CN103882143A - 小麦穗长主效qtl紧密连锁的分子标记检测引物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记检测引物与应用，分子标记检测引物包括分子标记XWMC112的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记XWMC112的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记XCFD53的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子标记XCFD53的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明首次研究发现了与小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记XWMC112和分子标记XCFD53，利用分子标记XWMC112和分子标记XCFD53可以快捷地对小麦品种或品系是否具有穗长的QTL进行判断，快速筛选出具有增加穗长QTL的小麦品种或品系，加快高产小麦品种的育种进程。

Description

小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记检测引物与应用

技术领域

本发明公开了一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记检测引物与应用，涉及小麦分子生物技术与分子标记辅助育种应用技术领域。

背景技术

小麦是世界上重要的粮食作物之一，其产量的高低影响国民经济的发展和稳定，因此，持续不断的提高小麦产量一直是小麦重要的研究方向。影响产量性状的因素较多，除了产量三要素外，穗长也是麦类作物产量的重要因素之一，也是育种目标的重要性状之一。传统的育种方法在对产量相关性状的选择上具有周期时间长、耗费大、成本高、成果小的缺点，而随着分子标记和生物技术的发展，分子标记辅助选择育种成为可能，利用与性状紧密连锁的分子标记在不同世代、不受环境和发育时期均可检测，而且选择效果较好。已有研究表明穗长不仅与产量息息相关，具有较高的遗传力，且属于数量性状。因此，穗长性状一直被作为研究的重点。

许多学者对穗长进行了遗传定位，发现控制穗长性状的QTL在小麦染色体组中广泛存在，且牵涉的染色体较多；其中利用单体分析分子发现六倍体小麦4A、5A、6A、7A、1B、3B、4B、5B、6B、7D染色体明显影响穗长；1B、2D、5A、7A、3D和6D染色体具有增长穗长的功效；在巨穗小麦中3A、5A、2B、1D、6D染色体上有控制穗长的基因，其中2B染色体功效较大。QTL定位研究发现，在普通六倍体小麦中1A、1B、4A、7A染色体上检测到影响穗长的主效基因。

但是目前关于穗长可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记却很少。因此，研究有关穗长的QTL/基因，利用分子标记技术，提高穗长，进而提高穗粒数，最终提高产量获得高产小麦新品种，在实际育种工作中具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记检测引物与应用。

本发明技术方案如下：

一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记的检测引物，包括分子标记XWMC112的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记XWMC112的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记XCFD53的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子标记XCFD53的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记的检测引物在检测小麦穗长短中的应用，步骤如下：

以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用分子标记XWMC112和分子标记XCFD53的检测引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果分别得到大小为233bp和245bp的PCR扩增产物条带，则所述待测小麦为长穗小麦。

根据本发明优选的，所述待测小麦的基因组DNA采用如下方法提取：

①取3～4片小麦嫩叶，置于离心管中，放入盛有液氮的容器内，冷冻后研磨5～15min；

②加入900μL65℃预热的DNA提取工作液，65℃水浴1h，水浴过程中轻摇3～5次，充分混匀；

③室温冷却5min后加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）充分混匀30min，10000g离心20min；取上清液移入新离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇（体积比24:1），轻轻混匀后10000g离心20min；

④取上清液移入新离心管中，加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀，10000g离心30min；

⑤弃去上清液，用70%（体积百分比）的乙醇洗涤DNA沉淀2～3次；

⑥将DNA沉淀晾干，用100μL1×TE溶液溶解，制得待测小麦的基因组DNA；

取1μL提取纯化后的的基因组总DNA，用0.8wt％琼脂糖（含EB终浓度0.5μg/ml）进行电泳，检测其浓度及纯度。电泳仪为北京市六一仪器厂生产的DYY-8型，电泳槽为DYC-33B型。凝胶成像仪上观察并照相，以检测小麦基因组DNA的纯度及有无降解情况。

每120mL的DNA提取工作液按如下步骤进行配制：提取缓冲液母液（Extraction BufferStock）50mL、裂解缓冲液母液（Lysis Buffer Stock）50mL、十二烷基肌氨酸钠母液（SarcosylStock）20mL、焦亚硫酸钠（Sodium disulfite）0.6g、聚乙烯吡咯烷酮PVP-40(K29-32)2.4g，混合均匀制得。

提取缓冲液母液（Extraction Buffer Stock）500mL配制步骤：31.9g山梨糖醇（Sorbitol）、50mL1M Tris-HCl pH8.0、5mL0.5M EDTA pH8.0，水定容至500mL，混匀制得。

裂解缓冲液母液（Lysis Buffer Stock）500mL配制步骤：100mL1M Tris-HCl pH8.0、50mL0.5M EDTA pH8.0、200mL5M NaCl、10g CTAB，水定容至500mL，混匀制得。

十二烷基肌氨酸钠母液（Sarcosyl Stock）100mL配制步骤：5g十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）加水定容至100mL，混匀制得。

其他主要试剂

（1）1M Tris-HCl（pH8.0）：600mL H₂O中加入121.1g三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐（Tris），用HCl调pH值至8.0，定容至1L，灭菌，备用；

（2）0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）：600mL H₂O中加186.1g Na₂EDTA-2H₂O，用NaOH调pH值至8.0，定容至1L，灭菌，备用；

（3）100×TE（pH8.0）：800mL H₂O中加121.1g Tris、37.23g Na₂EDTA-2H₂O，用HCl调pH值至8.0，定容至1L，灭菌，备用；

根据本发明进一步优选的，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，为用每100ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测；用硝酸银染色，显影。

根据本发明优选的，所述PCR扩增的反应体系为20μl，其中：

10×buffer（含Mg²⁺）2μL、dNTP1.6μL（10mmol L^-1）、每条检测引物0.4μL、模板DNA（50ngμL^-1）1μL、1U Taq聚合酶0.2μL，ddH₂O14.4μ1；

根据本发明优选的，所述分子标记Xwmc112的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，66℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存。

根据本发明优选的，所述分子标记Xcfd53的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存。

有益效果

1、本发明首次研究发现了与小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记XWMC112和分子标记XCFD53，利用分子标记XWMC112和分子标记XCFD53可以快捷地对小麦品种或品系是否具有穗长的QTL进行判断，快速筛选出具有增加穗长QTL的小麦品种或品系，加快高产小麦品种的育种进程。

2、本发明提供的两对检测引物及检测方法可应用于小麦育种的早代选择，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为小麦育种提供了技术支持，提高高产小麦新品种的选择效率和质量。

附图说明

图1、穗长主效QTL位点在2D染色体上的位置；

图2、SSR标记Xcfd53和Xwmc112在花培3号和豫麦57中的扩增结果；

其中：M、Marker；1、花培3号，2、豫麦57；

图3、SSR标记Xcfd53和Xwmc112在6个不同小麦品种（系）中的扩增结果；

其中：M、DL2000；1、山农19中短穗品种，2、山农20中短穗品种，3、山农8355中短穗品种；4、长穗偃麦草，5、山农62008长穗品种，6、山农08-29长穗品种；

图4、SSR标记Xcfd53和Xwmc112在长穗偃麦草与普通小麦回交的BC₃F₂群体中的扩增结果；

其中：M:DL2000；1，2，3泳道属于中短穗株系；4，5，6泳道属于长穗株系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实验材料

山农19和山农20购自山东圣丰种业科技有限公司；

山农8355购自淄博禾丰种子有限公司；

花培3号和豫麦57购自河南省农业科学院；

山农62008和山农08-29购自山东农业大学农学院农业部谷物品质检测中心品质育种研究室；

长穗偃麦草、小麦山农20及其回交后代群体购自山东农业大学农学院农业部谷物品质检测中心品质育种研究室；

PCR仪型号为德国Eppendorf5531梯度PCR仪。

实施例1

小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记的获取方法，包括以下步骤：

（ⅰ）以豫麦57为父本、花培3号为母本进行杂交获得F₁，F₁通过小麦和玉米杂交诱导单倍体，经染色体加倍获得的含有168个家系DH群体。

（ⅱ）参照Triticarte Pty.Ltd（http://www.triticarte.com.au）提供的DNA提取方法提取各株系的DNA，采简单重复序列标记（SSR标记）、基于表达序列标签的简单重复序列标记（EST-SSR标记）、ISSR标记和高分子量谷蛋白（HMW-GS）亚基，对所述株系进行基因型分析，获得所述DH群体的基因型资料。

其中SSR标记、EST-SSR标记和ISSR标记分析是将筛选株系的DNA进行PCR扩增，扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在所选株系中进行分析，获得所述DH群体的基因型资料；

所述8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，为用每100ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测；用硝酸银染色，显影。

HMW-GS亚基提取步骤：

称50mg样品置于1.5ml离心管中；加入1ml提取液A，62℃水浴提取30min，其间搅动两次；20℃，10000rmp离心3min，弃上清；重复前2个步骤（共三次）；离心管中加入160μl提取液B1混匀，62℃水浴溶液提取30min；加入160μl提取液B2混匀，62℃水浴烷化60min；20℃，10000rpm离心10min；取上清液150μl（200μl）放入1.5ml新离心管（称重1）中，加入600μl（或800μl）的丙酮，放入35-40℃的水浴锅中水浴30min；20℃，10000rpm，离心10min；弃去上清液，沉淀冻干后（称重2）（两管之差即为所提高低分子量谷蛋白亚基），加入100μl样品提取液（内含2wt%SDS，10%甘油（v/v），5%β-巯基乙醇（v/v），0.8wt%Tris，0.01wt‰溴芬兰）35～40℃水浴溶解1小时后，即可用于上样。

上述HMW-GS提取试剂的配制

提取液A：50%（体积百分比）异丙醇

提取液B：异丙醇25.0ml+3MTris-HCl(pH8.8)1.33ml+水23.67ml，总体积50ml，pH8.8。

提取液B1：8ml提取液B中加入0.024克DTT（二硫苏糖醇）

提取液B2：8ml提取液B中加入112微升4-2-乙烯基吡啶（4-2-Vinylpynolin）。

HMW-GS电泳：

参考刘现鹏，田纪春，张永祥在《中国粮油学报》（2002,02）中发表的名称为：山东省不同年代主要栽培小麦品种系高分子量谷蛋白亚基分布一文中所用方法；用10wt%的分离胶和3.75wt%的浓缩胶，胶厚度1mm；20个上样孔，同一种样品上样时所用体积应保持浓度一致。重复3次。电流15mA。北京六一仪器厂生产的DYY-22A型电泳装置。电泳完毕后，用0.05％考马斯亮兰R₂₅₀染色24小时，然后用蒸馏水脱色2天。用ChemiImager^TMIS-4400凝胶成像扫描系统进行凝胶分析。以中国春和马奎斯为对照，参照Payne和Lawrence(1983)带型命名方法读取DH群体各株系的HMW-GS组成。

叶片中DNA提取方法：

取3～4片10日龄小麦嫩叶，置于2mL离心管中，放入盛有液氮的容器内，冷冻后充分研磨，加入900μL65℃预热的DNA提取工作液，65℃水浴1h，水浴过程中小心轻摇数次，充分混匀；室温冷却5min后加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(V/V/V=25:24:1)充分混匀30min，10000xg离心20min；取上清夜加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，可见絮状DNA析出，10000xg离心30min；弃去上清液，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，将DNA沉淀晾干，用100μL1×TE溶液溶解。

（ⅲ）利用MAPMAKER3.0作图软件将获得的所述DH群体的基因型资料构建一个含有323个标记的小麦分子遗传图谱，以LOD≥3.0为准，分布于小麦21条染色体上；其中323个标记包括284个SSR、37个EST-SSR、1个ISSR及1个HMW标记。

（ⅳ）将所述DH群体按照试验设计进行田间种植，大田试验于2010-2011年将材料种植在泰安山东农业大学农学试验站(36.57'N，116.36'E)和河南济源(35.5'N112.38'E)；盆栽试验于2011-2012年在泰安取相同地块土壤种植盆栽试验，盆栽试验所用花盆直径为28cm，深23cm，每盆装土28斤，每盆6株，每家系2盆。泰安试验点土壤表层0～20cm的有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量分别为：17.58g/kg、23.46mg/kg、45.08mg/kg和153.5mg/kg；济源试验点有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量分别为：13.7g/kg、67.97mg/kg、29.7mg/kg和137.7mg/kg。

（ⅴ）试验设4个处理，T0为不施氮处理；处理T1为返青期追施纯氮120kg/hm²，处理T2为拔节期追施纯氮120kg/hm²，处理T3为挑旗期追施纯氮120kg/hm²，T1、T2、T3底肥均施纯氮120kg/hm²。4个处理均于冬前、返青期、拔节期、挑旗期各浇1次水。2年试验均采用随机区组设计，亲本及DH群体的每个株系种植3行，行长1.0m，株行距2.2cm×0.26m，每个环境两次重复。试验材料于生长期内没有发生倒伏和其他严重病虫害。

（ⅵ）性状调查：大田试验以株系为单位，取中间1行，于开花期-成熟期选取10株调查小麦穗长，取其平均值用于数据统计分析；盆栽试验于开花期-成熟期将所有单株调查小麦穗长，取其平均值用于数据统计分析。

（ⅶ）利用QTLNetwork2.0(Yang等，2005)软件将每个标记的群体基因型资料和相应每个株系的穗长表型数据进行连锁分析，以P=0.005作为统计检测阈值，即当标记的P值小于统计检测阈值时，则认为该标记处存在1个与性状有关的QTL。

（ⅷ）由QTL分析可知，在P<0.001时，多个环境下在染色体2D上的XWMC112-XCFD53区间内都定为到穗长的主效QTL位点。如图1，表1所示。

表1不同环境下穗长的QTL定位结果

由表1可知，共定位到34个QTL位点，其中13个为主效QTL位点，位于2D染色上（图1），其贡献率变异范围为11.55-23.45%。主效QTL在不同环境下涉及到的分子标记区间XGWM296-XWMC112-XCFD53-XWMC18，3个区间内分别定位到2个、6个和5个主效QTL位点。其中，在2011济源T3、2011泰安T0、2011泰安T1、2011泰安T3、2012泰安T0及12个环境下共同定位出的位点在染色体上的位置是0.9cM，在XWMC112-XCFD53之间，且与标记XWMC112在相同的位置；而在2011济源T1、2011济源T2、2011泰安T2、2012泰安T1、2012泰安T3环境下定位QTL在染色体上的位置距离标记XCFD53较近；因此，根据QTL位点在染色体上的位置，标记XWMC112和XCFD53是穗长紧密连锁的标记。其标记引物XWMC112和XCFD53在小麦品种花培3号的DNA中获得PCR产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后获得分子量分别为233bp和245bp，即为与小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记。

实施例2

山农19和山农20购自山东圣丰种业科技有限公司；山农8355购自淄博禾丰种子有限公司；花培3号和豫麦57购自河南省农业科学院；山农62008和山农08-29购自山东农业大学农学院农业部谷物品质检测中心品质育种研究室；

一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记在检测小麦穗长短中的应用，步骤如下：

（1）提取待测小麦的基因组DNA，取3-4片10日龄小麦嫩叶，置于2mL离心管中，放入盛有液氮的容器内，冷冻后充分研磨，加入900μL65℃预热的DNA提取工作液，65℃水浴1h，水浴过程中小心轻摇数次，充分混匀；室温冷却5min后加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(V/V/V=25:24:1)充分混匀30min，10000xg离心20min；取上清夜加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，可见絮状DNA析出，10000g离心30min；弃去上清液，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，将DNA沉淀晾干，用100μL1×TE溶液溶解。

（2）以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用分子标记XWMC112和分子标记XCFD53的检测引物进行PCR扩增，分子标记XWMC112的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记XWMC112的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记XCFD53的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子标记XCFD53的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，为用每100ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测；用硝酸银染色，显影；

所述PCR扩增的反应体系为20μl，其中：

10×buffer(含Mg²⁺)2μL、dNTP1.6μL(10mmol L^-1)、每条检测引物0.4μL、模板DNA（50ngμL^-1）1μL、1U Taq聚合酶0.2μL，ddH₂O14.4μ1；

所述分子标记Xwmc112的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，66℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存；

所述分子标记Xcfd53的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存；

根据获得的结果，如果分别得到大小为233bp和245bp的PCR扩增产物条带，则所述待测小麦为长穗小麦。

扩增产物分别在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的扩增产物的分子量分别为233bp和245bp，即为小麦穗长的分子标记。如图2和图3所示。

实施例3

与小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记在以长穗偃麦草和普通小麦杂交的回交BC₃F₂群体中的应用：

以长穗偃麦草为供体亲本，普通小麦山农20为受体亲本进行杂交，然后用山农20为轮回亲本进行回交，构建了回交BC₃F₂群体；开展了小麦穗长主效QTL紧密连锁分子标记的筛选和验证。具体步骤如下：

（ⅰ）将长穗偃麦草、山农20及获得的回交BC₃F₂群体在山东农业大学试验站进行田间种植，随机选取300株后代材料植株的叶片运用上述Triticarte Pty.Ltd（http://www.triticarte.com.au）提供的DNA提取方法提取各株系的DNA。

（ⅱ）分别用分子标记XWMC112和分子标记XCFD53的检测引物进行PCR扩增，

所述PCR扩增的反应体系为20μl，其中：

10×buffer(含Mg²⁺)2μL、dNTP1.6μL(10mmol L^-1)、每条检测引物0.4μL、模板DNA（50ngμL^-1）1μL、1U Taq聚合酶0.2μL，ddH₂O14.4μ1；

所述分子标记Xwmc112的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，66℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存；

所述分子标记Xcfd53的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存；

PCR产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，硝酸银染色，显影后观察并拍照。

（ⅲ）对检测结果进行分析，标记XWMC112引物扩增产物的分子量大小为233bp，标记XCFD53可扩增出245bp片段，当两个片段同时出现时即为含有穗长主效QTL的株系。如图3所示。

（ⅳ）具体结果分析如下：

如图4所示，在4、5、6泳道的材料中，用标记XCFD53可扩增出245bp片段，而在编号1、2、3泳道的中短穗系中没有扩增出该片段；同样，用标记XWMC112在4、5、6泳道的材料中扩增出233bp片段，而在编号1、2、3泳道的材料中没有扩增出该片段；说明，4、5、6泳道中的材料为长穗株系，1、2、3泳道中的材料为中短穗株系。

结合表型调查，发现穗长的表性调查和分子标记辅助选择的结果比较一致，说明标记XWMC112和XCFD53可用于小麦穗长的分子标记辅助选择。

由此可知，利用标记XWMC112和XCFD53进行分子标记辅助选择，可有效筛选具有增加穗长QTL的品种或品系材料，大大提高了小麦育种中高产小麦新品种的选择效率和质量。

Claims (9)

1.一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记的检测引物，其特征在于，包括分子标记XWMC112的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记XWMC112的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记XCFD53的上游引物，核苷酸序列如SEQID NO.3所示，分子标记XCFD53的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种小麦穗长主效QTL紧密连锁的分子标记的检测引物在检测小麦穗长短中的应用，其特征在于，步骤如下：

以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用权利要求1所述的分子标记XWMC112和分子标记XCFD53的检测引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果分别得到大小为233bp和245bp的PCR扩增产物条带，则所述待测小麦为长穗小麦。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述待测小麦的基因组DNA采用如下方法提取：

①取3～4片小麦嫩叶，置于离心管中，放入盛有液氮的容器内，冷冻后研磨5～15min；

②加入900μL65℃预热的DNA提取工作液，65℃水浴1h，水浴过程中轻摇3～5次，充分混匀；

③室温冷却5min后加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1，充分混匀30min，10000g离心20min；取上清液移入新离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，氯仿和：戊醇的体积比为24:1，轻轻混匀后10000g离心20min；

④取上清液移入新离心管中，加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀，10000g离心30min；

⑤弃去上清液，用70%（体积百分比）的乙醇洗涤DNA沉淀2～3次；

⑥将DNA沉淀晾干，用100μL1×TE溶液溶解，制得待测小麦的基因组DNA；

取1μL提取纯化后的的基因组总DNA，用含EB终浓度0.5μg/ml的0.8wt％的琼脂糖进行电泳，检测其浓度及纯度。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述DNA提取工作液每120mL按如下步骤进行配制：提取缓冲液母液50mL、裂解缓冲液母液50mL、十二烷基肌氨酸钠母液20mL、焦亚硫酸钠0.6g、聚乙烯吡咯烷酮PVP-402.4g，混合均匀制得。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述提取缓冲液母液500mL配制步骤如下：31.9g山梨糖醇、50mL1M Tris-HCl pH8.0、5mL0.5M EDTA pH8.0，水定容至500mL，混匀制得。

裂解缓冲液母液500mL配制步骤如下：100mL1M Tris-HCl pH8.0、50mL0.5M EDTApH8.0、200mL5M NaCl、10g CTAB，水定容至500mL，混匀制得。

十二烷基肌氨酸钠母液100mL配制步骤如下：5g十二烷基肌氨酸钠加水定容至100mL，混匀制得。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，为用每100ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测；用硝酸银染色，显影。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为20μl，其中：

含Mg²⁺的10×buffer2μL、浓度10mmol L^-1的dNTP1.6μL、每条检测引物0.4μL、浓度50ngμL^-1的模板DNA1μL、1U Taq聚合酶0.2μL，ddH₂O14.4μ1。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记Xwmc112的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，66℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记Xcfd53的PCR扩增反应条件分别为：

95℃预变性5min；95℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃保存。

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