型小麦的穗长。

本发明还保护特异引物组，由引物K111236313-HEX、引物K111236313-FAM和引物K111236313-R组成；

引物K111236313-HEX具有序列表的序列2中第22-44位核苷酸；

引物K111236313-FAM具有序列表的序列3中第22-44位核苷酸；

引物K111236313-R如序列表的序列4所示。

引物K111236313-HEX为序列表的序列2所示的单链DNA分子。

引物K111236313-FAM为序列表的序列3所示的单链DNA分子。

引物K111236313-R为序列表的序列4所示的单链DNA分子。

本发明还保护所述特异引物组的应用，为如下(a)或(b)：

(a)鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状；

(b)小麦育种。

所述应用(a)中，CC基因型小麦的穗长大于AA基因型小麦的穗长。

所述应用(b)中，选择基于所述特异SNP为CC基因型的小麦进行育种。所述育种的目标为获得穗长增加的小麦。

所述应用(b)中，选择基于所述特异SNP为AA基因型的小麦进行育种。所述育种的目标为获得穗长减小的小麦。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的穗长性状的方法，包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述特异引物组进行KASP反应；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦的基因型；

(3)根据基因型结果进行判断：CC基因型小麦的穗长大于AA基因型小麦的穗长。

以上任一所述检测特异SNP的物质具体为所述特异引物组。

以上任一所述检测待测小麦基于特异SNP的基因型的方法具体包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，扩增具有所述特异SNP的靶片段，然后进行测序。

以上任一所述检测待测小麦基于特异SNP的基因型的方法具体包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，进行基于KASP的基因分型。

以上任一所述检测待测小麦基于特异SNP的基因型的方法具体包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述特异引物组进行KASP反应。

以上任一所述检测待测小麦基于特异SNP的基因型的方法具体包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述特异引物组进行KASP反应；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦的基因型。

KASP反应体系具体可为(总体积为5μl)：模板DNA(DNA含量为50ng)1μL，2×KASPreaction mix 2.81μL，混合引物0.08μl，余量为ddH₂O。混合引物提供的有效成分为K111236313-HEX、K111236313-FAM和K111236313-R。混合引物中，K111236313-FAM和K111236313-HEX的浓度均为12μM，K111236313-R的浓度为30μM。

KASP反应程序具体可为：95℃预变性15min；95℃变性20s、退火并延伸60s(第1个循环的退火温度为61℃，之后每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s、55℃退火并延伸60s，32个循环。

FAM(聚集于X轴)，代表CC基因型。

HEX(聚集于Y轴)，代表AA基因型。

本发明公开了一种与小麦穗长主效QTL紧密连锁的KASP标记。本发明的发明人发现，小麦穗长主效QTL位点位于小麦6B染色体长臂上，命名为QSl.cas-6B，定位于AX-111236313—AX-109335584区段，对应中国春1.89Mb物理区间，发明人进一步将与QSl.cas-6B紧密连锁的SNP标记AX-111236313转化为KASP标记K111236313。本发明提供的KASP标记K111236313，可用于鉴定或辅助鉴定小麦穗长；比较待测小麦穗长的长度；选育穗长相对较高/低的小麦单株或株系或品系或品种。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，可加快小麦高产品种的选育进程。本发明的KASP分子标记，序列、引物明确，染色体位置清晰，高效、准确，经案例实施，可直接用于分子标记辅助选择育种中。本发明通过分子遗传改良小麦的穗部性状，对进而提高小麦的产量具有极其重要的意义。

附图说明

图1为穗长位点QSl.cas-6B在4个环境和BLUP下的染色体定位。

图2为AX-111236313位点KASP标记基因分型结果。靠近Y轴代表AA基因型，靠近X轴代表CC基因型。靠近左下角菱形点代表空白对照。

图3为重组自交系群体中AA基因型和CC基因型的家系在穗长上差异。

图4为107份自然群体中AA基因型和CC基因型的家系在穗长上差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

记载小麦种质资源3228的文献：Wang J,et al.(2011)QTL mapping of yield-related traits in the wheat germplasm 3228.Euphytica 177:277-292。

实施例1、小麦穗长相关的SNP位点发掘及KASP标记的开发

一、PG-RIL群体的构建

以小麦品种藁8901为母本、小麦种质资源3228为父本，进行杂交，采用单粒传法获得含有176个株系的F_6:9代重组自交系群体(PG-RIL群体)。

二、PG-RIL群体穗长性状多年环境下的鉴定

将两个亲本以及PG-RIL群体于LC13(2013-2014)、LC14(2014-2015)、LC15(2015-2016)、LC16(2016-2017)共4个年度种植于中国科学院栾城农业生态系统试验站(37°53'15″N，114°40'47″E)。两个亲本以及176个株系以随机完全区组设计种植，重复三次。每个株系种植2行，行长1.5m，行距0.25m，每行30粒种子。所有大田试验的水、肥和其他管理都按照当地标准进行。待小麦成熟后，每个重复的每个株系均随机抽取10株调查穗长，取平均值。

三、基因型扫描与QTL定位

供试植株：两个亲本以及176个株系的植株。

1、基因组DNA提取

采用CTAB法提取供试植株的基因组DNA，利用NanoDrop2000检测浓度。

2、小麦660K SNP芯片杂交

取步骤1得到的基因组DNA，与小麦660K SNP芯片杂交，对结果进行基因分型。

3、小麦穗长稳定主效QTL QSl.cas-6B的定位

根据660K SNP芯片分型的结果，进行遗传作图以及穗部性状的QTL定位(见图1和表1)，在6B染色体长臂区段检测到控制穗长、稳定表达的主效QTL QSl.cas-6B，LOD(threshold log-of-odds)峰值区间(即LOD值大于3.0的区间)为AX-111236313-AX-108763535，能够解释13.56-26.11％的穗长表型变异，穂长的加性效应来自亲本3228，BLUP(best linear unbiased predictors)值加性效应分析显示平均增加穗长0.476cm。进一步结合两侧Bin标记内连锁标记的位置，将其定位于6B染色体长臂AX-111236313-AX-109335584区段，对应中国春6B染色体的702.294-704.184Mb共1.89Mb的物理区间内。

表1 QSl.cas-6B区段内穗长的QTL信息

环境	LOD峰值区间	QTL区间(cM)	贡献率(％)	加性效应(cm)
					LC14	AX-111236313-AX-108763535	139.99-143.35	23.63	0.543
LC15	AX-111236313-AX-108763535	139.99-143.35	13.56	0.576
					LC16	AX-111236313-AX-108763535	139.99-143.35	26.11	0.613
BLUP	AX-111236313-AX-108763535	139.99-143.35	19.25	0.476

注：BLUP-best linear unbiased predictors，最佳线性无偏预测值。

四、KASP标记的开发

为了方便对小麦穗长候选材料进行QSl.cas-6B位点的鉴定和辅助选择，同时为了降低育种成本和工作量，增强育种工作中的可操作性，需要将目标分子标记探针序列开发为基于常规分子生物学手段可用于鉴定和筛选的KASP标记。

针对与QSl.cas-6B位点紧密连锁的标记AX-111236313在小麦藁8901和小麦3228之间的SNP变异及其周边核苷酸如序列表的序列1所示(M代表A或C)，为A/C多态。

根据序列1比对中国春参考基因组V1.0(Appels R et al.(2018)Shifting thelimits in wheat research and breeding using a fully annotated referencegenome.Science,361,661.)，开发得到了KASP标记K111236313，以及用于检测该KASP标记的KASP引物组。

KASP引物组由三条引物组成，分别为上游引物K111236313-HEX、上游引物K111236313-FAM和通用下游引物K111236313-R。

K111236313-HEX(序列表的序列2):

K111236313-FAM(序列表的序列3):

K111236313-R(序列表的序列4)：

5'-AACTTGTTCTGAGTTTTGCGCCTTG-3'。

实施例2、利用KASP标记K111236313检测基因型的方法的建立

1、提取苗期供试植株叶片的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板DNA，采用实施例1的KASP引物组进行KASP反应。

反应体系(总体积为5μl)：模板DNA(DNA含量为50ng)1μL，2×KASP reaction mix2.81μL，混合引物0.08μl，余量为ddH₂O。混合引物提供的有效成分为K111236313-HEX、K111236313-FAM和K111236313-R。混合引物中，K111236313-FAM和K111236313-HEX的浓度均为12μM，K111236313-R的浓度为30μM。

2×KASP reaction mix，又称为KASP 2×Master Mix，为LGC公司产品(货号KBS-1016-002)。2×KASP reaction mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。

反应程序：95℃预变性15min；95℃变性20s、退火并延伸60s(第1个循环的退火温度为61℃，之后每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s、55℃退火并延伸60s，32个循环。

3、利用Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪在37℃进行荧光收集，利用基因分型软件BioRad CFX Manager进行分型。结果以散点图的形式展示，每个点代表一个样本，相同基因型的点集中在一个区域。荧光信号聚集于Y轴附近代表AA基因型。荧光信号聚集于X轴附近代表CC基因型。

实施例3、检测PG-RIL群体的基因型并与穗长进行关联分析

一、检测基因型

供试植株：实施例1中的两个亲本以及176个株系的植株。

按照实施例2进行操作。

设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)。

结果见图2。左下角显示为黑色的样本为空白对照。

小麦藁8901为AA基因型，小麦3228为CC基因型。176个株系中，78个为CC基因型(靠近X轴圆形散点)，98个为AA基因型(靠近Y轴方形散点)。

二、关联分析

将实施例1的步骤二得到的穗长数据与步骤一得到的基因型进行关联分析。

结果见图3。双尾T检验结果表明，在PG-RIL群体中K111236313标记与穗长在LC13(2013-2014)、LC14(2014-2015)、LC15(2015-2016)和LC16(2016-2017)共4个年度环境条件下呈极显著相关，与AA基因型生物材料相比，CC基因型生物材料在LC13、LC14、LC15、LC16共4个年度分别提高穗长0.66cm、0.93cm、1.03cm和1.05cm。

实施例4、KASP分子标记在鉴定、筛选小麦自然群体穗长中的应用

收集上世纪50年代以来在我国小麦育种中发挥重要作用的小麦骨干亲本、不同时期不同生态区的主栽品种及部分小麦微核心种质材料，筛选出生育期相对一致且能正常生长的材料共107份品种/品系。

一、检测穗长性状

从2013-2014、2014-2015、2015-2016和2016-2017连续4个年度将上述107份品种/品系种植于中国科学院栾城农业生态系统试验站(37°53'15″N，114°40'47″E)。107份品种/品系以随机完全区组设计种植，重复三次。每份品种/品系种3行，行长1.5m，均匀播种30粒，行间距25cm。常规田间管理，生长期间没有发生严重病虫害和倒伏。待小麦成熟后，每个重复的每个品种/品系均随机抽取10株调查穗长，取平均值。

结果见表2。

二、检测基因型

供试植株：上述107份品种/品系。

按照实施例2进行操作。

结果见表2。28份生物材料为AA基因型，79份生物材料为CC基因型。

表2 107份小麦自然群体的穗长及利用KASP标记检测的AX-111236313位点基因型

三、关联分析

将步骤一得到的穗长数据和步骤二得到的基因型进行关联分析。

结果见表3和图4。双尾T检验结果表明，在自然群体中K111236313标记与穗长在2013-2014、2014-2015、2015-2016和2016-2017共4个年度环境条件下呈显著或极显著相关，与AA基因型材料相比，CC基因型的材料在2013-2014、2014-2015、2015-2016和2016-2017共4个年度分别增加穗长0.80cm、0.74cm、0.64cm和0.57cm。

表3 107份小麦自然群体的穗长T检验

结果表明，本发明的KASP分子标记在PG-RIL遗传群体和107份自然群体同样适用，实验结果与预期一致。说明本发明与穗长紧密连锁的标记确实具有对穗长进行辅助选择的作用。由于穂长作为小麦穂部重要组成性状，与小麦的产量三要素中的穗粒数和粒重密切相关，是品种选育过程中的一个重要指标，因而本发明对于选育单产高的小麦品种具有重要意义。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心

<120> 一种与小麦穗长主效QTL位点紧密连锁的KASP分子标记及其应用

<130> GNCYX202462

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 71

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

gtggttgagt cgacgccaaa gttccaacgt gagctmtccg tcttgcagaa aacgctcgcc 60

aaggcgcaaa a 71

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tcgccaaagt tccaacgtga gcta 44

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtgacc aagttcatgc tcgccaaagt tccaacgtga gctc 44

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacttgttct gagttttgcg ccttg 25

Claims (10)

1.检测特异SNP的物质在鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状中的应用；

所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第36位核苷酸。

2.检测特异SNP的物质在小麦育种中的应用；

所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第36位核苷酸。

3.一种鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的穗长大于AA基因型小麦的穗长；所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第36位核苷酸。

4.一种小麦育种方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；选择CC基因型小麦进行育种；所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列1所示DNA分子的第36位核苷酸。

5.特异DNA分子，如序列表的序列1所示。

6.权利要求5所述特异DNA分子在鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状中的应用。

7.特异引物组，由引物K111236313-HEX、引物K111236313-FAM和引物K111236313-R组成；

引物K111236313-HEX具有序列表的序列2中第22-44位核苷酸；

引物K111236313-FAM具有序列表的序列3中第22-44位核苷酸；

引物K111236313-R如序列表的序列4所示。

8.如权利要求7所述特异引物组，其特征在于：

引物K111236313-HEX为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

引物K111236313-FAM为序列表的序列3所示的单链DNA分子；

引物K111236313-R为序列表的序列4所示的单链DNA分子。

9.权利要求8或9所述特异引物组的应用，为如下(a)或(b)：

(a)鉴定或辅助鉴定小麦穗长性状；

(b)小麦育种。

10.一种鉴定待测小麦的穗长性状的方法，包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求8所述特异引物组进行KASP反应；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦的基因型；

(3)根据基因型结果进行判断：CC基因型小麦的穗长大于AA基因型小麦的穗长。

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