CN109797238B - 两种基于抗蔓枯病连锁基因开发的用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定的分子标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于蔬菜抗病分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种甜瓜抗蔓枯病分子标记开发及其应用，为甜瓜抗蔓枯病的高通量筛选鉴定和回交育种提供一种新型分子标记及辅助选择方法。本发明公开了两种基于抗蔓枯病连锁的单核苷酸多态性开发的用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定的分子标记，以甜瓜为物种，为分子标记CmGsbRS5、CmGsbRS6中的任意一个。本发明还同时公开了上述分子标记的用途：用于鉴定甜瓜抗蔓枯病种质或其后代的辅助选择育种。

Description

两种基于抗蔓枯病连锁基因开发的用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定 的分子标记及其用途

技术领域

本发明属于蔬菜抗病分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种甜瓜抗蔓枯病分子标记开发及其应用，为甜瓜抗蔓枯病的高通量筛选鉴定和回交育种提供一种新型分子标记及辅助选择方法。

背景技术

蔓枯病(Gummy stem blight，Gsb)是一种真菌性土传病害，由瓜类黑腐小球壳菌(Dudymella bryoniae)侵染引起，属于常坏死营养型真菌，是危害甜瓜的主要病害之一，尤其是在浙江省及东南沿海地区设施栽培高温高湿条件发生严重，大田的发病率可达20％-30％，连作地及温室高达80％，病害严重的年份常造成毁灭性减产。

国内外对甜瓜抗蔓枯病种质鉴定、抗性遗传规律、抗性基因连锁分子标记等方面的研究取得了系列进展。通过蔓枯病病原菌接种鉴定，主要从甜瓜野生材料中鉴定到系列抗蔓枯病甜瓜种质，主要包括PI140471、PI157082、PI511890、PI482398、PI482399和PI420145。遗传分析表明，除PI482399表现为隐性抗性外，其余PI种质均表现为显性抗性，分别这些抗性基因定名为Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4、Gsb-5和Gsb-6(Frantz et al.,2004；McGrath et al.,1993；Wolukau et al.,2007,2009；Zuniga et al.,1999)。这些优异种质资源为甜瓜抗蔓枯病育种提供重要的基因资源。

早期研究采用传统分子标记方法，找到了一些与甜瓜抗蔓枯病相关的分子标记，如与抗蔓枯病基因Gsb-1连锁离为5.2cM的SSR标记CMCT505(刘文睿等，2009)，与抗蔓枯病基因Gsb-2连锁距离为11.3cM的ISSR标记，定名为ISSR-5760(张永兵等，2011)，与抗蔓枯病基因Gsb-3连锁距离为8.3cM的ISSR标记，定名为ISSR-100(张学军等，2013)，与抗蔓枯病基因Gsb-4的遗传连锁距离为5.14cM的SSR标记(王红英等，2012)。与抗蔓枯病基因Gsb-6的遗传连锁距离为2cM的AFLP标记，并命名为E-TG/M-CTC200(Wolukau et al.,2009)。但由于分子标记与抗病基因之间遗传距离较远，并且为传统的随机DNA分子标记，影响甜瓜抗蔓枯病高通量筛选鉴定。

上文中涉及的参考文献如下：

1.刘文睿,张永兵,周晓慧,陈劲枫.甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-1的分子标记及其与抗源PI420145中抗病基因的关系.中国瓜菜,2009,22(5):1-4。

2.王红英,钱春桃,娄丽娜,娄群峰,张永兵,伊鸿平,吴明珠,陈劲枫.甜瓜抗蔓枯病Gsb-4的分子标记.园艺学报,2012,39(3):574-580。

3.张永兵,陈劲枫,伊鸿平,钱春桃,吴明珠.甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-2的ISSR分子标记.果树学报,2011,28(2):296-300。

4.张学军,张永兵,张龑,王登明,伊鸿平.甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-3的ISSR分子标记.西北植物学报,2013,33(2):261-265。

5.Frantz,J.D.and M.M.Jahn.Five independent loci each controlmonogenic resistance to gummy stem blight in melon(Cucumis meloL.).Theoretical and Applied Genetics,2004,108:1033-1038(Frantz,J.D.and M.M.Jahn.甜瓜5个单基因蔓枯病抗性位点。Theoretical and Applied Genetics,2004,108:1033-1038)。

6.Mcgrath D J,Vawdrey L,Walker I O.Resistance to Gummy Stem Blight inMuskmelon.Hortscience,1993,28(9).(Mcgrath D J,Vawdrey L,Walker I O.甜瓜蔓枯病抗性.Hortscience,1993,28(9))。

7.Wolukau JN,Zhou X,Chen J.Identification of amplified fragmentlength polymorphism markers linked to gummy stem blight(Didymella bryoniae)resistance in melon(Cucumis melo L.)PI420145.Hortscience,2009,1(24):1189-90.(Wolukau JN,Zhou X,Chen J.甜瓜PI420145中与蔓枯病抗性连锁的AFLP标记.Hortscience,2009,1(24):1189-90)。

8.Wolukau JN,Zhou X,Li Y,Zhang Y,Chen J.Resistance to gummy stemblight in melon(Cucumis melo.L)germplasm and inheritance of resistance fromPlant Introduction 157076,420145and 323498.Hortscience,2007,42(2):215-221.(Wolukau JN,Zhou X,Li Y,Zhang Y,Chen J.甜瓜PI157076、PI420145和PI323498蔓枯病抗性鉴定与抗性遗传,Hortscience,2007,42(2):215-221.)。

9.Zuniga TL,Jantz JP,Zitter TA,Jahn MK.Monogenic dominant resistanceto gummy stem blight in two melon(Cucumis melo)accessions.Plant Disease,1999,83:1105-1107.(Zuniga TL,Jantz JP,Zitter TA,Jahn MK.两个甜瓜蔓枯病单基因显性抗性.Plant Disease,1999,83:1105-1107.)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是找到与甜瓜蔓枯病连锁的单核苷酸多态性标记，提供两种基于抗蔓枯病连锁基因开发的用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定的分子标记及其开发方法和用途。本发明所获得的分子标记为甜瓜蔓枯病抗性标记，能用于甜瓜蔓枯病抗性的辅助选择育种。

为了解决上述技术问题，本发明提供两种基于抗蔓枯病连锁的单核苷酸多态性(SNP)开发的用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定的分子标记，以甜瓜为物种，所述分子标记引物采用如下引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’，

CmGsbRS5：等位引物1：GGTGTAAGAATATGCTGCTTTCTCA

等位引物2：GTGTAAGAATATGCTGCTTTCTCG

通用引物：AAGAAACCAACGTCCAGCACTTGT

CmGsbRS6：等位引物1：CGTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAAT

等位引物2：GTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAAC

通用引物：GTCTCATTGTTTAATCACAAAAAGTAAGAT。

对应的标记位点如下表1所述。

表1

本发明还同时提供了上述分子标记的用途，用于鉴定甜瓜抗蔓枯病种质或其后代的辅助选择育种。即，用于甜瓜抗蔓枯病株系或其后代辅助选择育种。

具体为：

当筛选花皮梢瓜和雪里红的杂交和回交后代时，选择后代中基因型与抗病甜瓜花皮梢瓜基因型一致或者同时具有花皮梢瓜和雪里红基因型时的单株用于育种；

当筛选抗蔓枯病甜瓜种质时，选择种质中基因型与抗病甜瓜花皮梢瓜基因型一致或者同时具有花皮梢瓜和雪里红基因型时的种质用于育种。

注：该抗性为显性抗性，因此具有花皮梢瓜的基因型或者同时具有花皮梢瓜和雪里红基因型的单株都具有抗性。

本发明还提供了甜瓜蔓枯病抗性连锁的单核苷酸多态性鉴定方法，包括以下步骤：

1)、以抗蔓枯病甜瓜--花皮梢瓜与感蔓枯病甜瓜--雪里红为亲本进行杂交，然后自交，从而获得作为F₂代的抗/感病分离的单株；

2)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonnium Bromide)法提取甜瓜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；

3)、基于Illumina高通量测序平台(HiSeq2500)对F₂代150个个体进行基因组覆盖度2倍重测序；

4)、采用基因连锁图谱和关联分析方法定位与抗蔓枯病相关的区域或基因；

5)、鉴定到与甜瓜抗蔓枯病连锁的单核苷酸多态性序列。

本发明还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：

1)、以抗蔓枯病甜瓜花皮梢瓜与感蔓枯病甜瓜雪里红杂交，然后自交，获得作为F₂代群体，对与甜瓜抗蔓枯病连锁的单核苷酸多态性序列的遗传分离进行验证；

2)、以抗蔓枯病甜瓜花皮梢瓜作为抗病基因供体亲本与感蔓枯病甜瓜雪里红进行杂交和回交，从而获得作为后代的抗病甜瓜单株；

3)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonnium Bromide)法提取甜瓜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；

4)、采用KASP(竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，Kompetitive AlleleSpecific Polymerase Chain Reaction)方法进行抗蔓枯病标记的开发；

5)、开发出两个基于单核苷酸多态性的甜瓜抗蔓枯病分子标记。

与甜瓜抗蔓枯病有关的分子标记CmGsbRS5，具体采用下述方法获得：

1)、比较抗蔓枯病甜瓜花皮梢瓜与感蔓枯病甜瓜雪里红与抗性连锁区域的基因组序列，鉴定到抗蔓枯病甜瓜花皮梢瓜与感蔓枯病甜瓜雪里红与抗性连锁基因组区域存在SNP变异，即，通过测序检测出两亲本中抗性连锁基因组区域内部在分子标记限定的片段上存在差异；

2)、基于抗/感蔓枯病甜瓜中与抗性连锁基因组区域的SNP变异，设计引物；

3)、用CTAB法提取甜瓜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；

4)、采用KASP方法进行抗蔓枯病标记的筛选；

5)、开发出KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6，经相关性检测，发现其与甜瓜蔓枯病抗性连锁，采用该标记可以用来鉴定甜瓜蔓枯病抗性。

采用上述分子标记进行甜瓜蔓枯病抗性筛选的方法具体是：

(1)分子标记在蔓枯病抗/感花皮梢瓜和雪里红的多态性分析：

设计开发分子标记，每个分子标记由等位引物1、等位引物2、通用引物组成；用于检测花皮梢瓜和雪里红之间蔓枯病抗性的多态性。备注说明：引物(分子标记)可委托艾吉析科技(上海)有限公司合成，在ABI Setp One PCR仪上进行扩增。

PCR反应体系为：20-50ng/μl甜瓜基因组DNA5.0μl，KASP Master mix 5.0μl，KASPAssay Mix(10ng/μl FAM引物1、10ng/μl HEX引物2、10ug/μl通用引物，三种引物的体积比为12:12:30)0.14μl，总体积为10.14μl。

FAM引物1即为等位引物1、HEX引物2即为等位引物2。

反应程序：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸；以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；94℃，20秒(变性)，55℃60秒，继续扩增26个循环。扩增结束后，检测荧光信号并查看基因分型情况。

(2)分子标记在不同抗性的花皮梢瓜和雪里红间的SNP差异：

根据获得的分子标记，用于检测不同蔓枯病抗性的花皮梢瓜和雪里红间的SNP，根据荧光信号的不同，判断SNP的基因型。

(3)利用CmGsbRS5分子标记开展甜瓜抗蔓枯病辅助选择育种：

抗蔓枯病甜瓜供体花皮梢瓜与感病甜瓜雪里红进行杂交，然后以雪里红为轮回亲本通过回交、自交结合标记辅助选择，将花皮梢瓜的抗病基因导入到雪里红中，选择分离群体中基因型与花皮梢瓜基因型一致的单株用于育种改良，获得了若干份雪里红背景的含有花皮梢瓜抗病基因的材料，通过蔓枯病病菌源接种，发现其抗病性显著增加。

抗蔓枯病是甜瓜的重要性状，是高产的重要组成部分。本发明采用分子遗传学方法以含有抗病基因的花皮梢瓜为材料，开发了新的、稳定性好的能改良蔓枯病抗性的分子标记及其方法，用于甜瓜抗蔓枯病辅助选择育种。由于研究所用的材料抗病基因能提高甜瓜抗蔓枯病能力，其对我国甜瓜抗蔓枯病分子设计育种具有普遍性。

本发明创造了甜瓜抗蔓枯病基因连锁的的KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6。采用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需要周期长、抗病鉴定稳定性差等缺点，可以有目标地将花皮梢瓜的抗病基因在实验室内选择获得，并有目的地进行多个抗病基因的聚合，而从培育出具有抗多种病害的甜瓜新品种。在本发明中，当后代植株中检测到具有花皮梢瓜基因型时或者同时出现花皮梢瓜和雪里红基因型时，我们判定其属于抗蔓枯病甜瓜，当后代植株中检测到具有雪里红的基因型，我们判定其属于感病甜瓜。

本发明可适用于大部分的甜瓜抗蔓枯病的标记选择。

因此，本发明结果在甜瓜抗蔓枯病育种实践中具有重要意义；其优点具体归纳如下：

(1)本发明的能实现甜瓜抗蔓枯病分子标记，是通过含有抗病基因的甜瓜花皮梢瓜与感病甜瓜雪里红遗传分离群体获得，并在杂交、回交和自交中筛选中应用，能显著提高蔓枯病抗性，而且稳定遗传，可用于蔓枯病抗性的辅助选择育种。

(2)本发明依据的是与甜瓜抗蔓枯病基因紧密连锁的的核苷酸序列开发而来的KASP标记，极大提高了辅助选的效率和效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是抗病甜瓜花皮梢瓜、感病甜瓜雪里红、花皮梢瓜和雪里红蔓杂交F1蔓枯病侵染后感病症状；

图2是基于单核苷酸多态性的抗病基因在染色体上的定位。

图3是KASP标记CmGsbRS5在花皮梢瓜、雪里红和F1中的基因型图，其中花皮梢瓜抗病基因型为AA、雪里红感病基因型为GG、F1基因型为AG。

图4是KASP标记CmGsbRS5在花皮梢瓜和雪里红F2群体中的遗传分析，其中抗病基因型为AA、感病基因型为GG、杂合基因型为AG，NO CALL表示样品没有荧光信号。

根据该图4，我们能得知：KASP标记CmGsbRS5在F2群体中发生分离，且分离比例符合单基因隐性性状3:1的分离规律，表明KASP标记CmGsbRS5与蔓枯病抗性连锁。

图5是采用KASP标记CmGsbRS5在花皮梢瓜和雪里红杂交和回交后代中抗性基因型鉴定，其中抗病基因型为AA、感病基因型为GG、杂合基因型为AG。

图6是KASP标记CmGsbRS6在花皮梢瓜、雪里红和F1中的基因型图，其中花皮梢瓜抗病基因型为TT、雪里红感病基因型为CC、F1基因型为TC。

图7是KASP标记CmGsbRS6在花皮梢瓜和雪里红F2群体中的遗传分析，其中抗病基因型为TT、感病基因型为CC、杂合基因型为TC，NO CALL表示样品没有荧光信号。

根据该图7，我们能得知：KASP标记CmGsbRS6在F2群体中发生分离，且分离比例符合单基因隐性性状3:1的分离规律，表明KASP标记CmGsbRS6与蔓枯病抗性连锁。

图8是采用KASP标记CmGsbRS6在花皮梢瓜和雪里红杂交和回交后代中抗性基因型鉴定，其中抗病基因型为TT、感病基因型为CC、杂合基因型为TC。

具体实施方式

实施例1、花皮梢瓜和雪里红蔓枯病抗性鉴定

具体做法是：从实验室种质资源库中选取甜瓜材料---花皮梢瓜、雪里红、花皮梢瓜和雪里红杂交F1后代，甜瓜蔓枯病病原菌接种，采用植株表型症状判定抗性。如图1。

一、甜瓜蔓枯病病原菌接种：

1)、蔓枯病病原菌培养

PDA培养基的配置：取马铃薯粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂粉20.0g，磷酸二氢铵2.0g，氯霉素0.1g。将上述成分用蒸馏水溶解并定容到1L，并用NaOH或HCl将PH调到6，高温高压灭菌20min。

蔓枯病菌的活化：从超低温冰箱中将在甘油中保存的菌株取出，在超净工作台上将菌株接种到PDA培养基上，放在25℃的培养箱中黑暗条件下培养一周。

蔓枯病菌株的扩繁：将长满蔓枯病菌的培养基用灭菌后的小刀切成小块，然后用灭菌后的镊子将小块接种到新的培养基上，然后放在25℃的培养箱中黑暗培养一周，实现蔓枯病的扩繁。

蔓枯病分生孢子的诱导：将黑暗条件下培养一周的甜瓜蔓枯病病菌在25℃的培养箱中12h紫外灯/12h黑暗周期下处理4天，就会有大量分生孢子产生。

2)、蔓枯病病原菌接种甜瓜

接种前的准备：将长满分生孢子的蔓枯病培养基加入5-10ml的无菌水，然后用干净的药匙轻轻的刮取培养基的表面，并将液体导入50ml的无菌塑料管中，并再加入少量的蒸馏水进行冲洗。并对该液体用滤纸进行过滤，过滤后得到的即为甜瓜蔓枯病分生孢子悬浮液。利用血球计数板计算悬浮液中分生孢子的浓度，并将分生孢子悬浮液稀释到500000个孢子/ml。用乳酸将PH值调节到4，并在每升悬浮液中加20滴(约1ml)表面活性剂吐温20，吐温20是一种表面活性剂，可以帮助蔓枯病分生孢子更好的侵染甜瓜植株。

苗期接种：待甜瓜苗长到4-6片真叶时对其进行接种，用喷雾器对甜瓜的叶片喷洒分生孢子悬浮液，喷到甜瓜叶片开始滴水为止。接种后用加湿器对植株进行加湿，并用塑料覆盖来保湿。接种后的三天内保持空气湿度在90％以上，温度在25度左右。接种后两到三周根据甜瓜抗蔓枯病等级划分标准来对甜瓜植株的抗病等级进行调查统计。

二、植株发病症状观察

接种后21天根据甜瓜抗蔓枯病等级划分标准来对甜瓜植株的抗病等级进行调查统计。

茎部发病情况如下：

0级：无伤害；

1级：单个病斑长1-10mm，或者多个病斑总长1-20mm，但没有环茎一周；

2级：病斑长21-80mm，或者环茎1周；

3级：植株萎蔫；

4级：植株死亡。

茎部病级0级和1级为抗病，2-4级为感病。

根据图1，蔓枯病病原菌接种21天后，花皮梢瓜几乎不发病或叶片上只有零星点的病斑，表现出对蔓枯病具有很强的抗性，雪里红植株全部萎蔫甚至死亡，表现出对蔓枯病高度敏感；同时在花皮梢瓜和雪里红杂交F1代中，F1植株几乎没发病或叶片只有零星点病斑，表现出对蔓枯病有很好的抗性，该甜瓜抗蔓枯病表现为显性遗传。

实施例2、甜瓜蔓枯病抗性遗传分析与基因定位：

从实验室种质资源库中选取甜瓜材料---花皮梢瓜、雪里红、花皮梢瓜和雪里红杂交F1后代以及F1自交获得的F2群体，甜瓜蔓枯病病原菌接种，采用植株表型症状判定抗性，进行抗病性遗传分析。然后基于高通量重测序方法进行抗病基因定位，如图2。

抗性遗传分析：采用实施例1中蔓枯病接种方法对F2群体的219个单株进行接种，根据表型判定抗性情况，F2群体对甜瓜蔓枯病的抗病性会发生分离，其中抗病植物165株，感病植株54株，抗病植株数：甜瓜感病植株数＝3:1，表明该甜瓜的抗蔓枯病性状是由显性单基因控制。

抗性基因定位：

一、提取DNA

1)、DNA提取

DNA提取可选择天根生化科技(北京)有限公司生产的植物总DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)。

①、称取0.1g上述甜瓜叶片用液氮研磨成粉状，然后参照DNA提取试剂盒提供的操作步骤提取总DNA。

②、采用Nanodrop2000超微量分光光度计检测上述所得的DNA样品浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

二、F2群体单株重测序

利用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台对花皮梢瓜、雪里蕻及F2群体150个单株(从F2群体中随机挑选)，按照标准方法进行重测序，花皮梢瓜、雪里蕻及F2群体150个单株共获得12.94Gbp、13.14Gbp和217.70Gbp的测序数据，花皮梢瓜和雪里蕻测序数量覆盖基因组26×，染色体覆盖度为96.96％和97.68％，F2群体单株平均深度为2×，染色体覆盖度为84.48％。

利用GATK软件工具包(Depristo et al.，2011)对样品中的SNP进行检测，获得高质量的单核苷酸多态性(SNP)标记1,188,159个，通过两两标签之间计算MLOD值，将标记分为12个连锁群。

三、抗性基因定位

将甜瓜150株F2群体抗蔓枯病的表型数据与12个连锁群图谱和分型数据相结合，进行质量性状的关联分析，对甜瓜蔓枯病抗性基因进行定位。采用软件rQTL的用区间作图法，利用最大似然法对相邻标记构成的区间内任意一点可能存在的QTL进行似然比检测，进而获得其效应的极大似然估计。最大似然数估计超过一定阈值的区域即为目标区域。共获得1个与甜瓜蔓枯病抗性相关的关联区域。该区域位于甜瓜4号染色体CM3.5_scaffold00018约106kb的区间上，根据甜瓜基因组数据库对该关联区域的基因功能注释可知该关联区域共包括8个基因。这8个基因根据基因组分别是MELO3C012986、MELO3C012987、MELO3C012988、MELO3C012989、MELO3C012990、MELO3C012991、MELO3C012991、MELO3C012993，本发明的2个分子标记对应的基因是MELO3C012993。

实施例3、用KASP标记CmGsbRS5的开发与验证

具体做法是：从实验室种质资源库中选取甜瓜材料---花皮梢瓜、雪里红、花皮梢瓜和雪里红杂交F1后代以及F1自交获得的F2群体，首先将SNP转化为KASP标记，利用引物KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6扩增鉴定其基因型和遗传分离规律。

1、KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6的开发：

一、SNP信息提取：

根据实施例2中基因定位结果，提取与抗病基因紧密连锁的SNP信息。

二、提取DNA

提取花皮梢瓜、雪里红、花皮梢瓜和雪里红杂交F1后代基因组DNA，方法同实施例2。

三、PCR扩增

1)、反应体系

引物序列为如下的任一：

CmGsbRS5：等位引物1：GGTGTAAGAATATGCTGCTTTCTCA

等位引物2：GTGTAAGAATATGCTGCTTTCTCG

通用引物：AAGAAACCAACGTCCAGCACTTGT

CmGsbRS6：等位引物1：CGTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAAT

等位引物2：GTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAAC

通用引物：GTCTCATTGTTTAATCACAAAAAGTAAGAT。

PCR反应体系为：20-50ng/μl甜瓜基因组DNA5.0μl，KASP Master mix 5.0μl，KASPAssay Mix(10ng/μl FAM引物1、10ng/μl HEX引物2、10ug/μl通用引物，三种引物的体积比为12:12:30)0.14μl，总体积为10.14μl。

2)、反应程序

94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸；以touchdown程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；94℃，20秒(变性)，55℃60秒，继续扩增26个循环。扩增结束后，检测荧光信号并查看基因分型情况。

直接在ABI Step One荧光定量PCR仪上进行PCR反应，所述PCR仪连接ABI StepOne软件，从而直接获得分析结果，即，软件自动将检测样品按照不同的基因型分成纯合抗病型，纯合感病型和杂合抗病型。

等位引物1、等位引物2前分别设置各自的荧光接头(为不同颜色)，如果检测的材料是纯合型时，扩增的时候只会选其中对应的一个引物扩增(例如，花皮梢瓜只能与等位引物1发生反应)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是纯合抗病型还是纯合感病型，如果检测的材料是杂合型的，扩增时2个引物都会被用到，产生的荧光不同于纯合型的材料，从而实现区分杂合型。

根据图3，我们得出结论利用CmGsbRS5引物对分别从花皮梢瓜和雪里红基因组中检测到基因型为AA和GG，在花皮梢瓜和雪里红杂交F1后代中检测到基因型为AG。由此表明，KASP分子标记CmGsbRS5能用于花皮梢瓜和雪里红之间及其后代的基因型鉴定。

根据图6，我们得出结论利用CmGsbRS6引物对分别从花皮梢瓜和雪里红基因组中检测到基因型为TT和CC，在花皮梢瓜和雪里红杂交F1后代中检测到基因型为TC。由此表明，KASP分子标记CmGsbRS6能用于花皮梢瓜和雪里红之间及其后代的基因型鉴定。

2、KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6的验证：

一、提取DNA

提取花皮梢瓜和雪里红杂交后自交获得F2后代107个单株的基因组DNA，方法同实施例2。

二、PCR扩增

同上。

根据图4，我们得出结论利用CmGsbRS5引物对分别从花皮梢瓜和雪里红杂交后自交获得F2后代基因组中检测到AA、GG和AG基因型，三种基因型为20:47:41，与抗性表型基本吻合，基本符合单基因显性遗传规律1:2:1。由此验证KASP分子标记CmGsbRS5与甜瓜蔓枯病抗性紧密连锁。

将上述分别为AA、GG和AG基因型的F2后代进行种植至四叶一心期后，进行蔓枯病抗性鉴定，所得结果为：

鉴定为AA型的，抗性鉴定结果全部为抗蔓枯病；

鉴定为GG型的，抗性鉴定结果全部为感蔓枯病；

鉴定为AG型的，抗性鉴定结果全部为抗蔓枯病；

因此，可证明分子标记CmGsbRS5的正确性。

根据图8，我们得出结论利用CmGsbRS6引物对分别从花皮梢瓜和雪里红杂交后自交获得F2后代基因组中检测到TT、TC和CC基因型，三种基因型为20:47:41，与抗性表型基本吻合，基本符合单基因显性遗传规律1:2:1。由此验证KASP分子标记CmGsbRS6与甜瓜蔓枯病抗性紧密连锁。

将上述分别为TT、TC和CC基因型的F2后代进行种植至四叶一心期后，进行蔓枯病抗性鉴定，所得结果为：

鉴定为TT型的，抗性鉴定结果全部为抗蔓枯病；

鉴定为TC型的，抗性鉴定结果全部为感蔓枯病；

鉴定为CC型的，抗性鉴定结果全部为抗蔓枯病；

因此，可证明分子标记CmGsbRS6的正确性。

实施例4、用KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6开展甜瓜抗蔓枯病辅助选择育种

具体做法是：对花皮梢瓜和雪里红杂交，然后采用雪里红为轮回亲本进行回交，获得回交后代分离群体，采用KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6进行标记辅助选择，如图5、图8所示，回交后代中选择基因型与花皮梢瓜一致或者同时出现花皮梢瓜和雪里红基因型时的单株进一步用于育种改良。

一、提取DNA

同实施例2。

二、PCR扩增

同实施例3。

三、基因型检测

同实施例3。

四、KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6开展甜瓜抗蔓枯病病的辅助选择育种

抗蔓枯病甜瓜种质花皮梢瓜与感病甜瓜种质雪里红进行杂交，然后采用雪里红为轮回亲本持续进行回交，结合KASP标记CmGsbRS5、CmGsbRS6的辅助选择。在回交后代群体中，选择基因型与花皮梢瓜一致或者同时出现花皮梢瓜和雪里红基因型时的单株，即为抗病种质，淘汰基因型与雪里红一致个体(图5，图8)。

具体如下：

当选用KASP标记CmGsbRS5时：

在回交第8代群体中，共获得纯合抗病基因型AA种质为33个，杂合抗病基因型AG种质为18个，纯合感病基因型GG种质为66个。

将上述鉴定为纯合抗病基因型AA种质种植至四叶一心期后，进行蔓枯病抗性鉴定，所得结果全部为抗蔓枯病。

因此，可证明分子标记CmGsbRS5的正确性。

当选用KASP标记CmGsbRS6时：

在回交第8代群体中，共获得纯合抗病基因型TT种质为33个，杂合抗病基因型TC种质为18个，纯合感病基因型CC种质为66个。

将上述鉴定为纯合抗病基因型TT种质种植至四叶一心期后，进行蔓枯病抗性鉴定，所得结果全部为抗蔓枯病。

因此，可证明分子标记CmGsbRS6的正确性。

发明人在发明过程中还使用过与本发明的分子标记CmGsbRS5、CmGsbRS6序列接近的其余分子标记；但是会导致判定结果出现偏差，即，导致判定结果准确度的下降。

最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变性。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 两种基于抗蔓枯病连锁基因开发的用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定的分子标记及其用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtgtaagaa tatgctgctt tctca 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtaagaat atgctgcttt ctcg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagaaaccaa cgtccagcac ttgt 24

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgttggtttc ttttattttt agttaacaat 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttggtttct tttattttta gttaacaac 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtctcattgt ttaatcacaa aaagtaagat 30

Claims (3)

1.两种基于抗蔓枯病连锁的单核苷酸多态性开发的用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定的分子标记，以甜瓜为物种，其特征是：为分子标记CmGsbRS5、CmGsbRS6中的任意一个；分子标记引物采用如下引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’，

CmGsbRS5：等位引物1：GGTGTAAGAATATGCTGCTTTCTCA

等位引物2：GTGTAAGAATATGCTGCTTTCTCG

通用引物：AAGAAACCAACGTCCAGCACTTGT

CmGsbRS6：等位引物1：CGTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAAT

等位引物2：GTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAAC

通用引物：GTCTCATTGTTTAATCACAAAAAGTAAGAT；

分子标记CmGsbRS5为：

TTAAATCTGACGATCATGTCAACATCATATTGTTCTACAGTTTGGACTTTTTCAAAGGACTAATCAAGAGCAAGTTGGTGTAAGAATATGCTGCTTTCTC[A/G]CTTTGCAACAAGTGCTGGACGTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAAYTCTCTGTTTCGAACGTTGAGGAA[AG]AGAGAAATATATCTTACTTTTTGTGAT；

分子标记CmGsbRS6为：

TTTCAAAGGACTAATCAAGAGCAAGTTGGTGTAAGAATATGCTGCTTTCTCRCTTTGCAACAAGTGCTGGACGTTGGTTTCTTTTATTTTTAGTTAACAA[T/C]TCTCTGTTTCGAACGTTGAGGAA[AG]AGAGAAATATATCTTACTTTTTGTGATTAAACAATGAGACCTCAATTTAATTTGTAAATATTATTTTTCTCTRAAC。

2.如权利要求1所述的分子标记的用途，其特征是：用于鉴定甜瓜抗蔓枯病种质或其后代的辅助选择育种。

3.根据权利要求1所述的分子标记的用途，其特征是：

当筛选花皮梢瓜和雪里红的杂交和回交后代时，选择后代中基因型与抗病甜瓜花皮梢瓜基因型一致或者同时具有花皮梢瓜和雪里红基因型时的单株用于育种；

当筛选抗蔓枯病甜瓜种质时，选择种质中基因型与抗病甜瓜花皮梢瓜基因型一致或者同时具有花皮梢瓜和雪里红基因型时的种质用于育种。

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